專利名稱：一種薰衣草組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體地說是一種薰衣草組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
薰衣草(Lavandula angustifolia，cv.Munstead)是唇形科薰衣草屬多年生半灌木，有強烈芳香氣味，原產(chǎn)于地中海。其生長迅速，根系發(fā)達，喜光耐旱，適合在廣袤的干旱地區(qū)種植。薰衣草油是從薰衣草的全草經(jīng)提煉得到的，具有安寧鎮(zhèn)靜、潔凈心身、清熱解毒、散淤消腫、超風發(fā)汗之效，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、飲料、煙草、牙膏、化妝品、香皂、洗滌劑、消毒劑和其它加香產(chǎn)品等工業(yè)領(lǐng)域。近年來，薰衣草油的需求量日益劇增。野生的薰衣草因生態(tài)環(huán)境受到嚴重破壞，日益減少，遠遠不能滿足市場需求。新疆是薰衣草的種植基地，其種植面積占全國的95％以上，但目前生產(chǎn)上栽培的都是60年代育成的老品種，退化嚴重，薰衣草油質(zhì)量嚴重下降，影響了其國際競爭力。此外，薰衣草不能度過新疆等干旱地區(qū)嚴寒的冬天，使得薰衣草的生產(chǎn)成本大大提高。因此，為了促進薰衣草種植業(yè)的發(fā)展，追求低成本，高品質(zhì)和高效益，開發(fā)新的繁育方式，引進新的優(yōu)良品種，已成為當今薰衣草市場發(fā)展的熱點問題。運用細胞工程手段，通過植物組織培養(yǎng)方法快速繁殖薰衣草，可以固定雜種優(yōu)勢，保持品種特異性。利用薰衣草組織在合適的培養(yǎng)基上進行離體繁殖，可加速品種繁殖速度，快速擴大種質(zhì)資源，保持優(yōu)良品種的性狀，用較少的空間，較少個體和時間獲得遺傳上與親本植株相同的大量再生無毒苗。這種繁殖方式為薰衣草的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展開拓了一條有效途徑，其經(jīng)濟效益和社會效益是巨大的。此外，組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以提高薰衣草抗旱抗寒的能力，改善薰衣草油的質(zhì)量，從而降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。組培快繁轉(zhuǎn)基因薰衣草的關(guān)鍵是建立高效的受體系統(tǒng)如愈傷組織和植株高頻再生系統(tǒng)。目前，薰衣草組織培養(yǎng)已有少量報道，C.Sudria等通過莖尖培養(yǎng)獲得了薰衣草(Lavandula dentate L.)的再生植株(Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1999，58)，Jordan AM等通過莖段培養(yǎng)獲得了薰衣草(Lavandula dentate L.)的再生植株(Biotech，1998，73(1))，但通過愈傷組織懸浮培養(yǎng)進而分化出芽而獲得再生植株的研究國內(nèi)外尚未見報。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效的薰衣草組織培養(yǎng)方法，為薰衣草規(guī)?；旆焙瓦z傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)。經(jīng)過大量的實驗研究，根據(jù)植物葉片再生原理，發(fā)明了以葉片為外植體，建立生長迅速的愈傷組織懸浮系，進而建立高頻穩(wěn)定再生體系。本發(fā)明采用固體—液體懸浮—固體培養(yǎng)的方法，提供了一種薰衣草離體快繁的方法，是在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)薰衣草葉片，建立生長迅速的愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系，最后再生薰衣草幼苗，得到薰衣草無性系。本發(fā)明薰衣草芽分化率可達92.5％，生根率可達100％。與固體培養(yǎng)相比，本發(fā)明不僅能夠提高愈傷組織生長速度和芽分化率，而且具有操作簡便，勞動量少和勞動強度小，接種量大的特點，其發(fā)展前景十分看好。
本發(fā)明所述的一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，按下列步驟進行a、選擇一年生薰衣草幼嫩葉片為外植體，先用75％酒精表面滅菌15-25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡2-5分鐘，然后用無菌水沖洗至干凈，切割成片狀，將其接入瓊脂固化MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基，15-25天后，得到愈傷組織；b、將新鮮、松散的愈傷組織接入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.01-0.1mg/L+6-BA 0.5-1.0mg/L，在25±1℃、無光、100r/min的條件下振蕩培養(yǎng)14-18天，建立了生長迅速的薰衣草愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系；c、將愈傷組織從液體培養(yǎng)基中取出，接入瓊脂固化MS+NAA 0.1-0.5mg/L+6-BA 2.0-3.0mg/L的芽分化培養(yǎng)基，35-40天后，得到薰衣草分化組培苗；d、將分化出的組培苗接種到瓊脂固化MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L的芽繼代培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗；e、在1/2 MS+IAA 0.2-0.5mg/L+6-BA 0-0.1mg/L+1.0g/L活性炭的固體培養(yǎng)基上，對組培苗進行生根培養(yǎng)，35-45天，形成生根小植株。
所選的薰衣草葉片是具有25-35天苗齡的幼嫩葉片，將其切割成0.2-0.7cm2的小片狀，背面朝下進行接種。
固體培養(yǎng)的條件是2500-3500lx日光燈照射，光照10-15h/d，25±1℃下培養(yǎng)，濕度保持65±5％。
固體培養(yǎng)接種量是100mL三角瓶3-5個外植體，每個三角瓶含35-45mL瓊脂固化的培養(yǎng)基。
再生的組培苗長到3-6cm，轉(zhuǎn)到瓊脂固化的生根培養(yǎng)基上進行生根。
固體培養(yǎng)基需添加瓊脂0.5％-0.6％。
液體培養(yǎng)愈傷組織接種量是25-75g/L，250mL三角瓶含100mL液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，根據(jù)本發(fā)明中的方法與固體培養(yǎng)相比，愈傷組織的生長速度可提高3-4倍，芽分化率可提高60％-70％，繼代培養(yǎng)時的接種量可提高2-3倍。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)周期可相應的減少1-4個月。由此，就可以低成本的大規(guī)模的繁殖薰衣草苗。
以下將本發(fā)明方法與傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法的主要區(qū)別概括如表1
表1方法接種量 生長速率 芽分化率芽數(shù)/外植勞動量 培養(yǎng)周期體固體少 慢 低 少 多 長培養(yǎng)固體繼代培 固體繼代培 愈傷組織不繼代，0.9～1.6 加瓊脂、化膠固體繼代培養(yǎng)養(yǎng)最適接量 養(yǎng)愈傷組織 芽不分化，繼代培個芽/外植操作煩瑣，費時 每代25～30是12.5g/L 生長速率最 養(yǎng)2～4代，芽分化體 費力，培養(yǎng)基分 天，2～4代大達5.84 率可達57.5％ 裝費時費力 50～120d，整g/L·d個周期5～7月本發(fā)多 快 高 多 少 短明 液體懸浮培 液體懸浮培 液體懸浮培養(yǎng)12～1.8～2.6 液體懸浮培養(yǎng)液體懸浮培養(yǎng)養(yǎng)最適接種 養(yǎng)愈傷組織 18d，轉(zhuǎn)接至固體 個芽/外植 減少了加瓊脂 12～18d，整個量是50g/L 生長速率最 分化培養(yǎng)基，芽分 體 、化膠這一工 周期3～4月大達24.14 化率可達92.5％ 序，培養(yǎng)液分裝g/L·d 簡便


圖1為本發(fā)明在液體培養(yǎng)基中所形成的愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系的圖；圖2為本發(fā)明在三角瓶中培養(yǎng)基上分化組培苗的圖；圖3為本發(fā)明所得的生根小植株的圖；圖4為本發(fā)明所得的移栽至花盆的生根小植株的圖。
本發(fā)明要建立懸浮系必須先獲得愈傷組織；選擇具有25-35天苗齡的薰衣草幼嫩葉片為外植體，將葉片先用75％酒精表面滅菌15-25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡2-5分鐘，然后用無菌水沖洗至干凈，把葉片切成0.2-0.7cm2左右的小片狀，接入瓊脂固化MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基，15-25天后，得到愈傷組織；挑取新鮮、松散的愈傷組織以25-75g/L的接種量接入含100mL液體培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.01-0.1mg/L+6-BA 0.5-1.0mg/L的250mL三角瓶中，在(25±1)℃、無光、100r/min的條件下振蕩培養(yǎng)14-18天，建立了生長迅速的薰衣草愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系(圖1)；將愈傷組織從液體培養(yǎng)基中取出，接入瓊脂固化MS+NAA 0.1-0.5mg/L+6-BA 2.0-3.0mg/L的芽分化培養(yǎng)基，35-40天后，得到薰衣草分化組培苗(圖2)；把分化出的組培苗接種到瓊脂固化MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L的芽繼代培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗；在1/2MS+IAA 0.2-0.5mg/L+6-BA 0-0.1mg/L+1.0g/L活性炭的固體培養(yǎng)基上，對3-6cm以上分化組培苗進行生根培養(yǎng)，35-45天，形成生根小植株(圖3)。
固體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是，2500-3500lx日光燈照射，光照12h/d，(25±1)℃下培養(yǎng)，濕度保持(65±5)％。
培養(yǎng)基需添加蔗糖1.5-3.0％，瓊脂0.5％-0.6％，并調(diào)pH值5.80-5.90。
固體培養(yǎng)接種量是100mL三角瓶3-5個外植體，每個三角瓶含40mL瓊脂固化的培養(yǎng)基。
具體實施例方式
下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但不能解釋為本發(fā)明被下面這些實施例所限制。
實施例1愈傷組織誘導實驗材料薰衣草(Lavandula angustifolia，cv.Munstead)種苗，法國引進新品種，取葉片為外植體。
a、選擇一年生薰衣草嫩葉片為外植體，具體選擇具有25天苗齡的薰衣草幼嫩葉片，將葉片先用75％酒精表面滅菌15秒，再用0.1％升汞溶液浸泡2min，然后用無菌水沖洗至干凈，把葉片切成0.2cm2的小片狀，接入含0.5％瓊脂的愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA0.5mg/L，在光照2500lx、光照時間10h/d、(25±1)℃、濕度(65±5)％的條件下培養(yǎng)15天，葉片全部出現(xiàn)愈傷組織，誘導率達到100％，所出愈傷組織大多為質(zhì)地致密、綠色或淺綠色愈傷組織，少部分為黃色、疏松的愈傷組織，黃色、疏松愈傷組織的比例為20％。
愈傷組織懸浮系的建立b、將新鮮、松散的愈傷組織以25g/L的接種量接入含100mL液體培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.01mg/L+6-BA 0.5mg/L的250mL三角瓶中，在25±1℃、無光、100r/min的條件下振蕩培養(yǎng)14天，建立了生長迅速的薰衣草愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系，其生長速率可達18.68g/L·d(愈傷組織生長速率＝(該接種量下第14天的收獲量-接種量)/(每瓶培養(yǎng)液體積×14)，單位g/L·d)。
芽分化和芽繼代c、將光滑、顆粒狀的愈傷組織從液體培養(yǎng)基中取出，接入含0.5％瓊脂的芽分化培養(yǎng)基MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 2.0mg/L，35天，大部愈傷組織可分化，芽分化率85.0％；d、把分化出的組培苗接種到含0.5％瓊脂的芽繼代培養(yǎng)基MS+NAA2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L，進行繼代培養(yǎng)，15天，可得到大量的組培苗。
培養(yǎng)條件為光照2500lx、光照時間12h/d、(25±1)℃、濕度(65±5)％。
分化組培苗生根與移栽e、挑取生長健壯，長度3cm的分化組培苗接入含0.5％瓊脂的生根培養(yǎng)基1/2MS+IAA 0.2mg/L+1.0g/L活性炭，35天形成生根小植株，生根率可達100％。生根苗取蓋煉苗2天，即可移栽到室內(nèi)花盆，注意保濕，成活率可達100％，半個月可長出新的小葉，表明移栽成活，此時可移入地里種植。
實施例2愈傷組織誘導實驗材料薰衣草(Lavandula angustifolia，cv.Munstead)種苗，法國引進新品種，取葉片為外植體。
a、選擇一年生薰衣草嫩葉片為外植體，具體選擇具有30天苗齡的薰衣草幼嫩葉片，將葉片先用75％酒精表面滅菌20秒，再用0.1％升汞溶液浸泡3min，然后用無菌水沖洗至干凈，把葉片切成0.5cm2的小片狀，接入含0.5％瓊脂的愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA0.5mg/L，在光照3500lx、光照時間12h/d、(25±1)℃、濕度(65±5)％的條件下培養(yǎng)20天，葉片全部出現(xiàn)愈傷組織，誘導率達到100％，所出愈傷組織大多為質(zhì)地致密、綠色或淺綠色愈傷組織，少部分為黃色、疏松的愈傷組織，黃色、疏松愈傷組織的比例為38％。
愈傷組織懸浮系的建立b、將新鮮、松散的愈傷組織以50g/L的接種量接入含100mL液體培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L的250mL三角瓶中，在25±1℃、無光、100r/min的條件下振蕩培養(yǎng)15天，建立了生長迅速的薰衣草愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系。在該液體培養(yǎng)基中，愈傷組織生長較快，質(zhì)量最好，其生長速率可達24.14g/L·d(愈傷組織生長速率＝(該接種量下第14天的收獲量-接種量)/(每瓶培養(yǎng)液體積×14)，單位g/L·d)。
芽分化和芽繼代c、將光滑、顆粒狀的愈傷組織從液體培養(yǎng)基中取出，接入含0.5％瓊脂的芽分化培養(yǎng)基MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L，40天，大部愈傷組織可分化，芽分化率92.5％；d、把分化出的組培苗接種到含0.5％瓊脂的芽繼代培養(yǎng)基MS+NAA2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L，進行繼代培養(yǎng)，20天，可得到大量的組培苗。
培養(yǎng)條件為光照3500lx、光照時間12h/d、(25±1)℃、濕度(65±5)％。
分化組培苗生根與移栽e、挑取生長健壯，長度超過5cm的分化組培苗接入含0.5％瓊脂的生根培養(yǎng)基1/2 MS+IAA 0.5mg/L+1.0g/L活性炭，40天形成生根小植株，生根率可達100％。生根苗取蓋煉苗3天，即可移栽到室內(nèi)花盆，注意保濕，成活率可達100％，半個月可長出新的小葉，表明移栽成活，此時可移入地里種植。
實施例3愈傷組織誘導實驗材料薰衣草(Lavandula angustifolia，cv.Munstead)種苗，法國引進新品種，取葉片為外植體。
a、選擇一年生薰衣草嫩葉片為外植體，具體選擇具有35天苗齡的薰衣草幼嫩葉片，將葉片先用75％酒精表面滅菌25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡5min，然后用無菌水沖洗至干凈，把葉片切成0.7cm2的小片狀，接入含0.6％瓊脂的愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA0.5mg/L，在光照3500lx、光照時間15h/d、(25±1)℃、濕度(65±5)％的條件下培養(yǎng)25天，葉片全部出現(xiàn)愈傷組織，誘導率達到100％，所出愈傷組織大多為質(zhì)地致密、綠色或淺綠色愈傷組織，少部分為黃色、疏松的愈傷組織，黃色、疏松愈傷組織的比例為30％。
愈傷組織懸浮系的建立b、將新鮮、松散的愈傷組織以75g/L的接種量接入含100mL液體培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L的250mL三角瓶中，在25±1℃、無光、100r/min的條件下振蕩培養(yǎng)18天，建立了生長迅速的薰衣草愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系，其生長速率可達20.38g/L·d(愈傷組織生長速率＝(該接種量下第14天的收獲量-接種量)/(每瓶培養(yǎng)液體積×14)，單位g/L·d)。
芽分化和芽繼代c、將光滑、顆粒狀的愈傷組織從液體培養(yǎng)基中取出，接入含0.6％瓊脂的芽分化培養(yǎng)基MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 3.0mg/L，40天，大部愈傷組織可分化，芽分化率82.5％；d、把分化出的組培苗接種到含0.6％瓊脂的芽繼代培養(yǎng)基MS+NAA2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L，進行繼代培養(yǎng)，20天，可得到大量的組培苗。
培養(yǎng)條件為光照3500lx、光照時間12h/d、(25±1)℃、濕度(65±5)％。
分化組培苗生根與移栽e、挑取生長健壯，長度超過6cm的分化組培苗接入含0.6％瓊脂的生根培養(yǎng)基1/2MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 0.1mg/L+1.0g/L活性炭，45天形成生根小植株，生根率可達100％。生根苗取蓋煉苗3天，即可移栽到室內(nèi)花盆，注意保濕，成活率可達100％，半個月可長出新的小葉，表明移栽成活，此時可移入地里種植。
根據(jù)本發(fā)明中的方法，與固體培養(yǎng)相比，愈傷組織的生長速度可提高3-4倍，芽分化率可提高60％～70％，繼代培養(yǎng)時的接種量可提高2-3倍。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)周期可相應的減少1-4個月。由此，就可以低成本的大規(guī)模的生長薰衣草苗。
權(quán)利要求
1.一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，其特征在于按下列步驟進行a、選擇一年生薰衣草幼嫩葉片為外植體，先用75％酒精表面滅菌15-25秒，再用0.1％升汞溶液浸泡2-5分鐘，然后用無菌水沖洗至干凈，切割成片狀，將其接入瓊脂固化MS+2，4-D 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基，15-25天后，得到愈傷組織；b、將新鮮、松散的愈傷組織接入液體培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.01-0.1mg/L+6-BA 0.5-1.0mg/L，在25±1℃、無光、100r/min的條件下振蕩培養(yǎng)14-18天，建立了生長迅速的薰衣草愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系；c、將愈傷組織從液體培養(yǎng)基中取出，接入瓊脂固化MS+NAA 0.1-0.5mg/L+6-BA 2.0-3.0mg/L的芽分化培養(yǎng)基，35-40天后，得到薰衣草分化組培苗；d、將分化出的組培苗接種到瓊脂固化MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L的芽繼代培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng)，15-20天，得到大量的組培苗；e、在1/2 MS+IAA 0.2-0.5mg/L+6-BA 0-0.1mg/L+1.0g/L活性炭的固體培養(yǎng)基上，對組培苗進行生根培養(yǎng)，35-45天，形成生根小植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，其特征是所選的薰衣草葉片是具有25-35天苗齡的幼嫩葉片，將其切割成0.2-0.7cm2的小片狀，背面朝下進行接種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，其特征是固體培養(yǎng)的條件是2500-3500lx日光燈照射，光照10-15h/d，25±1℃下培養(yǎng)，濕度保持65±5％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，其特征是固體培養(yǎng)接種量是100mL三角瓶3-5個外植體，每個三角瓶含35-45mL瓊脂固化的培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，其特征是再生的組培苗長到3-6cm，轉(zhuǎn)到瓊脂固化的生根培養(yǎng)基上進行生根。
6.據(jù)權(quán)利要求1-5所述的一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，其特征是固體培養(yǎng)基需添加瓊脂0.5％0.6％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，其特征是液體培養(yǎng)愈傷組織接種量是25-75g/L，250mL三角瓶含100mL液體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種薰衣草組織培養(yǎng)方法，該方法根據(jù)植物葉片再生原理，以葉片為外植體，建立生長迅速的愈傷組織懸浮系，進而建立高頻穩(wěn)定再生體系。本發(fā)明采用固體—液體懸浮—固體培養(yǎng)的方法，提供了一種薰衣草離體快繁的方法，是在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)薰衣草葉片，建立生長迅速的愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系，最后再生薰衣草幼苗，得到薰衣草無性系。本發(fā)明薰衣草芽分化率可達92.5％，生根率可達100％。與固體培養(yǎng)相比，本發(fā)明不僅能夠提高愈傷組織生長速度和芽分化率，而且具有操作簡便，勞動量少和勞動強度小，接種量大的特點，為薰衣草規(guī)?；旆焙瓦z傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK1586176SQ20041008533
公開日2005年3月2日 申請日期2004年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月11日
發(fā)明者許耀祖, 王曉軍, 趙明安, 趙海清, 韋彥余, 劉敏 申請人:中國科學院新疆理化技術(shù)研究所