專利名稱：殺線蟲劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從屬于曲霉菌屬(Asperillus sp.)的菌的培養(yǎng)液中提取、純化出的殺線蟲劑。
背景技術：
已經開發(fā)和銷售多種針對以松天牛為媒介昆蟲的寄生在松樹上的松材線蟲、寄生在黃瓜或卷心菜上的根結線蟲、寄生在馬鈴薯上的包囊線蟲等的殺線蟲劑。
例如在特公平2-32251號公報中提出了用屬于曲霉屬(Aspergillus sp.)等的菌或其代謝產物的線蟲驅除方法的提案，其中記載了屬于曲霉菌屬的蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillus melleusJAM4022，FERM BP-726)等，不過，在該專利文獻中只是提示菌的代謝產物中存在配糖體，沒有針對從菌的培養(yǎng)液中提取、純化具有殺線蟲活性成分的研究。
因此，本發(fā)明的目的是提供從屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌的培養(yǎng)液中提取、純化出的殺線蟲劑。

發(fā)明內容
鑒于上述問題點，本發(fā)明的殺線蟲劑，其特征是，如權利要求1所記載的根據需要，在pH 7以下，用與水分離的第1有機溶劑分配提取屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌的培養(yǎng)濾液，得到的第1有機溶劑提取級分再用堿性水溶液分配提取，在pH7以下，得到的堿性溶液提取級分用與水分離的第2有機溶劑分配提取，以由此得到的有機酸性級分提取物為有效成分。
此外，權利要求2記載的殺線蟲劑，其特征是，在權利要求1記載的殺線蟲劑中的線蟲是松材線蟲。
此外，權利要求3記載的殺線蟲劑，其特征是，在權利要求1記載的殺線蟲劑中的屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌是蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillus melleus JAM4022，FERM BP-726)此外，權利要求4記載的殺蟲劑，其特征是，在權利要求1記載的殺線蟲劑中，第1有機溶劑和第2有機溶劑中的任何一個是醋酸乙酯。
此外，本發(fā)明的殺蟲劑，其特征是，如權利要求5記載的以青霉酸為有效成分。
根據本發(fā)明，可以提供從屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌的培養(yǎng)液中提取、純化出的殺線蟲劑。


圖1表示在實施例的試驗例中提取具有殺松材線蟲活性的成分的工序圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的殺線蟲劑的特征是，根據需要，在pH7以下，用與水分離的第1有機溶劑分配提取屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌的培養(yǎng)濾液，得到的第1有機溶劑提取級分再用堿性水溶液分配提取，在pH7以下，得到的堿性水溶液提取級分用與水分離的第2有機溶劑分配提取，以由此得到的有機酸性級分提取物為有效成分。而且，本發(fā)明的殺線蟲劑的特征是，以青霉酸作為有效成分。關于青霉酸(Penicillic acid，3-methoxy-5-methyl-4-oxo-2，5-hexadienoicacid)的生物活性，已知有抗細菌活性、抗霉菌活性、抗病毒活性等，至今為止，還沒有關于殺線蟲活性的報道。
在本發(fā)明中，作為屬于曲霉屬(Aspergillus sp.)的菌優(yōu)選使用蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillus melleus JAM4022，FERM BP-726)，此外，也可以使用寄生曲霉JAM4002(Aspergillus parasiticusJAM4002，FERM BP-724)、塔木里氏曲霉JAM4007(Aspergillus tamariiJAM4007，FERM BP-723)、煙曲霉JAM4008(Aspergillus fumigatusJAM4008，FERM BP-727)、黑曲霉JAM4054(Aspergillus nigerJAM4054，FERM BP-8300)、黑曲霉JAM4055(Aspergillus nigerJAM4055，FERM BP-8301)等。并且JAM指的是株式會社應微研的菌株分類號(JAPANAPPLIDE RESEARCHMICROORGANISMS的簡稱)。
可以按照用于提取、純化含有有機酸的酸性級分提取物的一般性方法進行從屬于曲霉屬(Aspergillus sp.)的菌的培養(yǎng)濾液中得到有機酸性級分提取物的具體操作。優(yōu)選醋酸乙酯作為可以用作第1溶劑和第2溶劑的能與水分離的有機溶劑。優(yōu)選飽和碳酸氫鈉水溶液作為堿性水溶液。在將培養(yǎng)濾液或者堿性水溶液提取級分調節(jié)到pH 7以下時，可以使用鹽酸。
以殺線蟲活性為指標，可以用在分離、純化天然有機化合物所通常采用的柱層析或者薄層層析的層析方法等將得到的有機酸性級分提取物再次分離。本發(fā)明的殺線蟲劑包含進行上述再次分離的多種成分組成的有機酸性提取物或每個分離并純化的以青霉酸等有機化合物為有效成分的物質。另外，用青霉酸作為本發(fā)明的殺線蟲劑的有效成分時，不局限于用從有機酸性級分提取物中分離、純化的青霉酸，也可以是通過化學合成等得到的青霉酸。
本發(fā)明的殺線蟲劑，可以含有任意量的有效成分，用公知的載體或者添加劑，制備成粉劑、液體制劑等各種劑型以供應用?？梢詫谑褂媚康模褂靡后w載體和固體載體中的任何一種作為載體。液體載體可列舉水、醇類、酮類、醚類等。固體載體可列舉礦物粉末、氧化鋁、硫磺粉末、活性炭等。添加劑可列舉乳化劑、懸濁劑、穩(wěn)定劑、展開劑、浸透劑、分散劑等。其使用的劑量，相應于采用的劑型、受災狀況、適用方法、適用場所等來確定。
本發(fā)明的殺線蟲劑，除了針對松材線蟲發(fā)揮效果之外，對根結線蟲、包囊線蟲、根腐線蟲等的效果也是值得期待的。另外，本發(fā)明的殺線蟲劑還可以含有具有殺線蟲活性之外的有效成分。
實施例以下，通過實施例詳細說明本發(fā)明，不過，本發(fā)明不局限于此。并且，可以認為本實施例是將本發(fā)明的殺線蟲劑作為殺松材線蟲劑使用的實施例。
試驗例將蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillus melleus JAM4022，FERM BP-726)接種到以PDA培養(yǎng)基(日水制藥公司制造的PDA培養(yǎng)基39重量份，蒸餾水1000重量份)作為帶蓋玻璃器皿內的固體培養(yǎng)基中，在25℃震蕩培養(yǎng)2周，直到產生足夠量的分生菌為止。然后，向該固體培養(yǎng)基上注入滅菌蒸餾水，為了使在培養(yǎng)基上長成的培養(yǎng)物懸濁到液體中去，加以攪拌，得到懸濁液。接著，將該懸濁液加到液體麥芽培養(yǎng)基[麥芽提取物(オリエンタル酵母工業(yè)公司制造)30重量份、蛋白胨3重量份(極東制藥公司制造)、葡萄糖20重量份、蒸餾水1000重量份]中，在24℃下于暗處培養(yǎng)28天。
按照下面的方式從得到的培養(yǎng)液中提取、純化出具有殺松材線蟲活性的有效成分。并且，在下面的說明中，液體的混合比表示體積比。
用濾紙(No.5)過濾得到的培養(yǎng)液，分離培養(yǎng)濾液和殘渣(菌體)。
向得到的培養(yǎng)濾液中加入2N的鹽酸，調整到pH2～3，將該培養(yǎng)濾液和醋酸乙酯按照1∶3的比例用分液漏斗振搖提取后，靜置，得到上層的醋酸乙酯提取級分和下層的鹽酸水溶液級分。相對下層的鹽酸水溶液級分按照和上面相同的比例加入新的醋酸乙酯，同樣的操作，重復2次，分別得到醋酸乙酯提取級分?；旌?次提取得到的醋酸乙酯提取級分，得到第1醋酸乙酯提取級分。
針對該第1醋酸乙酯提取級分、鹽酸水溶液級分的丁醇提取級分、殘渣(菌體)的丙酮提取級分，調查殺松材線蟲活性時，因為測定發(fā)現第1醋酸乙酯提取級分有很強活性，所以對第1醋酸乙酯提取級分再進行提取、純化。
為了進行第1醋酸乙酯提取級分的再次提取、純化，準備大量的培養(yǎng)液。即，將30L上述液體麥芽培養(yǎng)基分別以500mL注入到120個的搖瓶中，向每個搖瓶中分別加入0.1mL按照上述同樣方法得到的懸濁液進行培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)液按照上述同樣的方法進行處理，得到第1醋酸乙酯提取級分。
將第1醋酸乙酯提取級分和飽和碳酸氫鈉水溶液按照1∶1的比例用分液漏斗振搖提取后，靜置，得到上層的醋酸乙酯級分和下層的飽和碳酸氫鈉水溶液提取級分。
向得到的飽和碳酸氫鈉水溶液提取級分中加入2N的鹽酸，調整到pH2～3，將該酸性水溶液級分和醋酸乙酯按照1∶3的比例用分液漏斗振搖提取后，靜置，得到上層的醋酸乙酯提取級分和下層的鹽酸水溶液級分。相對下層的鹽酸水溶液級分按照和上面相同的比例加入新的醋酸乙酯，同樣的操作，重復2次，分別得到醋酸乙酯提取級分?；旌?次提取得到的醋酸乙酯提取級分，得到第2醋酸乙酯提取級分。用硫酸鈉使上述第2醋酸乙酯提取級分脫水后，濃縮至干，得5.51g有機酸性級分提取物的紅色固體物。該有機酸性級分提取物的殺松材線蟲的活性在500ppm濃度下，為7.0％，在濃度1000ppm下，為50.0％。并且，針對通過振搖提取分離的上述第1醋酸乙酯提取級分和飽和碳酸氫鈉水溶液的醋酸乙酯級分的殺松材線蟲活性進行調查時，發(fā)現雖然有所減弱，不過還是有活性的。
用WakogelC-200(和光純藥公司制造內徑3.5cm、長40cm)將有機酸性級分提取物加樣到硅膠層析柱上。用己烷-醋酸乙酯作為溶劑，其混合比在100∶0～0∶100之間每隔10變化一次，各個混合比的溶劑分別流過1L，分別收取各個1L的洗脫液，濃縮至干。在各個洗脫級分的濃縮干燥物中，表現高的殺松材線蟲活性以及量多的級分的活性如表1所示。從表1可知，30％醋酸乙酯洗脫級分、40％醋酸乙酯洗脫級分即使在濃度1000ppm時也顯示出高的殺松材線蟲活性。由此將最高殺松材線蟲活性并且濃縮至干的固體物量也多的30％醋酸乙酯洗脫級分供給下面的第二次層析柱。
表1

用Wakogel C-200(和光純藥公司制造內徑2.0cm、長35cm)將上述30％醋酸乙酯洗脫級分供給到到硅膠層析柱上。用己烷-醋酸乙酯作為溶劑，它們的混合比在100∶0～0∶100之間每隔5變化一次，各個混合比的溶劑分別流過1L，分別收取每個500mL的洗脫液，濃縮至干。在各個洗脫級分的濃縮干燥物中，表現高的殺松材線蟲活性以及量多的級分的活性如表2所示。通過表2可知，由級分8、級分11、級分12即使在1000ppm濃度下也表現高的殺松材線蟲活性。由此，將這3個級分供給下述的薄層層析。
表2

注)表示將使用溶劑前面的500mL洗脫級分定為1，其后的500mL溶出級分定為2。
將上述的級分8、級分11、級分12供給到硅膠(Kiesel 60 GF254，メルク公司制造)的薄層層析上。對級分11用己烷-丙酮(7∶3)、級分8和級分12己烷-丙酮(6∶4)作為展開溶劑。刮取各個分離的點，提取分離。調查各自的殺松材線蟲活性和含有物質的量。結果如表3所示。從表3可以明確，在級分8中，從離開展開開始位置開始，第1個級分(Rf值＝0.01)和第2個級分(Rf值＝0.15)具有高的殺松材線蟲活性。在級分11中，從離開展開開始位置開始，第2個級分(Rf值＝0.14)具有高的殺松材線蟲活性，同時含有物質的量多。用薄層層析、紅外吸收光譜分析、核磁共振光譜分析確定該第2個級分和標準品青霉酸一致。在級分12中，從離開展開開始位置開始，第1個級分(Rf值＝0.01)、第2個級分(Rf值＝0.08)、第3個級分(Rf值＝0.19)、第4個級分(Rf值＝0.34)經確認具有殺松材線蟲活性。
表3

注)由于微量，不能進行測定。
按照下述方法評價上述的殺松材線蟲活性。即，向10mg樣本(濃縮至干的固體物)中加入適量的100μL～500μL的丙酮或者甲醇，溶解或者懸濁，然后，用純化水稀釋到10000ppm作為試驗溶液的原液。將該原液調節(jié)到試驗濃度的2倍濃度，向96孔板的每個孔中分別加入100μL，然后再加入松材線蟲的蒸餾水懸濁液100μL(400～1000個/mL)，在25℃下，于暗處放置1周后，用顯微鏡計數各個孔內松材線蟲的生存數和死亡數，用[(死亡數)/(生存數+死亡數)×100]表示死亡率(表1～表3的死亡率表示的是1個濃度下3個試驗孔的平均值)。并且，認為會有松材線蟲的假死狀態(tài)，在進行如上所述的孔內的松材線蟲的死亡率測定后，將各孔內的液體分別移到試管中，離心分離，去除上清，再用蒸餾水洗滌2、3次，將其移到中央計數板上，通過顯微鏡計數松材線蟲的生存數和死亡數。和上述同樣的方法計算出死亡率。其結果發(fā)現用微孔板求得的死亡率和用中央計數板求得的死亡率幾乎一致。
在實驗例中的提取工序圖，如圖1所示。
制備例制備青霉酸1體積％的水溶液，作為殺線蟲劑(液體制劑)。
產業(yè)上的可利用性本發(fā)明可以提供從屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌的培養(yǎng)液中提取、純化出的殺線蟲劑。從上述出發(fā)點考慮，本發(fā)明具有在產業(yè)上的可利用性。
權利要求
1.一種殺線蟲劑，其特征是，根據需要，在pH7以下，用與水分離的第1有機溶劑分配提取屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌的培養(yǎng)濾液，得到的第1有機溶劑提取級分再用堿性水溶液分配提取，在pH7以下，得到的堿性水溶液提取級分用與水分離的第2有機溶劑分配提取，以由此得到的有機酸性級分提取物為有效成分。
2.權利要求1記載的殺線蟲劑，其特征是，其中的線蟲是松材線蟲。
3.權利要求1記載的殺線蟲劑，其特征是，其中屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌是蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillus melleusJAM4022，FERM BP-726)。
4.權利要求1記載的殺線蟲劑，其特征是，其中的第1有機溶劑和第2有機溶劑都是醋酸乙酯。
5.一種殺蟲劑，其特征是，以青霉酸為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明的課題是提供從屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌的培養(yǎng)液中提取、純化出的殺線蟲劑。本發(fā)明的殺線蟲劑，其特點在于根據需要，在pH7以下，用與水分離的第1有機溶劑分配提取屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)的菌的培養(yǎng)濾液，得到的第1有機溶劑提取級分再用堿性水溶液分配提取，在pH7以下，得到的堿性水溶液提取級分用與水分離的第2有機溶劑分配提取，以由此得到的有機酸性級分提取為有效成分。
文檔編號A01N63/04GK1756480SQ20048000577
公開日2006年4月5日 申請日期2004年3月3日 優(yōu)先權日2003年3月4日
發(fā)明者門宏超 申請人:株式會社應微研