專利名稱：鴕鳥血及其相關(guān)制品的活性功能的制作方法
鴕鳥飼養(yǎng)繁殖在我國大體上有三種來源，有非洲鴕鳥、歐美鴕鳥和澳洲鴕鳥；其中以非洲鴕鳥高大、兇猛彪悍，歐美、澳洲鴕鳥相對(duì)要小一些，但性情稍溫和，它們具備修長強(qiáng)悍的大腿肌肉，其奔跑時(shí)速高達(dá)70～90Km，證明鴕鳥的血液存在特殊的酶使肌肉與血液中瞬間釋放出巨大的能量。本發(fā)明中所使用的鴕鳥為歐美、澳洲鴕鳥。
鴕鳥全身都是寶，但在世界范圍對(duì)鴕鳥血液尚無利用的先例和報(bào)道，一頭成年鴕鳥宰殺后可產(chǎn)生10立升血，卻被鴕鳥養(yǎng)殖場白白浪費(fèi)，還要交納排污費(fèi)。一個(gè)中型養(yǎng)殖場每年宰殺600～700頭，大約每年白白浪費(fèi)6500立升鴕鳥血。
本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)鴕鳥血具有抗疲勞、抗缺氧、抗低溫、抗高溫、壯陽(亦稱助陽藥)、抗癌的功能，現(xiàn)將鴕鳥血液的制備及其復(fù)合配方(簡稱復(fù)方)的活性功能，抗疲勞實(shí)驗(yàn)及其質(zhì)量指標(biāo)、21種氨基酸含量分別敘述于后1、鴕鳥血液的制備1.1實(shí)施例1 取12升鮮鴕鳥血(ostrich blood，縮寫OB)將凝血塊用慢速攪拌機(jī)打碎，置于冰凍干燥機(jī)中，降溫至-40℃，迅速升溫同時(shí)減壓0.095MPa，升至0℃破細(xì)胞壁，蒸除大量水分，得2.16Kg凍干粉TOB(簡稱Total ostrich blood，縮寫TOB，即鴕鳥全血)，收率為18％，粉碎過60目篩網(wǎng)，包裝1Kg/袋。(見附


圖1)1.2實(shí)施例2 向10升(約10kg)雄性鴕鳥血中加入0.1％檸檬酸鈉抗凝劑在3000轉(zhuǎn)/分離心機(jī)離心10分鐘后，分出血清(45％，約4.5kg)、血漿(55％，約5.5kg)，分別將血清、血漿注入透析袋，透析除去檸檬酸鈉，血清按上述操作(同實(shí)施例1，附
圖1)冰凍干燥，得0.81kg血清凍干粉(serum)，得率18.0％。將5.5kg血漿用慢速勻漿后注入水解罐，加入木瓜蛋白酶27.5-55g(相當(dāng)于血漿的0.05％)，保溫在50-55℃，PH＝6.8-7.5，保溫1H，降溫至45-50℃，加入胰蛋白酶5.5g(相當(dāng)于血漿的0.1％)和枯草桿菌蛋白酶2.75g(相當(dāng)于血漿的0.05％)，再在45-50℃保溫4H后，將水解液在水解罐夾套水浴50-60℃條件下，減壓濃縮(0.098Mpa)，濃縮至含水量≤3％，粉碎過100目，多肽干粉(polypeptide dry powder，縮寫為PPDP)，得產(chǎn)品0.9625kg，得率17.5％。將多肽干粉(PPDP)包裝500g/袋。進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)將serum與PPDP等量混合加生理鹽水溶解，簡稱SPPDP。(見附圖2)1.3實(shí)施例3 復(fù)方1(簡稱No.1)TOB400mg、燕子掌提取物200mg、西洋參提取物200mg、桑椹子提取物200mg。
1.4實(shí)施例4 復(fù)方2(簡稱No.2)TOB 400mg、干花豆提取物200mg、西洋參提取物200mg、淫羊霍提取物200mg。
1.5實(shí)施例5 復(fù)方3(簡稱No.3)TOB 400mg、枸杞子提取物200mg、西洋參提取物200mg、螺旋藻粉200mg。
2、實(shí)驗(yàn)材料2.1 原料將No.1、No.2、No.3再粉碎后在乳缽內(nèi)充分研細(xì)，加生理鹽水配制成均勻的混懸液供灌胃用。
2.2 動(dòng)物ICR小鼠，體重18-22g、SD大鼠，體重120-150g，均由北京大學(xué)動(dòng)物學(xué)部提供。經(jīng)口服方式給藥。
3、方法與結(jié)果3.1 抗疲勞實(shí)驗(yàn)取ICR種雄性小鼠120只，體重18～22g，隨機(jī)分為6組，每組20只，對(duì)照組灌服等量生理鹽水，劑量組均根據(jù)推薦的人體每公斤體重日攝入量，擴(kuò)大10倍作為劑量組，連續(xù)給予受試物30天，末次給予受試物30min后，置小鼠在游泳箱中游泳，水深不少于30cm，水溫25±0.5℃，鼠尾根部負(fù)重5％體重的鉛皮，記錄小鼠自游泳開始至死亡時(shí)間，作為小鼠游泳時(shí)間(min)，結(jié)果見表3-1。
表3-1 TOB、SPPOP、No.1、No.2、No.3對(duì)抗疲勞的影響(x±SD)
*P＜0.01**P＜0.001 均與對(duì)照組比較3.2 抗缺氧實(shí)驗(yàn)雄性小鼠120只，體重18～22g，隨機(jī)分為6組，每組20只，給藥組灌服上述劑量的TOB(凍干粉)，No.1、No.2、No.3；對(duì)照組灌服等量生理鹽水，30min后將小鼠分別放入盛有鈉石灰的125ml密閉廣口瓶中，記錄小鼠死亡時(shí)間，結(jié)果見表3-2。TOB(凍干粉)在常壓條件下可明顯延長小鼠在缺氧條件下的存活時(shí)間。
表3-2 TOB、SPPOP、No.1、No.2、No.3對(duì)缺氧小鼠生存時(shí)間的影響(x±SD)
*與對(duì)照組比較P＜0.013.3 抗低溫實(shí)驗(yàn)雄性小鼠60只，體重18～22g，隨機(jī)分為3組，每組20只，給藥的二組每天灌服上述劑量的TOB，SPPDP(TOB，SPPDP組均為正常人用量10倍)，對(duì)照組灌服等量生理鹽水，連續(xù)10d，末次給藥后0.5h，放入-4～-0.5℃冰箱內(nèi)，每隔15min觀察一次，直至死亡。計(jì)算動(dòng)物的平均存活時(shí)間，結(jié)果見表3-3。小鼠灌服TOB，SPPDP后在寒冷環(huán)境下能延長存活時(shí)間，說明它具有抗寒耐凍的作用。
表3-3 TOB，SPPDP對(duì)低溫條件下小鼠生存時(shí)間的影響(x±SD)
*與對(duì)照組比較P＜0.013.4 抗高溫實(shí)驗(yàn)雄性大鼠45只，體重120～150g，隨機(jī)分為3組，每組15只，用藥前先測定正常體溫。給藥的二組分別灌服TOB，SPPDP均為10mg/kg，對(duì)照組灌服等量生理鹽水。30min后將動(dòng)物放入45±2℃的恒溫箱中，20min后取出，重新測溫一次，記錄溫差，結(jié)果見表3-4。灌服TOB(干粉)的大鼠體溫升高值比對(duì)照組低，顯示應(yīng)用TOB，SPPDP后SD大鼠抗高溫能力增強(qiáng)。
表3-4 TOB，SPPDP對(duì)大鼠高溫能力的影響(x±SD)
*P＜0.05**P＜0.01均與對(duì)照組比較3.5 對(duì)“陽虛”小鼠的治療作用“陽虛”模型的制造，(參照文獻(xiàn)《中藥藥理研究方法學(xué)》陳奇主編 P982-984)。ICR種雄性小鼠105只，體重18～22g，隨機(jī)分為7組，每組15只，“陽虛”組每天灌服375mg/kg羥基脲，兩組除每天給予羥基脲外，每天分別均加服TOB10mg/kg，SPPOP、No.1、No.2、No.3各25mg/kg，正常對(duì)照組給予等量的生理鹽水，每天灌胃給藥1次，共計(jì)14d，觀察動(dòng)物死亡情況、體重變化，并取小鼠脾臟、睪丸反復(fù)沖洗后，用濾紙吸干，濕組織稱重。比較各組織間差異，結(jié)果見表3-5?！瓣柼摗苯M15只動(dòng)物中有2只死亡，體重及脾臟、睪丸的重量減輕，與正常對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.01)。給予TOB、SPPOP、No.1、No.2、No.3 14d，動(dòng)物無死亡，動(dòng)物體重及脾臟、睪丸重量與正常對(duì)照組相近，與“陽虛”組比較差異顯著(P＜0.05)，說明TOB、SPPOP、No.1、No.2、No.3對(duì)羥基脲所造成的“陽虛”小鼠有明顯的治療作用。
表3-5 TOB、SPPOP、No.1、No.2、No.3對(duì)陽虛小鼠體重、脾臟、睪丸重量的影響(x±SD)
與正常對(duì)照組比較**P＜0.01，與“陽虛”組比較#P＜0.053.6 急性毒性試驗(yàn)健康小鼠40只，雌雄各半，體重18～22g，取TOB12g充分研細(xì)，加生理鹽水配制成均勻的混懸液40ml，每只鼠灌胃1ml(即12000mg/40ml＝300mg/ml/20g/日，推出300×50mg/20×50g＝15g/kg，加上復(fù)方300mg，即最大濃度為600mg/ml/20g，30g/kg，相當(dāng)于臨床600倍)，給藥后每天觀察動(dòng)物情況，共觀察7d，未發(fā)現(xiàn)任何異常表現(xiàn)，動(dòng)物全部存活。無毒副作用。
3.7 亞急性毒性試驗(yàn)大鼠40只，雌雄各半，體重120～150g，隨機(jī)分為4組，即3個(gè)給藥組，分別灌服TOB0.5、1和2g/kg，和另一個(gè)對(duì)照組(灌服等量的生理鹽水)。每天灌胃給藥1次，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行60d。給藥前、給藥期間及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別稱量體重，檢查血、尿常規(guī)、肝、腎功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)解剖動(dòng)物，取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胃、腸、腦及生殖腺等組織進(jìn)行內(nèi)服及組織形態(tài)學(xué)檢查。結(jié)果表明，TOB、SPPDP、No.1、No.2、No.3對(duì)大鼠的生長、血、尿常規(guī)檢查，肝、腎功能及心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胃、腸、腦及生殖腺等均無影響。
4、抗癌活性試驗(yàn)4.1 體外抗癌活性試驗(yàn)表皮癌A431，人胃癌細(xì)胞(BGC-823)和人結(jié)腸癌(HCT)細(xì)胞，由北京市腫瘤研究所提供。該化合物篩選測試由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采用MTT比色法進(jìn)行。
其具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下4.11 實(shí)驗(yàn)方法四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法基本原理MTT進(jìn)入細(xì)胞后作為反應(yīng)底物，被氧化形成藍(lán)色的甲瓚(Formazan)，沉積于細(xì)胞內(nèi)或周圍，用酶標(biāo)光度計(jì)直接測定各孔的OD值，即可反應(yīng)甲瓚的量，由此判斷細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化酶活性，亦可間接反應(yīng)細(xì)胞的增殖水平。
試劑MTT[3-(4，5-dimethylthiazal-2yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide]用含0.5％葡萄糖的磷酸緩沖液(0.02mol/L，PH7.2)配成1mg/ml使用液，4℃避光保存。
酸化異丙醇，含0.04mol/L，HCI的異丙醇。
實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞株BGC-823(人胃癌細(xì)胞)、HCT(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、皮癌A431，NFC(正常成人纖維細(xì)胞)4.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞生長抑制率(％)
初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的藥液(1-5％)對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的BGC-823、皮癌A431和HCT細(xì)胞的生長都有不同程度的抑制作用，而對(duì)正常成人纖維細(xì)胞(NFC)的生長則無明顯影響，該TOB(鴕鳥全血凍干粉)確有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值。
測試表明，TOB凍干粉無任何毒副作用，對(duì)人胃癌細(xì)胞(BGC-823)和人結(jié)腸癌(HCT)細(xì)胞抑瘤率分別為41.39％和28.24％。對(duì)表皮癌A431抑瘤率為47.21％，具良好抗癌活性。
4.2 體內(nèi)抑制腫瘤實(shí)驗(yàn)4.2.1 抑制動(dòng)物體內(nèi)S180腫瘤生長
30只小鼠，雌雄各半，皮下接種0.2ml/只(相當(dāng)于300萬細(xì)胞)S180實(shí)體瘤勻漿液(1∶4)，接種后第2天，分3組，空白對(duì)照，人參對(duì)照和TOB組，按實(shí)驗(yàn)2.2方式給藥。連續(xù)9d后，處死動(dòng)物，摘取實(shí)體瘤稱重并計(jì)算抑制生長率。結(jié)果見表4-1，TOB抑制移植性動(dòng)物體內(nèi)S180腫瘤生長效果明顯。
表4-1 TOB抑制S180腫瘤生長的作用
5、No.1 No.2 No.3的抗疲勞試驗(yàn)采用3.1小鼠游泳法，取40只ICR雄性小鼠，20只雌性小鼠，小鼠尾部不負(fù)重，余同前。結(jié)果見表5-1。
表5-1 No.1、No.2、No.3、偉力邦對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響比較(x±SD)
與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01注中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)的抗疲勞保健食品。
6、No.1 No.2 No.3、偉哥(注)的壯陽人群試驗(yàn)正常與異常(陽虛)人群各選擇男性10人，分成4組，口服6天結(jié)果以+，-表示有無作用，或加快、升高等表示。見表6-1。
注美國輝瑞藥業(yè)發(fā)明的壯陽藥品。
表6-1 No.1、No.2、No.3、偉哥的壯陽人群試驗(yàn)
7、試驗(yàn)結(jié)果討論7.1 壯陽藥的藥理作用十分廣泛，TOB、SPPDP加上西洋參、枸杞子、淫羊霍等單味藥的藥理已有大量的研究和論述，復(fù)方的藥理作用與單味藥的藥理基本相似，但由于各藥之間的配伍協(xié)同關(guān)系，復(fù)方的作用應(yīng)是各藥效應(yīng)的總的體現(xiàn)，故使得其藥理活性更顯廣泛，作用也更為明顯，本實(shí)驗(yàn)也說明了這一點(diǎn)。
7.2 中醫(yī)認(rèn)為“陽虛”的主要臨床表現(xiàn)是畏寒喜暖、四肢不溫或厥逆、小便清長、脈細(xì)、舌淡胖等。動(dòng)物應(yīng)用羥基脲后出現(xiàn)蜷縮、活動(dòng)遲緩等“陽虛”表現(xiàn)，特別是免疫抑制現(xiàn)象和臨床上“陽虛”病人表現(xiàn)的免疫功能低下基本一致，同時(shí)有人也發(fā)現(xiàn)“陽虛”動(dòng)物的這種表現(xiàn)與核酸代謝，尤其是與DNA代謝低下有關(guān)，因此，我們認(rèn)為應(yīng)用能夠明顯影響核酸代謝的羥基脲制造“陽虛”模型，較為切合臨床實(shí)際。
7.3 從表5-1可見，配以雄性血、No.1和No.3，抗疲勞效果高于雌性血，大約是偉力邦抗疲勞效果的2.15倍。
7.4 從表6-1可見，大劑量做人群實(shí)驗(yàn)無任何毒副作用，偉哥和配以雄性血的No.1 No.2和No.3，抗疲勞效果高于雌性血，大約是偉力邦抗疲勞效果的2.15倍。
7.5 TOB(鴕鳥全血凍干粉)與SPPDP有效成分均高效活性蛋白質(zhì)，但SPPDP由等量血清與經(jīng)復(fù)合酶水解血漿蛋白形成多肽組成，血清中含全血中各種免疫球蛋白及多種活性因子，而活性多肽極易被動(dòng)物、人的機(jī)體所吸收，因此從上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可見用TOB復(fù)合配方和用SPPDP復(fù)合配方比較，后者作用更快更強(qiáng)一些。
7.6 TOB、SPPDP的復(fù)方配合劑中主要作用是鴕鳥全血凍干粉與等量血清跟經(jīng)復(fù)合酶將血漿蛋白水解成活性多肽的混合體，而復(fù)方配合劑只起增強(qiáng)和協(xié)同作用。
8、TOB成分分析(見表1)表1TOB成分分析
9、鴕鳥血粉中氨基酸的檢測結(jié)果(見表2)表2鴕鳥血粉中氨基酸的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)的鴕鳥全血凍干粉(TOB)和等量血清跟血漿經(jīng)復(fù)合酶在特定PH和溫度下將血漿量白水解成多肽的混合體(SPPDP)具有抗疲勞、抗缺氧、抗高寒、抗高溫、抗癌、壯陽等用途；；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，復(fù)合酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白質(zhì)三種，特定PH在6.8-7.5之間，溫度為45-55℃，各種酶的用量為0.05-1.0％；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，TOB、SPPDP中均含有活性蛋白與活性多肽，活性蛋白均高達(dá)91.6％，富含21種氨基酸(見表2)，SPPDP含活性多肽極易被人體、動(dòng)物體所吸收；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述，抗疲勞、抗缺氧、抗高寒、抗高溫等應(yīng)激功能，按急性毒性與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)劑量為100∽240mg/人/日；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，按急性毒性與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量，臨床抗癌劑量為300∽600mg/人/日，壯陽劑量為260∽300mg/人/日；
6.本發(fā)明的復(fù)方配合劑可用TOB與其他配合劑復(fù)配成NO.1；NO.2；NO.3。也可用SPPDP與TOB的配合劑依次復(fù)配成NO.4；NO.5；NO.6，起主導(dǎo)作用的是SPPDP和TOB，而其他配合劑只起增強(qiáng)與協(xié)同作用；
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述，加入復(fù)方配合劑為純TOB、純SPPDP，例如NO.1；NO.2；NO.3見實(shí)施例3-5；而SPPDP復(fù)方配合劑，例如NO.4SPPDP400mg、燕子掌粉200mg、西洋參200mg、桑椹子200mg；NO.5SPPDP400mg、干花豆200mg、西洋參200mg、淫羊霍200mg；NO.6SPPDP400mg、枸杞子200mg、西洋參200mg、螺旋藻粉200mg。
全文摘要
本發(fā)明的鴕鳥全血凍干粉(簡稱TOB干粉)涉及肉制品、保健食品、醫(yī)藥品的領(lǐng)域。鴕鳥血不僅是含有21種氨基酸的高蛋白食品，而且又是一種新型抗疲勞的營養(yǎng)補(bǔ)劑，并有抗缺氧、抗高寒、抗高溫三種應(yīng)激功能，同時(shí)可在體內(nèi)外均有抗癌功能。本發(fā)明的產(chǎn)品適于保健食品、醫(yī)藥品等企業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01K67/00GK1745627SQ20041007463
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者丁慶 申請(qǐng)人:丁慶