專利名稱：：調(diào)節(jié)植物細(xì)胞多醣的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體來(lái)說(shuō)涉及植物多醣合成基因和通過(guò)所述基因編碼的多肽的領(lǐng)域，與所述多核苷酸和多肽序列用于控制植物表型的用途。本發(fā)明特定地提供從桉屬(Eucalyptus)與松屬(Pinus)分離的細(xì)胞周期多核苷酸和多肽序列和與其相關(guān)的序列。
背景技術(shù)：
：植物細(xì)胞壁主要由纖維素、膠質(zhì)和半纖維素組成。纖維素由極其堅(jiān)固且抵抗酶和機(jī)械退化的晶體β-1，4-葡聚糖微纖維組成。纖維素含量對(duì)植物纖維和木質(zhì)產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特性以及動(dòng)物與人類食物的營(yíng)養(yǎng)數(shù)量、可消化性和可口性具有深遠(yuǎn)影響。此外，纖維素是重要工業(yè)植物纖維諸如棉花、亞麻、大麻、黃麻與林業(yè)種類諸如桉亞屬(Eucalyptusssp)和松亞屬(Pinusssp)的主要結(jié)構(gòu)組份。纖維素也經(jīng)常用于多種工業(yè)應(yīng)用中。一些生物可降解塑料與可消化藥物膠囊以及醫(yī)藥填充劑和食品纖維添加劑可由植物多醣制成。另外，某些塑料諸如醋酸纖維素和合成紡織品諸如嫘縈源自纖維素。多醣對(duì)食物質(zhì)量具有深遠(yuǎn)影響。細(xì)胞壁促成胡蘿卜的脆性，而軟化果實(shí)諸如桃子和西紅柿要求細(xì)胞壁退化。在玉米中，家畜飼養(yǎng)(但不是人類消費(fèi))需要經(jīng)增加的直鏈淀粉，且經(jīng)增加的細(xì)胞壁強(qiáng)度降低可消化性。在纖維農(nóng)作物諸如木材中，纖維素是有關(guān)的主要聚合物。結(jié)構(gòu)性木材質(zhì)量的基本量度-木質(zhì)密度-基本上是纖維素含量的量度。在紙漿工業(yè)中，根據(jù)纖維素產(chǎn)率測(cè)量效率，并因此需要較高的纖維素含量。改變多醣合成基因表達(dá)的能力是極其強(qiáng)有力的，因?yàn)槎圊焙铣捎绊懼参锉硇鸵约吧L(zhǎng)速率。已應(yīng)用多醣合成控制用于(尤其)改變木質(zhì)特性和尤其是木材與木漿特性。舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)改變多醣合成基因表達(dá)來(lái)奏效的木漿改善包括經(jīng)增加或降低的木質(zhì)素和纖維素含量。操縱植物中的多醣合成也可以設(shè)計(jì)具有以下特性的較佳木材經(jīng)增加的尺寸穩(wěn)定性、經(jīng)增加的抗張強(qiáng)度、經(jīng)增加的剪切強(qiáng)度、經(jīng)增加的壓縮強(qiáng)度、經(jīng)降低的反應(yīng)性木質(zhì)、經(jīng)增加的剛性、經(jīng)增加或降低的硬度、經(jīng)降低的螺旋性、經(jīng)降低的收縮性和相對(duì)于重量、密度與比重的所需特性。A.多醣基因與蛋白纖維素合成部分上是通過(guò)纖維素合成酶催化的。纖維素合成酶是轉(zhuǎn)化進(jìn)行性β-糖基轉(zhuǎn)移酶大家族中的成員。纖維素合成酶(Ces)基因編碼纖維素合成酶，并部分負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)纖維素生物合成。CesA，一種纖維素合成酶，隸屬于纖維素合成酶超級(jí)家族，其特征在于4個(gè)保守域U1至U4。U1至U3都各具有保守的天冬氨酸鹽以及N′鋅手指形域。U4域具有公認(rèn)的基質(zhì)結(jié)合點(diǎn)Q-x-x-R-W。Saxena等人，JBacteriol.1771419(1995)。CesA蛋白經(jīng)預(yù)測(cè)是八個(gè)具有大約1100個(gè)氨基酸的橫跨膜域蛋白。CesA蛋白充當(dāng)將經(jīng)活化的葡萄糖聚合成纖維素聚合物的大型膜結(jié)合錯(cuò)合物的部分。如果不是所有證據(jù)均支持“纖維素合成酶基因編碼整合到纖維素生物合成途徑的糖基轉(zhuǎn)移酶”的假說(shuō)，那么在高等植物中Ces的基質(zhì)是UDP葡萄糖(UDPG)且最多(參見Holland等人，PlantPhysiol.，1231313(2000))。計(jì)算機(jī)分析(InSilicoAnalysis)識(shí)別-纖維素合成酶類似蛋白(Csl)，植物中的據(jù)信為進(jìn)行性多醣β糖類轉(zhuǎn)移酶的蛋白大家族。參見，例如Goubet等人，PlantPhysiol.131547(1993)。纖維素合成酶類似蛋白具有如同纖維素合成酶的保守U1至U4域，但缺少N′鋅手指形域。Doblin等人，PlantCellPhysiol.431407(2002)。據(jù)信纖維素合成酶類似酶控制非纖維素植物多醣的產(chǎn)生。B.多醣合成中的表達(dá)分布與微陣列分析多醣合成的多基因控制在判定負(fù)責(zé)表型判定的基因中出現(xiàn)困難。識(shí)別促成植物中表型的基因和基因表達(dá)差異的一個(gè)主要障礙是可共同研究多于少數(shù)基因表達(dá)的困難。識(shí)別并理解促成植入表型的基因表達(dá)與基因間相互關(guān)系的另一困難是植物證明的對(duì)環(huán)境因素的高度敏感性。近來(lái)已有使用基因組范圍表達(dá)分布的進(jìn)展。詳細(xì)來(lái)說(shuō)，DNA微陣列的使用適用于在單一實(shí)驗(yàn)中研究大量基因的表達(dá)。已使用表達(dá)分布來(lái)進(jìn)行對(duì)發(fā)展和環(huán)境刺激的植物基因響應(yīng)的幾項(xiàng)研究。舉例來(lái)說(shuō)，采用微陣列分析來(lái)研究草莓果實(shí)成熟期間的基因表達(dá)，Aharoni等人，PlantPhysiol.1291019-1031(2002)，Arabodopsis中的傷口響應(yīng)，Cheong等人，PlantPhysiol.129661-7(2002)，Arabodopsis中的病原體響應(yīng)，Schenk等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.9711655-60(2000)和大豆中的植物生長(zhǎng)素響應(yīng)，Thibaud-Nisse等人，PlantPhysiol132118。Whetten等人，PlantMol.Biol.47275-91(2001)揭示使用cDNA探針的火炬松(PinustaedaL)中的細(xì)胞壁生物合成基因的表達(dá)分布。Whetten等人研究在差異性不成熟與成熟第二木質(zhì)部之間差異表達(dá)的基因。另外，為測(cè)定某種環(huán)境刺激對(duì)基因表達(dá)的影響，將壓縮木質(zhì)中的基因表達(dá)與正常木質(zhì)相比較。所研究的2300個(gè)要素中的156個(gè)顯示差異表達(dá)。上文的Whetten在285處。不成熟木質(zhì)與成熟木質(zhì)的比較顯示188個(gè)要素為差異表達(dá)。同樣上文的Whetten在286處。盡管表達(dá)分布且尤其是DNA微陣列為基因組范圍表達(dá)分析提供便利手段，但其使用已限制于可利用完整基因組序列或大型cDNA基因庫(kù)的有機(jī)體。參見Hertzberg等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.9814732-7(2001a)；Hertzberg等人，PlantJ.，25585(2001b)。舉例來(lái)說(shuō)，上文的Whetten聲稱“這個(gè)令人感興趣的問(wèn)題的更完整分析有待于更大組松樹與白楊EST的完成”。Whetten等人在286。此外，由于基因中的序列類似性，包含cDNA或EST探針的微陣列可能無(wú)法辨別同一家族中的基因。即當(dāng)用作微陣列探針時(shí)，cDNA或EST可結(jié)合至同一家族中的多個(gè)基因。操縱基因表達(dá)以產(chǎn)生具有更合意的表型的植物的方法將通過(guò)更好地理解各種類型植物組織在植物發(fā)育的不同階段和在以不同環(huán)境提示刺激后的多醣合成基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)?？刂浦参锛軜?gòu)和農(nóng)藝學(xué)重要特征的能力將通過(guò)更好理解地多醣合成基因表達(dá)如何影響植物組織形成和植物生長(zhǎng)與多醣合成如何聯(lián)系來(lái)改善。在大量基因中，植物發(fā)育期間可改變的基因的表達(dá)僅一部分可能影響植物發(fā)育的任一給定階段期間的表型改變。
發(fā)明內(nèi)容因此，需要適用于測(cè)定多醣合成基因表達(dá)中可導(dǎo)致所需表型的改變的手段和方法。也需要適用于所述方法的多核苷酸。進(jìn)一步需要可使多醣合成基因表達(dá)中的改變與表型相關(guān)聯(lián)的方法。進(jìn)一步需要識(shí)別多醣合成基因和基因產(chǎn)物的方法，所述多醣合成基因和基因產(chǎn)物影響植物表型，且其可被操縱以獲得所需表型。在一方面，本發(fā)明提供經(jīng)分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供以經(jīng)分離的多核苷酸轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞，所述經(jīng)分離的多核苷酸包含選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，所述多核苷酸包含選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)多核苷酸的DNA構(gòu)造，所述多核苷酸具有SEQIDNO1-29的任一個(gè)和其保守變體的序列。在一方面，本發(fā)明提供一種制造經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物的方法，所述方法包含以DNA構(gòu)造將植物細(xì)胞轉(zhuǎn)型、在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)分離的多核苷酸，所述經(jīng)分離的多核苷酸包含將多肽的催化性或基質(zhì)結(jié)合域編碼的序列，所述多肽選自SEQIDNO30-58的任一個(gè)，其中所述多核苷酸編碼具有選自SEQIDNO30-58的任一個(gè)的所述多肽的活性的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供一種制造經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物的方法，所述方法包含以包含至少一個(gè)具有SEQIDNO1-29的任一個(gè)的序列的多核苷酸的DNA構(gòu)造將植物細(xì)胞轉(zhuǎn)型和在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供從轉(zhuǎn)基因樹獲得的木質(zhì)，所述轉(zhuǎn)基因樹已以本發(fā)明的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型。在另一方面，本發(fā)明提供從轉(zhuǎn)基因樹獲得的木漿，所述轉(zhuǎn)基因樹已以本發(fā)明的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型。在另一方面，本發(fā)明提供一種制造木質(zhì)的方法，所述方法包含以包含具有選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列的多核苷酸的DNA構(gòu)造將植物轉(zhuǎn)型；在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物；和從所述植物獲得木質(zhì)。本發(fā)明也提供一種制造木漿的方法，所述方法包含以包含具有選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列的多核苷酸的DNA構(gòu)造將植物轉(zhuǎn)型、在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物和從所述植物獲得木漿。本發(fā)明的另一方面提供經(jīng)分離的多肽，所述經(jīng)分離的多肽包含通過(guò)本發(fā)明的經(jīng)分離的多核苷酸編碼的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)分離的多肽，所述多肽包含選自由SEQIDNO30-58組成的群組的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供一種改變植物的植物表型的方法，所述方法包含改變植物中通過(guò)SEQIDNO1-29的任一個(gè)編碼的多肽的表達(dá)。在一方面，本發(fā)明提供多核苷酸，所述多核苷酸包含選自由SEQIDNO59-83組成的群組的核酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供將兩個(gè)不同樣品中的基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)的方法，所述方法包含探測(cè)編碼產(chǎn)物的一個(gè)或一個(gè)以上基因在第一樣品中的表達(dá)水平，所述產(chǎn)物通過(guò)選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列編碼；探測(cè)一個(gè)或一個(gè)以上基因第二樣品中的表達(dá)水平；將一個(gè)或一個(gè)以上基因在第一樣品中的表達(dá)水平與一個(gè)或一個(gè)以上基因在第二樣品中的表達(dá)水平相比較；和將第一樣品與第二樣品之間的一個(gè)或一個(gè)以上基因表達(dá)水平的差異相關(guān)聯(lián)。在另一方面，本發(fā)明提供一種將植物表型擁有物與植物中的一個(gè)或一個(gè)以上基因的基因表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)的方法，所述方法包含探測(cè)擁有表型的第一植物中的編碼產(chǎn)物的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)水平，所述產(chǎn)物通過(guò)選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列編碼；探測(cè)缺少表型的第二植物中的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)水平；將第一植物中的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)水平與第二植物中的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)水平相比較；和將第一植物與第二植物之間的一個(gè)或一個(gè)以上基因表達(dá)水平的差異與表型的擁有物相關(guān)聯(lián)。在另一方面，本發(fā)明提供將基因表達(dá)與形成反應(yīng)性木質(zhì)的傾向相關(guān)聯(lián)的方法，所述方法包含探測(cè)顯示正常木質(zhì)表型的木質(zhì)部的第一植物細(xì)胞中的編碼產(chǎn)物的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)水平，所述產(chǎn)物通過(guò)選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列編碼；探測(cè)顯示反應(yīng)性木質(zhì)表型的木質(zhì)部的第二植物細(xì)胞中的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)水平；將第一植物細(xì)胞中的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)水平與第二植物細(xì)胞中的一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)水平相比較；和將第一與第二樣品之間的一個(gè)或一個(gè)以上基因表達(dá)水平的差異與形成反應(yīng)性木質(zhì)的傾向相關(guān)聯(lián)。在一方面，本發(fā)明提供用于探測(cè)一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)的組合，所述組合包含兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸，其中每一寡核苷酸都能夠雜交到選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供用于探測(cè)一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)的組合，所述組合包含兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸，其中每一寡核苷酸都能夠雜交到基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物通過(guò)選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列編碼。在另一方面，本發(fā)明提供一種在固體載體上包含本發(fā)明支撐件的組合的微陣列，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸的每一者在所述固體載體支撐件上占據(jù)一個(gè)獨(dú)特位置。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于探測(cè)樣品中的一個(gè)或一個(gè)以上基因的方法，所述方法包含使所述樣品與兩種或兩種上寡核苷酸接觸，其中每一寡核苷酸在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下都能夠雜交到包含選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列的基因；和探測(cè)雜交到一個(gè)或一個(gè)以上寡核苷酸的一個(gè)或一個(gè)以上有關(guān)基因。在一方面，本發(fā)明提供一種用于探測(cè)通過(guò)樣品中的一個(gè)或一個(gè)以上基因編碼的一個(gè)或一個(gè)以上核酸序列的方法，所述方法包含使所述樣品與兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸接觸，其中每一寡核苷酸在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下都能夠雜交到通過(guò)包含選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列的基因編碼的核酸序列；和探測(cè)雜交到一個(gè)或一個(gè)以上寡核苷酸的一個(gè)或一個(gè)以上核酸序列。在一方面，本發(fā)明提供一種用于探測(cè)基因表達(dá)的套組，所述套組包含微陣列與用于核苷酸雜交反應(yīng)的一個(gè)或一個(gè)以上緩沖液或試劑。從下文的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)和優(yōu)勢(shì)將顯而易見。然而應(yīng)了解，雖然指示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但詳細(xì)描述都僅以說(shuō)明方式而不是限制的方式給出。從詳細(xì)描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見。圖1.SEQIDNO30的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖2.SEQIDNO31的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖3.SEQIDNO32的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖4.SEQIDNO33的氨基酸序列。劃線部分是保守家族2糖基轉(zhuǎn)移酶域。圖5.SEQIDNO34的氨基酸序列。劃線部分是保守糖基轉(zhuǎn)移酶家族2的家族域。圖6.SEQIDNO35的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖7.SEQIDNO36的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖8.SEQIDNO37的氨基酸序列。劃線部分是保守家族2糖基轉(zhuǎn)移酶域。圖9.SEQIDNO38的氨基酸序列。劃線部分是保守核苷酸-二磷酸-糖轉(zhuǎn)移酶域。圖10.SEQIDNO39的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖11.SEQIDNO40的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖12.SEQIDNO41的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖13.SEQIDNO42的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖14.SEQIDNO43的氨基酸序列。劃線部分是保守糖基轉(zhuǎn)移酶家族2域。圖15.SEQIDNO44的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖16.SEQIDNO45的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖17.SEQIDNO46的氨基酸序列。劃線部分是保守糖苷水解酶家族2域。圖18.SEQIDNO47的氨基酸序列。劃線部分是保守糖基轉(zhuǎn)移酶家族2域。圖19.SEQIDNO48的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖20.SEQIDNO49的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域圖21.SEQIDNO50的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖22.SEQIDNO51的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖23.SEQIDNO52的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖24.SEQIDNO53的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖25.SEQIDNO54的氨基酸序列。劃線部分是保守糖基轉(zhuǎn)移酶家族2域。圖26.SEQIDNO55的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖27.SEQIDNO56的氨基酸序列。劃線部分是保守糖基轉(zhuǎn)移酶家族2域圖28.SEQIDNO57的氨基酸序列。劃線部分是保守纖維素合成酶域。圖29.SEQIDNO58的氨基酸序列。劃線部分是保守糖基轉(zhuǎn)移酶家族2域。圖30.pWVR8的載體圖。圖31.pART27的載體圖。圖32示范性微陣列采樣參數(shù)。具體實(shí)施例方式發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)適用于改變植物表型特性的新穎的經(jīng)分離的多醣合成基因和多核苷酸。發(fā)明者也已發(fā)現(xiàn)識(shí)別促成植物表型的多基因因素和操縱基因表達(dá)以影響植物表型的方法。源自商業(yè)重要的林業(yè)屬植物(松樹和桉樹)的這些基因在植物多醣合成中涉及且至少部分上負(fù)責(zé)商業(yè)木質(zhì)中重要的表型特征的表達(dá)，諸如剛性、強(qiáng)度、密度、纖維尺寸、粗糙度、纖維素與木質(zhì)素含量和提取物含量?？傮w來(lái)說(shuō)，基因和多核苷酸編碼可為纖維素合成酶、纖維素合成酶類似蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶或具有相同功能的多肽的蛋白，且本發(fā)明進(jìn)一步包括所述蛋白和多肽。本發(fā)明用于選擇多醣合成基因序列以針對(duì)操縱的方法將允許更好地設(shè)計(jì)和控制具有更高設(shè)計(jì)表型的轉(zhuǎn)基因植物?？刂粕虡I(yè)重要的林業(yè)種類中的植物架構(gòu)和農(nóng)藝學(xué)重要特點(diǎn)的能力將通過(guò)從所述方法獲得的信息來(lái)改善。除非另外指示，否則所有技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)在本文中都是以符合一般技術(shù)用法的方式來(lái)使用。通常，此描述的命名法與所描述的實(shí)驗(yàn)室程序(包括細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)和核酸化學(xué)與雜交)在所屬領(lǐng)域中分別熟知和通用。將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組核酸方法、寡核苷酸合成、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)型、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)、化學(xué)合成、化學(xué)分析與醫(yī)藥調(diào)配與傳遞。通常，根據(jù)制造商的說(shuō)明書來(lái)執(zhí)行酶反應(yīng)與純化和/或分離步驟。缺少對(duì)相反面的指示，所考慮的技術(shù)與程序根據(jù)所揭示的傳統(tǒng)方法來(lái)執(zhí)行，例如，在Sambrook等人的MolecularCloningALaboratoryManual，第二版(ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)和在JohnWiley&Sons的CurrentProtocolsinMolecularBiology(1989)中所揭示的方法。下文更詳細(xì)地討論與本發(fā)明相關(guān)的特定科學(xué)方法。然而，這個(gè)討論僅作為實(shí)例提供，且其并不限制可進(jìn)行本發(fā)明的方法的方式。A.植物多醣合成基因與蛋白1.多醣合成基因、多核苷酸與多肽序列本發(fā)明一方面涉及新穎多醣合成基因和以這些基因編碼的多肽。本發(fā)明提供新穎的植物多醣合成基因與多核苷酸和新穎的多醣合成蛋白與多肽。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，新穎的多醣合成基因與松屬或桉屬種類的野生型植物中所表達(dá)的基因相同。本發(fā)明的特定示范性新穎植物多醣合成基因序列陳述于包含輻射松(Pinusradiata)序列的表1與包含巨桉(Eucalyptusgrandis)序列的表2中。相應(yīng)的基因產(chǎn)物，即寡核苷酸和多肽，也列于表3、表4與表5中。本發(fā)明的序列具有多醣合成活性，且可編碼多醣合成中呈活性的蛋白，諸如上文討論的纖維素合成酶和纖維素合成酶類似家族的蛋白。如下文的更詳細(xì)討論，操縱多醣合成基因與多核苷酸的表達(dá)或操縱經(jīng)編碼的蛋白與多肽的活性可導(dǎo)致具有與相同種類的野生型植物的表型不同的所需表型的轉(zhuǎn)基因植物。在整個(gè)此描述中，參考多醣合成基因產(chǎn)物。如本文所使用的“多醣合成基因產(chǎn)物”是通過(guò)多醣合成基因編碼的產(chǎn)物，且包括諸如RNA的核苷酸產(chǎn)物與諸如蛋白和多肽的氨基酸產(chǎn)物。本發(fā)明的特定多醣合成基因的實(shí)例包括SEQIDNO1-29。本發(fā)明的特定多醣合成基因產(chǎn)物的實(shí)例包括通過(guò)SEQIDNO1-29的任一個(gè)編碼的產(chǎn)物。本文也參考多醣合成蛋白與多醣合成多肽。本發(fā)明的特定多醣合成蛋白和多肽的實(shí)例包括通過(guò)SEQIDNO1-29的任一個(gè)編碼的多肽，或包含SEQIDNO30-58的任一個(gè)的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的一方面是針對(duì)這些多醣合成基因與多醣合成基因產(chǎn)物的子集(即SEQID1-2、7-14、16-18、20-21、24-25和27-30、其個(gè)別保守變體(如下文所定義的術(shù)語(yǔ)))和借此編碼的核苷酸和氨基酸產(chǎn)物。本發(fā)明也包括為本文所揭示的核苷酸序列的互補(bǔ)、反向序列或反向互補(bǔ)的序列。本發(fā)明也包括本文所揭示的序列的保守變體。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“變體”是指一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸堿基對(duì)或氨基酸殘基與變體的參考序列不同的核苷酸或氨基酸序列。因此，在一方面，本發(fā)明包括保守變體多核苷酸。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“保守變體多核苷酸”是指在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交到寡核苷酸探針、在對(duì)照條件下結(jié)合到參考基因的多核苷酸，所述保守變體是所述多核苷酸的變體。因此，例如在嚴(yán)謹(jǐn)性條件下SEQIDNO1的保守變體雜交到寡核苷酸探針、在對(duì)照條件下結(jié)合到SEQIDNO1。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)序列在6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt溶液和100μg非特異性載體DNA的雜交溶液中形成雙鏈錯(cuò)合物時(shí)，認(rèn)為所述序列雜交。參見Ausubel等人，第2.9節(jié)，增刊27(1994)?！爸卸葒?yán)謹(jǐn)性”被定義為在60℃溫度、在6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt溶液和100μg非特異性載體DNA的雜交溶液中。同樣在Ausubel等人中?！案叨葒?yán)謹(jǐn)性”雜交條件是(例如)68℃、在6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt溶液和100μg非特異性載體DNA的雜交溶液中。同樣在Ausubel等人中。在中度嚴(yán)謹(jǐn)性雜交反應(yīng)后，在室溫下于2×SSC加0.05％SDS的溶液中將核苷酸沖洗5次，隨后以0.1×SSC加0.1％SDS在60℃下沖洗1小時(shí)。本發(fā)明的一方面提供展示與其個(gè)別參考序列的至少約75％的序列一致性的保守性變體多核苷酸?！靶蛄幸恢滦浴本哂屑夹g(shù)所認(rèn)知的意義，且可使用已公開的技術(shù)來(lái)計(jì)算。參見COMPUTATIONALMOLECULARBIOLOGY，Lesk編輯(OxfordUniversityPress，1988)；BIOCOMPUTINGINFORMATICSANDGENOMEPROJECTS，Smith編輯(AcademicPress，1993)；COMPUTERANALYSISOFSEQUENCEDATA，第I部分，Griffin與Griffin編輯(HumanaPress，1994)；SEQUENCEANALYSISINMOLECULARBIOLOGY，VonHeinje編輯，AcademicPress，1987；SEQUENCEANALYSISPRIMER，Gribskov與Devereux編輯(MacmillanStocktonPress，1991)；Gish等人，J.Mol.Biol.215403(1990)；Gish與States，NatureGenet.3266(1993)；Madden等人，Meth.Enzymol.266131(1996)；Altschul等人，NucleicAcidsRes.253389(1997)；和Zhang與Madden，GenomeRes.7649-656(1997)和Carillo與Lipton，SIAMJ.AppliedMath.481073(1988)。通常用于測(cè)定兩種序列之間的一致性或類似性的方法包括(但不限于)GUIDETOHUGECOMPUTERS，Bishop編輯(AcademicPress，1994)和上文的Carillo與Lipton中所揭示的那些方法。在計(jì)算機(jī)程序中編成測(cè)定一致性與類似性的方法。測(cè)定兩種序列之間的一致性與類似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括(但不限于)GCG程序包(Devereux等人，NucleicAcidsResearch12387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，J.Mol.Biol.215403(1990))和FASTDB(Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6237(1990))。本發(fā)明包括與1-29的任一個(gè)具有以下序列一致性的保守變體多核苷酸，所述序列一致性大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％。在所述變體中，變體與參考序列之間的差異可發(fā)生于參考核苷酸序列的5′或3′端位置，或發(fā)生于那些端位置之間的任意處，個(gè)別地散布于參考序列中的核苷酸中，或在參考序列內(nèi)的一個(gè)或一個(gè)以上連續(xù)組中。由于刪除與/或插入總計(jì)小于總序列長(zhǎng)度的30％，本發(fā)明所涵蓋和包涵在其內(nèi)的額外保守變體多核苷酸包括多核苷酸，所述多核苷酸包含不同于SEQIDNO1-29的多核苷酸序列或其互補(bǔ)、反向互補(bǔ)或反向序列的序列。在一實(shí)施例中，刪除與/或插入總計(jì)小于總長(zhǎng)度的20％或小于10％。本發(fā)明也包括保守變體多核苷酸，除在其主要結(jié)構(gòu)(序列)與SEQIDNO共有高度類似性之外，其具有下列特征的至少一者(i)其含有編碼多肽的開放式閱讀框架或部分開放式閱讀框架，所述多肽在多核苷酸合成中具有與通過(guò)參考多核苷酸編碼的多肽大體相同的功能特性，或(ii)其具有共同的核苷酸域或經(jīng)編碼的蛋白域。本發(fā)明包括SEQIDNO1-29的保守變體，所述保守變體編碼具有通過(guò)參考多核苷酸編碼的蛋白的酶或生物活性或結(jié)合特性的蛋白。所述保守變體是功能性變體，因?yàn)槠渚哂型ㄟ^(guò)參考多核苷酸編碼的蛋白的酶或結(jié)合活性。根據(jù)本發(fā)明，多核苷酸變體可包括“改組基因(shuffledgene)”，例如那些在(例如)美國(guó)專利第6,500,639、6,500,617、6,436,675、6,379,964、6,352,859、6,335,198、6,326,204和6,287,862號(hào)中描述的基因。本發(fā)明的核苷酸序列變體也可為如在美國(guó)專利第6,132,970號(hào)中揭示的經(jīng)修飾的多核苷酸，所述專利以引用的方式并入本文中。根據(jù)一實(shí)施例，本發(fā)明提供編碼多醣合成蛋白，諸如纖維素合成酶和纖維素合成酶類似蛋白的多核苷酸。SEQIDNO1-29提供所述多核苷酸的實(shí)例。根據(jù)另一實(shí)施例，本發(fā)明的多核苷酸編碼通過(guò)SEQIDNO1-29的任一個(gè)編碼的多肽或包含SEQIDNO30-58的任一個(gè)的多肽的催化性或蛋白結(jié)合域。本發(fā)明的多醣合成蛋白的催化性和蛋白結(jié)合域在所屬領(lǐng)域中已知。這些蛋白的保守序列在圖1-29中作為劃線文本顯示。本發(fā)明也包涵作為保守變體的多核苷酸，所述多核苷酸不同于上文所討論的序列，但由于基因碼的簡(jiǎn)并性，其編碼與通過(guò)本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽相同的多肽。本發(fā)明也包括作為保守變體的多核苷酸，所述多核苷酸包含由于不影響所編碼的多肽序列的氨基酸序列或?qū)е滤幋a的多肽序列中的保守取代的的取代而不同于上文所討論的多核苷酸序列的序列。本發(fā)明也包括通過(guò)多核苷酸編碼的經(jīng)分離的多肽，所述多核苷酸包含SEQIDNO1-29的任一個(gè)或上文所討論的其保守變體的任一個(gè)。本發(fā)明也包括包含SEQIDNO30-58的多肽和這些多肽的保守變體。根據(jù)本發(fā)明，變體多肽或蛋白是指通過(guò)增加、刪除或取代一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸來(lái)改變的氨基酸序列。本發(fā)明包括保守變體多肽。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“保守變體多肽”是指與蛋白具有類似結(jié)構(gòu)、化學(xué)或生物特性的多肽的保守變體。測(cè)定哪些氨基酸殘基可取代、插入或刪除的指導(dǎo)可使用所屬領(lǐng)域中熟知的計(jì)算機(jī)程序來(lái)找到，諸如VectorNTISuite(InforMax，MD)軟件。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，保守變體多肽展示與其個(gè)別參考序列至少約75％的序列一致性。保守變體蛋白包括多肽的“同源異構(gòu)體”或“類似物”。多肽同源異構(gòu)體和其類似物是指具有相同物理與生理學(xué)特性和相同生物功能的蛋白，但其氨基酸序列相差一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸，或其序列包括非天然氨基酸。包含由于總計(jì)小于總序列長(zhǎng)度的10％的氨基酸取代、插入與/或刪除而不同于SEQIDNO30-58的多肽序列的序列的多肽涵蓋和包涵于本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明一方面提供多醣合成中的保守變體多肽功能，如通過(guò)一個(gè)或一個(gè)以上適當(dāng)檢定(諸如下文所描述的那些適當(dāng)檢定)來(lái)測(cè)定。本發(fā)明包括為纖維素合成酶或纖維素合成酶類似蛋白的變體多肽，諸如那些可將活性葡萄糖轉(zhuǎn)化為纖維素聚合物的多肽與那些編碼具有糖基轉(zhuǎn)移酶生物活性的肽的基因。如上文所討論，本發(fā)明包括變體多核苷酸，所述變體多核苷酸編碼充當(dāng)多醣合成蛋白的多肽。多醣合成蛋白的活性與物理特性可使用所屬領(lǐng)域中已知的任何方法來(lái)檢驗(yàn)。下列檢定方法實(shí)例并非詳盡的，且可包括用于在檢驗(yàn)活性和區(qū)分多醣合成蛋白變體的蛋白特征中提供些指導(dǎo)?？扇?例如)Blanton等人，Planta180324(1990)和Blanton，Development119703(1993)中所描述評(píng)估纖維素合成酶活性。可如(例如)Stults等人，Anal.Biochem.Biophys.174151(1988)；Stults等人，Arch.Biochem.Biophys.28020-26.(1990)；Stults和Macher，Arch.Biochem.Biophys.303125(1993)；4)Crawley等人，Anal.Biochem.185112(1990)和Yan等人，Anal.Biochem.223111(1994)中所描述檢驗(yàn)糖基轉(zhuǎn)移酶活性。2.使用多醣合成基因、多核苷酸和多肽序列的方法本發(fā)明提供使用多醣合成基因和其保守變體的方法。本發(fā)明包括用于改變纖維素合成酶和纖維素合成酶類似基因的表達(dá)的方法與構(gòu)造，和/或用于以下目的的基因產(chǎn)物，所述目的包括(但不限于)(i)研究在多醣合成期間的功能與對(duì)植物表型的最終影響，和(ii)影響植物表型變化。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明包括通過(guò)改變一個(gè)或一個(gè)以上多醣合成基因的表達(dá)來(lái)修飾木質(zhì)質(zhì)量、纖維發(fā)育、細(xì)胞壁多醣含量、果實(shí)成熟和植物生長(zhǎng)與產(chǎn)量的方法和手段。本發(fā)明包含改變多醣合成基因的任一個(gè)和其上文所討論的變體的表達(dá)的方法。因此，例如本發(fā)明包含改變桉屬或松屬種類的野生型植物的基因組中所存在的多醣合成基因的表達(dá)。在一實(shí)施例中，多醣合成基因包含選自SEQIDNO1-29序列或如上文所討論的其保守變體的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明可用于改變基因表達(dá)的技術(shù)包括(但不限于)(i)過(guò)量表達(dá)基因產(chǎn)物；(ii)破壞基因轉(zhuǎn)錄，諸如破壞基因的mRNA轉(zhuǎn)錄；(iii)破壞通過(guò)基因編碼的多肽的作用，或(iv)破壞基因自身?；虍a(chǎn)物的過(guò)量表達(dá)、反義RNA、核糖酶的使用和雙鏈RNA干擾(dsRNAi)的使用是發(fā)現(xiàn)基因功能性作用和產(chǎn)生具有不同于相同種類野生型植物的表型的植物的重要技術(shù)。目標(biāo)基因的過(guò)量表達(dá)通常通過(guò)將基因或cDNA克隆為表達(dá)載體和將所述載體引入受體細(xì)胞來(lái)完成?；蛘?，過(guò)量表達(dá)可通過(guò)將外源啟動(dòng)子引入細(xì)胞中以驅(qū)動(dòng)位于基因組中的基因的表達(dá)來(lái)完成。接著可通過(guò)將經(jīng)轉(zhuǎn)型以過(guò)量表達(dá)基因的植物與未經(jīng)轉(zhuǎn)型為過(guò)量表達(dá)基因的植物相比較來(lái)評(píng)估給定基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)細(xì)胞功能、生化與/或生理學(xué)特性的影響。反義RNA、核糖酶和dsRNAi技術(shù)通常針對(duì)基因的RNA(通常為mRNA)轉(zhuǎn)錄。反義RNA技術(shù)涉及在細(xì)胞中表達(dá)或?qū)NA分子(或RNA衍生物)引入所述細(xì)胞中，所述RNA分子(或RNA衍生物)與細(xì)胞中的特定mRNA中所發(fā)現(xiàn)的序列互補(bǔ)或反義。通過(guò)與mRNA相關(guān)聯(lián)，反義RNA可抑制經(jīng)編碼的基因產(chǎn)物的翻譯。使用反義技術(shù)來(lái)降低或抑制特定植物基因表達(dá)已描述于(例如)歐洲專利公開案第271988號(hào)；Smith等人，Nature，334724-726(1988)；Smith等人，PlantMol.Biol.，14369-379(1990)中。核糖酶是具有催化性域和與特定mRNA互補(bǔ)的序列的RNA。核糖酶通過(guò)與mRNA相關(guān)聯(lián)(通過(guò)核糖酶的互補(bǔ)域)和接著使用催化性域裂解(降解)信息來(lái)發(fā)揮作用。RNA干擾(RNAi)涉及轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)調(diào)節(jié)過(guò)程，其中在不改變目標(biāo)基因自身的重新轉(zhuǎn)錄速率的情況下，特定mRNA的穩(wěn)態(tài)含量通過(guò)經(jīng)轉(zhuǎn)錄、通常經(jīng)充分處理的mRNA的特定序列降解來(lái)降低。RNAi技術(shù)已在(例如)Elibashir等人，MethodsEnzymol.26199(2002)；McManus和Sharp，NatureRev.Genetics3737(2002)；PCT申請(qǐng)案WO01/75164；Martinez等人，Cell110563(2002)；上文的Elbashir等人；Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12735(2002)；Tuschl等人，NatureBiotechnol.20446(2002)；Tuschl，Chembiochem.2239(2001)；Harborth等人，J.CellSci.1144557(2001)；等人，EMBOJ.206877(2001)；Lagos-Quintana等人，Science.2948538(2001)；Hutvagner等人，同上834；Elbashir等人，Nature.411494(2001)中討論。本發(fā)明提供DNA構(gòu)造，其包含SEQIDNO1-29或其保守變體的至少一種多核苷酸，諸如上文所討論的保守變體。所屬領(lǐng)域中已知的任一方法可用于產(chǎn)生本發(fā)明的DNA構(gòu)造。參見例如上文的Sambrook等人。本發(fā)明包括視情況包含啟動(dòng)子的DNA構(gòu)造?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域中已知的任何合適啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是結(jié)合RNA聚合酶與/或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)要素的核酸，優(yōu)選為DNA。如任一啟動(dòng)子一樣，本發(fā)明的啟動(dòng)子促進(jìn)或控制DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄，以從可可操作性地連接至啟動(dòng)子的核酸分子產(chǎn)生mRNA分子。RNA可編碼蛋白或多肽，或可編碼反義RNA分子或適用于RNAi中的分子。適用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、暫時(shí)調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子與組織優(yōu)選型啟動(dòng)子。有用的組成型植物啟動(dòng)子的實(shí)例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，其在多數(shù)植物組織中均賦予組成型、高水平表達(dá)(Odel等人，Nature313810(1985))；胭脂堿合成酶啟動(dòng)子(An等人，PlantPhysiol.88547(1988))；和章魚堿合成酶啟動(dòng)子(Fromm等人，PlantCell1977(1989))。應(yīng)注意，雖然CaMV35S啟動(dòng)子通常被稱作組成型啟動(dòng)子，但可見一些組織優(yōu)選性。不管在本發(fā)明中使用期間可展示的任何組織優(yōu)選性，本發(fā)明涵蓋CaMV35S的使用。響應(yīng)環(huán)境、激素或化學(xué)信號(hào)，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因表達(dá)。激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Baumann等人，PlantCell11323-334(1999))、細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Guevara-Garcia，PlantMol.Bio.38743-753(1998))和赤霉素響應(yīng)型啟動(dòng)子(Shi等人，PlantMol.Biol.381053-1060(1998))。另外，響應(yīng)熱、光、傷口、病原體抗性和諸如茉莉酸甲酯或水楊酸甲酯的化學(xué)物質(zhì)的啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的DNA構(gòu)造和方法中。組織優(yōu)選型啟動(dòng)子允許本發(fā)明的多核苷酸在某植物組織中優(yōu)選表達(dá)。組織優(yōu)選型啟動(dòng)子也適用于引導(dǎo)反義RNA或siRNA在某些植物組織中的表達(dá)，其可適用于抑制或完全阻塞如上文所討論的目標(biāo)基因的表達(dá)。如本文中所使用的維管植物組織是指木質(zhì)部、韌皮部或維管形成層組織。其它優(yōu)選組織包括頂端分生組織、根、種子和花朵。在一方面，本發(fā)明的組織優(yōu)選型啟動(dòng)子是“木質(zhì)部?jī)?yōu)選型”、“形成層優(yōu)選型”或“韌皮部?jī)?yōu)選型”，并優(yōu)選地分別引導(dǎo)可可操作性地連接的核酸序列在木質(zhì)部、形成層或韌皮部中的表達(dá)。在另一方面，本發(fā)明的DNA構(gòu)造包含對(duì)木質(zhì)部、形成層或韌皮部呈組織特異性的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子僅在木質(zhì)部、形成層或韌皮部中具有活性。維管優(yōu)選啟動(dòng)子在木質(zhì)部、韌皮部或形成層組織的任一個(gè)中或在所述三種組織類型中的至少兩種中優(yōu)選地具有活性。維管特異性啟動(dòng)子在木質(zhì)部、韌皮部或形成層的任一個(gè)中或在所述三種中的至少兩種中特定地具有活性。換句話說(shuō)，啟動(dòng)子僅在植物木質(zhì)部、形成層或韌皮部組織中具有活性。然而，請(qǐng)注意，由于植物中的溶質(zhì)運(yùn)輸，在表達(dá)發(fā)生后可在植物中的其它地方發(fā)現(xiàn)特定地或優(yōu)選地在組織中表達(dá)的產(chǎn)物。另外，特定多醣合成基因的啟動(dòng)子在發(fā)育第二維管結(jié)構(gòu)時(shí)可僅于形成層中表達(dá)。在形成層內(nèi)，特定多醣合成基因啟動(dòng)子可排他性地在干部或根部中表達(dá)。此外，多醣合成啟動(dòng)子可僅在春天(用于早期木質(zhì)形成)表達(dá)或僅在夏天表達(dá)。啟動(dòng)子可操作性地聯(lián)接至多核苷酸。如本文中所使用的可操作性連接是指將編碼結(jié)構(gòu)性基因的多核苷酸連接到啟動(dòng)子，以使得啟動(dòng)子控制所述結(jié)構(gòu)性基因的轉(zhuǎn)錄。如果所需多核苷酸包含編碼蛋白產(chǎn)物的序列，那么編碼區(qū)可操作性地連接到調(diào)節(jié)要素，諸如連接到啟動(dòng)子和終止子，帶來(lái)相關(guān)信使RNA轉(zhuǎn)錄物和/或通過(guò)所需多核苷酸編碼的蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。在這種情況下，多核苷酸在5′到3′定向上可操作性地連接到啟動(dòng)子，且視情況連接到終止子序列?；蛘撸景l(fā)明提供DNA構(gòu)造，其包含“反義”定向的多核苷酸，所述多核苷酸的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生可形成影響植物細(xì)胞中的內(nèi)源性多醣合成基因的表達(dá)的第二結(jié)構(gòu)的核酸。在另一變化中，DNA構(gòu)造可包含在轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生雙鏈RNA產(chǎn)物的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)錄起始與多核苷酸相關(guān)的多醣合成基因的RNA干擾。本發(fā)明的多核苷酸可定位于t-DNA內(nèi)，以使得t-DNA的左側(cè)和右側(cè)邊界序列與所述多核苷酸相接，或在多核苷酸的兩側(cè)。應(yīng)了解本發(fā)明包括DNA構(gòu)造，其包含上文所討論的任何多核苷酸的一個(gè)或一個(gè)以上。因此，例如構(gòu)造可包含t-DNA，所述t-DNA包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或更多個(gè)多核苷酸。本發(fā)明也包括包含啟動(dòng)子的DNA構(gòu)造，所述啟動(dòng)子包括一個(gè)或一個(gè)以上調(diào)節(jié)要素?；蛘?，本發(fā)明包括包含與啟動(dòng)子分離的調(diào)節(jié)要素的DNA構(gòu)造。調(diào)節(jié)要素賦予啟動(dòng)子區(qū)許多重要特征。某些要素結(jié)合增強(qiáng)可操作性連接的核酸轉(zhuǎn)錄速率的轉(zhuǎn)錄因子。其它要素結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄活性的抑制子。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子活性的影響可測(cè)定啟動(dòng)子活性高低，即啟動(dòng)子是“強(qiáng)”還是“弱”。本發(fā)明的DNA構(gòu)造可包括用作適用于識(shí)別和選擇經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞或植物的可選擇標(biāo)記的核苷酸序列。所述標(biāo)記的實(shí)例包括(但不限于)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptll)基因(Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.199183-188(1985))，其賦予卡那霉素抗性。細(xì)胞表達(dá)nptll基因可使用適當(dāng)?shù)目股?諸如卡那霉素或G418)來(lái)選擇。其它通用的可選擇標(biāo)記包括突變型EPSP合成酶基因(Hinchee等人，Bio/Technology6915-922(1988))，其賦予草甘膦抗性；和突變型乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，其賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(歐洲專利申請(qǐng)案第154,204號(hào))。本發(fā)明也包括包含上文所討論的DNA構(gòu)造的載體。所述載體可包括特定宿主細(xì)胞的復(fù)制(復(fù)制子)起點(diǎn)。各種原核復(fù)制子已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知，且用于引導(dǎo)自主復(fù)制和維持原核宿主細(xì)胞中的重組分子。舉例來(lái)說(shuō)，pMON530是基于土壤桿菌(Agrobacterium)的植物轉(zhuǎn)型載體，對(duì)于用于雙子葉植物轉(zhuǎn)型來(lái)說(shuō)，pMON530是質(zhì)體載體(Rogers等人，″Improvedvectorsforplanttransformationexpressioncassettevectorsandnewselectablemarkers.，″在R.Wu和L.Grossman編輯的METHODSINENZYMOLOGY.中，第253至277頁(yè)。SanDiegoAcademicPress)。其它有用的質(zhì)體是pMON530、pMON505的衍生物，其通過(guò)將pMON316的2.3kbStul-Hindlll片段轉(zhuǎn)移入pMON526中來(lái)制備。質(zhì)體pMON526是pMON505的簡(jiǎn)單衍生物，其中通過(guò)以Xmal消化、以Klenow聚合酶處理和連接來(lái)移除Smal部位。雖然質(zhì)體pMON530保留pMON505和CaMV35S-NOS表達(dá)盒的所有特性，但其在啟動(dòng)子與多腺苷酸信號(hào)之間含有Smal的獨(dú)特裂解部位。二元載體pMON505是pMON200的衍生物(上文的Rogers等人)，其中Ti質(zhì)體同源區(qū)LIH以小型RK2質(zhì)體pTJS75的3.8kbHindlll到Smal區(qū)段替代(Schmidhauser和Helinski.(1985)J.Bacteriol.164-155)。這個(gè)區(qū)段含有用于使用三親本配對(duì)程序結(jié)合入土壤桿菌中的RK2復(fù)制起點(diǎn)oriV和轉(zhuǎn)移起點(diǎn)-oriT。Horsch和Klee.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，834428(1986)。質(zhì)體pMON505保留pMON200的所有重要特征，包括用于插入所需DNA片段的合成多連接子、植物細(xì)胞中用于卡那霉素抗性的嵌合NOS/NPTII′/NOS基因、用于在大腸桿菌與根癌土壤桿菌中選擇的壯觀霉素/鏈霉素抗性決定子、用于易于轉(zhuǎn)化株劃線和子代中遺傳的完整胭脂堿合成酶基因和用于在大腸桿菌中易于制造大量載體的pBR322復(fù)制起點(diǎn)。質(zhì)體pMON505含有源自pTiT37胭脂堿類型T-DNA的右端的單一T-DNA邊界物。南方轉(zhuǎn)漬分析(Southernblotanalyse)證明質(zhì)體pMON505和其攜帶的任一DNA整合入植物基因組中，即整個(gè)質(zhì)體是插入植物基因組的T-DNA。經(jīng)整合的DNA的一末端位于右邊界序列與胭脂堿合成酶基因之間，且另一末端位于邊界序列與pBR322序列之間。尤其有用的Ti質(zhì)體盒載體是pMON17227。這個(gè)載體描述于WO92/04449中，且含有編碼賦予草甘膦抗性的酶的基因(命名為CP4)，其是包括馬鈴薯和西紅柿的許多植物的優(yōu)良選擇標(biāo)記基因。所述基因融合到阿布屬EPSPS葉綠體輸送肽(CTP2)，且其表達(dá)通過(guò)選擇啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)。在一實(shí)施例中，本發(fā)明利用如圖30所示的pWVR8載體或如Gleave，PlantMol.Biol.，201203-27(1992)中所描述和圖31中所示的pART27。本發(fā)明也提供以本發(fā)明的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的宿主細(xì)胞。如本文中所使用的宿主細(xì)胞是指本發(fā)明的多核苷酸在其中表達(dá)的細(xì)胞。因此，宿主細(xì)胞可為個(gè)別細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或?yàn)橛袡C(jī)體一部分的細(xì)胞。宿主細(xì)胞也可為胚胎、胚乳、精子或卵細(xì)胞或受精卵的一部分。在一實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明的DNA構(gòu)造的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明包括為被子植物或裸子植物的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的DNA構(gòu)造可用于轉(zhuǎn)型多種植物，單子葉植物(例如草、玉米、玉米、燕麥、小麥與大麥)、雙子葉植物(例如阿布屬、煙草、豆類、紫花苜蓿、橡樹、桉樹、楓樹)和裸子植物((例如，蘇格蘭松；參見Aronen，F(xiàn)innishForestRes.Papers，第595卷，1996)、白云杉(Ellis等人，Biotechnology1184-89，1993)和落葉松(Huang等人，InVitroCell27201-207，1991))。所述植物也包括草坪、小麥、玉米、水稻、糖用甜菜、馬鈴薯、西紅柿、萵苣、胡蘿卜、草莓、木薯、甘薯、天竺葵、大豆與各種類型的木質(zhì)植物。木質(zhì)植物包括樹，諸如棕櫚橡樹、松樹、楓樹、冷杉、蘋果樹、無(wú)花果樹、李子樹和阿拉伯膠樹。木質(zhì)植物也包括玫瑰和葡糖藤。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的DNA構(gòu)造用于轉(zhuǎn)型木質(zhì)植物，即樹干存活多年且每年通過(guò)增加木質(zhì)組織來(lái)增加直徑的樹木或灌木。本發(fā)明包括轉(zhuǎn)型植物的方法，所述植物包括商業(yè)林業(yè)工業(yè)中重要的桉樹和松樹種類，諸如選自由巨桉與其雜交類和火炬松(Pinustaeda)組成的群組的植物，以及經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物和從其獲得的木質(zhì)和木漿。合適植物的其它實(shí)例包括那些選自由以下各植物組成的群組的植物北美短葉松(Pinusbanksiana)、塞埔路斯松(Pinusbrutia)、加勒比松(Pinuscaribaea)、砂地松(Pinusclausa)、扭葉松(Pinuscontorta)、大果松(Pinuscoulteri)、萌芽松(Pinusechinata)、Pinuseldarica、濕地松(Pinusellioti)、黑材松(Pinusjeffreyi)、糖松(Pinuslambertiana)、馬尾松(Pinusmassoniana)、西部白松(Pinusmonticola)、歐洲黑松(Pinusnigra)、長(zhǎng)葉松(Pinuspalustris)、海岸松(Pinuspinaster)、美國(guó)黃松(Pinusponderosa)、輻射松(Pinusradiata)、多脂松(Pinusresinosa)、剛松(Pinusrigida)、沼松(Pinusserotina)、北美喬松(Pinusstrobus)、歐洲赤松(Pinussylvestris)、火炬松(Pinustaeda)、矮松(Pinusvirginiana)、太平洋銀冷杉(Abiesamabilis)、膠冷杉(Abiesbalsamea)、科羅拉多冷杉(Abiesconcolor)、北美冷杉(Abiesgrandis)、高山冷杉(Abieslasiocarpa)、加州紅冷杉(Abiesmagnifica)、壯麗冷杉(Abiesprocera)、美國(guó)扁柏(Chamaecyparislawsoniona)、黃扁柏(Chamaecyparisnootkatensis)、美國(guó)尖葉扁柏(Chamaecyparisthyoides)、東方紅柏(Juniperusvirginiana)、歐洲落葉松(Larixdecidua)、美洲落葉松(Larixlaricina)、日本落葉松(Larixleptolepis)、西部落葉松(Larixoccidentalis)、西伯利亞落葉松(Larixsiberica)、翠柏(Libocedrusdecurrens)、挪威云杉(Piceaabies)、白香云杉(Piceaengelmanni)、白云杉(Piceaglauca)、黑云杉(Piceamariana)、北美云杉(Piceapungens)、紅云杉(Picearubens)、西加云杉(Piceasitchensis)、北美黃杉(Pseudotsugamenziesii)、巨杉(Sequoiagigantea)、北美紅杉(Sequoiasempervirens)、落羽杉(Taxodiumdistichum)、加拿大鐵杉(Tsugacanadensis)、西部鐵杉(Tsugaheterophylla)、高山鐵杉(Tsugamertensiana)、北美香柏(Thujaoccidentalis)與北美喬柏(Thujaplicata)、白桉(Eucalyptusalba)、Eucalyptusbancroftii、葡萄桉(Eucalyptusbotryoides)、蘋果按(Eucalyptusbridgesiana)、美葉桉(Eucalyptuscalophylla)、赤桉(Eucalyptuscamaldulensis)、檸檬桉(Eucalyptuscitriodora)、Eucalyptuscladocalyx、聚果桉(Eucalyptuscoccifera)、Eucalyptuscurtisii、山桉(Eucalyptusdalrympleana)、粗皮桉(Eucalyptusdeglupta)、Eucalyptusdelagatensis、異色桉(Eucalyptusdiversicolor)、鄧恩桉(Eucalyptusdunnii)、紅花桉(Eucalyptusficifolia)、藍(lán)桉(Eucalyptusglobulus)、Eucalyptusgomphocephala、古尼桉(Eucalyptusgunnii)、香果桉(Eucalyptushenryi)、銀頂纖皮桉(Eucalyptuslaevopinea)、毛皮桉(Eucalyptusmacarthurii)、Eucalyptusmacrorhyncha、斑皮桉(Eucalyptusmaculata)、紅柳桉(Eucalyptusmarginata)、Eucalyptusmegacarpa、蜜味桉(Eucalyptusmelliodora)、Eucalyptusnicholii、亮果桉(Eucalyptusnitens)、Eucalyptusnova-angelica、斜葉桉(Eucalyptusobliqua)、Eucalyptusoccidentalis、Eucalyptusobtuslflora、Eucalyptusoreades、少花桉(Eucalyptuspauciflora)、多苞葉桉(Eucalyptuspolybractea)、王桉(Eucalyptusregnans)、樹脂桉(Eucalyptusresinifera)、大葉桉(Eucalyptusrobusta)、野桉(Eucalyptusrudis)、柳桉(Eucalyptussaligna)、Eucalyptussideroxylon、Eucalyptusstuartiana、細(xì)葉桉(Eucalyptustereticornis)、毛葉桉(Eucalyptustorelliana)、果桉(Eucalyptusurnigera)、尾葉桉(Eucalyptusurophylla)、多枝桉(Eucalyptusviminalis)、Eucalyptusviridis、鞣桉(Eucalyptuswandoo)和Eucalyptusyoumanni。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“植物”也希望包括植物的果實(shí)、種子、花朵、球果等等。本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)型植物可為直接轉(zhuǎn)染子，其意謂DNA構(gòu)造諸如通過(guò)土壤桿菌直接引入植物中，或所述植物可為經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物的子代。第二或隨后代植物可通過(guò)有性生殖(即受精)來(lái)產(chǎn)生。此外，植物可為配子體(單倍體階段)或孢子體(雙倍體階段)。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“植物組織”包括植物的任一部分，包括植物細(xì)胞。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、愈傷、胚胎、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉、種子與小孢子。植物組織可在液體或固體培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，或在土壤或在盆、溫室或田地里的合適媒介中生長(zhǎng)。如本文中所使用的“植物組織”也指無(wú)論有性產(chǎn)生還是無(wú)性產(chǎn)生的植物、種子、子代或繁殖體的克隆體與任一這些的后代，諸如插枝或種子。根據(jù)本發(fā)明的一方面，已以本發(fā)明的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的轉(zhuǎn)基因植物具有不同于未以DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物的表型。如本文中所使用的“表型”是指植物的可區(qū)分特征或特點(diǎn)，其可根據(jù)本發(fā)明通過(guò)將本發(fā)明的一個(gè)或一個(gè)以上DNA構(gòu)造整合入植物的至少一個(gè)植物細(xì)胞的基因組來(lái)改變。DNA構(gòu)造通過(guò)修飾經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞或作為一個(gè)整體的植物的許多基因、分子、生化、生理學(xué)、形態(tài)學(xué)或農(nóng)藝學(xué)特點(diǎn)或特性中的任一個(gè)或一個(gè)以上，可使經(jīng)轉(zhuǎn)型植物的表型具有變化。舉例來(lái)說(shuō)，已顯示在植物生長(zhǎng)中涉及纖維素合成酶類似蛋白。(Favery等人，GenesDev.1579(2001))。因此，可通過(guò)改變一個(gè)或一個(gè)以上多醣合成基因的表達(dá)來(lái)改變植物中多醣含量，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長(zhǎng)。植物細(xì)胞生長(zhǎng)通過(guò)松弛植物細(xì)胞壁與由于植物細(xì)胞的膨脹壓力而造成的擴(kuò)張來(lái)實(shí)現(xiàn)。植物細(xì)胞壁松弛與細(xì)胞膨脹壓力間的關(guān)系使得較松弛細(xì)胞壁要求用以擴(kuò)張的較少膨脹壓力，而較堅(jiān)硬細(xì)胞壁則要求用以擴(kuò)張的較多膨脹壓力。以這種方式，本發(fā)明的多核苷酸可用于調(diào)節(jié)多醣合成水平，并且因此介導(dǎo)植物生長(zhǎng)。類似地，在干旱或壓力條件下，植物細(xì)胞的膨脹壓力與多醣合成水平均下降。Ray，Curr.TopicsinPlantBiochem.&Phys1118-41(1992)。因此，低膨脹壓力與細(xì)胞壁強(qiáng)度之間的相互影響阻止或減緩生長(zhǎng)。因此，通過(guò)改變多醣基因表達(dá)而增加多醣合成將允許植物細(xì)胞壁松弛，并且允許在導(dǎo)致膨脹壓力下降的條件下生長(zhǎng)，例如干旱條件。此外，壓力響應(yīng)啟動(dòng)子的使用將允許本發(fā)明多醣合成酶的經(jīng)調(diào)節(jié)表達(dá)(參見美國(guó)專利號(hào)美國(guó)5,891,859；美國(guó)專利號(hào)5,929,305；美國(guó)專利號(hào)5,965,705；美國(guó)專利號(hào)5,892,009)。在一實(shí)施例中，經(jīng)本發(fā)明的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物可產(chǎn)生的表型包括(但不限于)以下各表型的任一個(gè)或一個(gè)以上干旱耐受性增加、除草劑抗性、高度減小或增大、分枝減少或增多、冷凍或霜耐受性增強(qiáng)、生命力改善、色彩增強(qiáng)、健康與營(yíng)養(yǎng)特征增強(qiáng)、儲(chǔ)藏改善、產(chǎn)率提高、鹽耐受性增強(qiáng)、木質(zhì)腐爛抗性增強(qiáng)、真菌疾病抗性增強(qiáng)、蟲害吸引力改變、疾病耐受性增大、昆蟲耐受性增大、水壓耐受性增大、質(zhì)地改善、發(fā)芽率增大、微量營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量增大、新穎樹脂產(chǎn)生和新穎蛋白或多肽產(chǎn)生。在另一實(shí)施例中，當(dāng)與相同種類的未經(jīng)所述DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物相比時(shí)，所述植物展示選自由以下各特點(diǎn)組成的群組的一個(gè)或一個(gè)以上特點(diǎn)形成反應(yīng)性木質(zhì)傾向、不成熟期降低、不成熟期增加、自我脫落分枝、生殖發(fā)育加速或生殖發(fā)育延遲。在另一實(shí)施例中，在植物對(duì)照例中不同的表型包括下列的一個(gè)或一個(gè)以上木質(zhì)素質(zhì)量、木質(zhì)素結(jié)構(gòu)、木質(zhì)組成、木質(zhì)外觀、木質(zhì)密度、木質(zhì)強(qiáng)度、木質(zhì)剛性、纖維素聚合性、纖維尺寸、內(nèi)腔大小、花冠比例、導(dǎo)管分子比例、其它植物組份、植物細(xì)胞分裂、植物細(xì)胞發(fā)育、單位面積的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、細(xì)胞壁組成、木質(zhì)形成速率、木質(zhì)審美外觀、干缺陷形成、平均微纖維角度、S2細(xì)胞壁層寬度、生長(zhǎng)速率、根的根形成速率與分枝植物發(fā)育的比、葉面積指數(shù)和葉形狀?？赏ㄟ^(guò)合適方法評(píng)估表型?？苫谄渫ㄓ眯螒B(tài)學(xué)評(píng)估植物。轉(zhuǎn)基因植物可用裸眼觀測(cè)、稱重及測(cè)量其高度。可通過(guò)分離植物組織的個(gè)別層，即韌皮部與形成層檢驗(yàn)植物，其進(jìn)一步劃分為分生組織細(xì)胞、早期擴(kuò)張、晚期擴(kuò)張、第二壁形成和晚期細(xì)胞成熟。參見，例如上文的Hertzberg。也可以使用顯微鏡分析或化學(xué)分析評(píng)估植物。顯微鏡分析包括檢查細(xì)胞類型、發(fā)育階段、組織與細(xì)胞攝入的色素。纖維形態(tài)(諸如纖維壁厚度和木漿纖維的微纖維角度)可使用(例如)顯微鏡透射橢圓偏光法觀測(cè)。參見Ye與Sundstrom，TappiJ.，80181(1997)。濕木質(zhì)與未砍伐的樹的木質(zhì)強(qiáng)度、密度和顆粒傾角可通過(guò)結(jié)合多變量分析測(cè)量可見與近紅外光譜數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)定。參見美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第2002/0107644和2002/0113212號(hào)。內(nèi)腔大小可使用掃描電顯微鏡測(cè)量。如Marita等人，.J.Chem.Soc，PerkinTrans.I2939(2001)中所描述，可使用核磁共振譜觀測(cè)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)。木質(zhì)素、纖維素、糖類和其它植物提取物的生化特點(diǎn)可通過(guò)已知的任何標(biāo)準(zhǔn)分析法評(píng)估，包括分光光度測(cè)量法、熒光光譜法、HPLC、質(zhì)譜法和組織染色法。如本文中所使用的“轉(zhuǎn)型”是指將核酸插入植物細(xì)胞的基因組的過(guò)程。所述插入包涵穩(wěn)態(tài)引入細(xì)胞并轉(zhuǎn)送到子代。轉(zhuǎn)型也指核酸瞬間插入，其中所得轉(zhuǎn)化株瞬間表達(dá)核酸。使用所屬領(lǐng)域中已知的各種方法，轉(zhuǎn)型可在自然或人工條件下發(fā)生(參見例如Glick和Thompson編輯，METHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGY，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)la.(1993))?？赏ㄟ^(guò)將核酸序列插入原核或真核宿主細(xì)胞的任何已知方法達(dá)成所述轉(zhuǎn)型，包括土壤桿菌調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)型法(參見例如Horsch等人，Science，2271229-31(1985))、病毒感染、晶須、電穿孔(參見例如Rhodes等人，Science240(4849)204-207(1988))、顯微注射、聚乙二醇處理(參見例如Lyznik等人，PlantMol.Biol.13151-161(1989))、熱電擊、脂肪生成和粒子轟擊(參見例如Klein等人，PlantPhysiol.91440-444(1989)和Boynton等人，Science240(4858)1534-1538(1988))。轉(zhuǎn)型也可使用如(例如)Svab等人，Proc.NatlAcad.Sci.878526-30(1990)中所描述的葉綠體轉(zhuǎn)型方法來(lái)完成。植物轉(zhuǎn)型方法描述于(例如)美國(guó)專利第5,159,135(棉花)、5,981,840(玉米)、5,914,451(大豆)和WO00/12715(桉樹)號(hào)中，所述專利以全文引用的方式并入本文中。其它植物轉(zhuǎn)型方法和技術(shù)于在Birch，R.G.，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48297(1997)和Forester等人，Exp.Agric.3315-33(1997)中評(píng)論，并且以全文引用的方式并入本文中。所屬領(lǐng)域中已熟知轉(zhuǎn)型樹種的方法。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，桉樹移植植物的基因型依賴性轉(zhuǎn)型和轉(zhuǎn)基因子代的產(chǎn)生可通過(guò)使用土壤桿菌的轉(zhuǎn)型來(lái)完成。移植樹可(雖然不需)在轉(zhuǎn)型前于預(yù)培養(yǎng)基上收獲和培養(yǎng)。盡管預(yù)培養(yǎng)基并非必要，但這個(gè)培養(yǎng)基的使用可增加轉(zhuǎn)型效率和植物再生。預(yù)培養(yǎng)基是轉(zhuǎn)型前在其上可以土壤桿菌培養(yǎng)移植植物的營(yíng)養(yǎng)基?？墒褂萌魏晤A(yù)培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間段。預(yù)培養(yǎng)基含有土壤桿菌誘導(dǎo)子，諸如乙酰丁香酮。預(yù)培養(yǎng)基視情況含有植物生長(zhǎng)操縱子，包括植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。預(yù)培養(yǎng)基可通過(guò)使用合適鹽媒介來(lái)制備，包括(但不限于)Woody植物媒介(WPM)鹽(Lloyd和McCown，CombinedProceedingsoftheInternationalPlantPropagatorsSociety，30421-427，1980)、Murashige和Skoog媒介(SigmaAldrich，St.Louis，MO)或Lepoivre媒介。預(yù)培養(yǎng)基可含有土壤桿菌誘導(dǎo)子，諸如(例如)乙酰丁香酮。預(yù)培養(yǎng)基視情況可含有植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，或既含有植物生長(zhǎng)素也含有細(xì)胞分裂素。下文顯示示范性植物預(yù)培養(yǎng)基。在這個(gè)轉(zhuǎn)型方法中，可將移植植物在黑暗中、于預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)4天。經(jīng)誘導(dǎo)的土壤桿菌培養(yǎng)物可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)制備。將所述經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物應(yīng)用于移植植物。移植植物可通過(guò)將土壤桿菌培養(yǎng)物應(yīng)用到移植、真空滲入、花浸蘸法等來(lái)轉(zhuǎn)型。在轉(zhuǎn)型后，經(jīng)土壤桿菌培養(yǎng)物處理的移植植物可與土壤桿菌在光照或黑暗條件下共培養(yǎng)2到10天。在一實(shí)施例中，所述移植植物以土壤桿菌在光照或黑暗條件下共培養(yǎng)4天。在共培養(yǎng)后，可將移植植物轉(zhuǎn)移到具有400mg/L提門叮的再生媒介中。在轉(zhuǎn)移到選擇性媒介之前，移植植物可在再生媒介上培養(yǎng)。在一實(shí)施例中，將移植植物在再生媒介上培養(yǎng)4天?？墒褂萌魏魏线m的選擇性媒介。在一實(shí)施例中，選擇性媒介是經(jīng)提門叮和除草劑選擇性試劑補(bǔ)充的再生媒介。下表提供示范性再生媒介。1升媒介中的組份KNO31NH4H2PO40.25MgSO47H2O0.25CaCl2.2H2O0.10FeSO4.7H2O0.0139Na2EDTA.2H2O0.01865MES(Duchefa，m1501)600.0MS微量鹽(1/2濃度)MnSO4.H2O0.00845ZnSO4.7H2O0.0043CuSO4.5H2O0.0000125CoCl2.6H2O0.0000125KI0.000415H3BO30.0031Na2MoO4.2H2O0.000125玉米素NAA(萘乙酸)葡萄糖/蔗糖20.0肌醇0.100煙堿酸0.010硫胺0.010泛酸鈣0.001維生素B60.001生物素0.00001抗壞血酸維生素C0.050L-谷氨酰胺0.1精氨酸0.0258氨基乙酸0.00199賴氨酸0.0508甲硫氨酸0.0132苯基丙氨酸0.0257絲氨酸0.00904蘇氨酸0.00852色氨酸0.0122酪氨酸0.0127水晶凝膠3.0經(jīng)過(guò)選擇而存活的幼苗塊保持在含有除草劑和提門叮的再生媒介上?？蓪⒂酌鐗K轉(zhuǎn)移直到幼苗激增并且開始伸長(zhǎng)。在一實(shí)施例中，幼苗塊每3周轉(zhuǎn)移一次。使用任何報(bào)導(dǎo)基因，諸如(例如)GFP、熒光素酶或GUS。在一實(shí)施例中，可執(zhí)行GUS染色以監(jiān)測(cè)土壤桿菌感染頻率，及確保經(jīng)選擇的幼苗不是野生體或嵌合體?？蓪⒃偕酌绲娜~和干組織染色，用以在幼苗發(fā)育后立即表達(dá)報(bào)導(dǎo)基因。舉例來(lái)說(shuō)，為測(cè)定GUS活性，移植植物可在包含100mM磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)、0.05％的二甲基亞砜、0.05％的曲拉通X-100、10mM的EDTA、0.5mM的亞鐵氰化鉀和1.5mg/ml的5-溴-4-氯-3-碘-D-葡萄糖苷酸(X-gluc)的基質(zhì)中培育。接著使移植植物經(jīng)受10分鐘真空，然后在37℃培養(yǎng)隔夜，再對(duì)GUS變異區(qū)計(jì)數(shù)。根據(jù)另一實(shí)施例，松樹的轉(zhuǎn)型可使用美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第2002/0100083號(hào)中描述的方法來(lái)完成。本發(fā)明另一方面提供從經(jīng)本發(fā)明的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物獲得木質(zhì)與/或制造木漿的方法。上文提供制造轉(zhuǎn)基因植物的方法，且其在所屬領(lǐng)域中已知。經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物可在任何合適的條件下培養(yǎng)或生長(zhǎng)。舉例來(lái)說(shuō)，松樹可按照美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第2002/0100083號(hào)中所描述的培養(yǎng)并生長(zhǎng)。桉樹可按照(例如)Rydelius等人在MechanizationinShortRotation，IntensiveCultureForestryConference，Mobile，AL，1994提出的“GrowingEucalyptusforPulpandEnergy”來(lái)培養(yǎng)和生長(zhǎng)。木材和木漿可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的任何方法從所述植物獲得。如上文所注，根據(jù)本發(fā)明獲得的木材或木漿可證明經(jīng)改善的特點(diǎn)，其包括(但不限于)下列的任一個(gè)或一個(gè)以上木質(zhì)素組成、木質(zhì)素結(jié)構(gòu)、木質(zhì)組成、纖維素聚合性、纖維素尺寸、纖維與其它植物組分的比例、植物細(xì)胞分裂、植物細(xì)胞發(fā)育、單位面積細(xì)胞的數(shù)量、細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、細(xì)胞壁組成、木質(zhì)形成速率、木材審美外觀、干缺陷形成、生長(zhǎng)速率、根的根形成速率與分枝植物發(fā)育速率的比、葉面積指數(shù)，并且葉形包括木質(zhì)素含量增加或降低、木質(zhì)素對(duì)化學(xué)處理可達(dá)性增加、木質(zhì)素反應(yīng)性提高、纖維素含量增加或降低、空間穩(wěn)定性增加、拉伸強(qiáng)度增加、剪切強(qiáng)度增加、壓縮強(qiáng)度增加、電擊抗性增加、剛性增加、硬度增加或降低、螺旋性降低、收縮性降低與重量、密度和比重的差異。B.多醣合成基因的表達(dá)圖譜本發(fā)明也提供執(zhí)行多醣合成基因表達(dá)圖譜的方法和手段。表達(dá)圖譜在測(cè)定基因是經(jīng)轉(zhuǎn)錄基因還是經(jīng)翻譯基因，比較特定基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平、基因型分類、評(píng)估DNA復(fù)制數(shù)目、測(cè)定后裔一致性、測(cè)量mRNA衰退速率、識(shí)別蛋白結(jié)合位置、測(cè)定基因產(chǎn)物的子細(xì)胞位置、將基因表達(dá)與表型或其它現(xiàn)象相關(guān)聯(lián)、并測(cè)定操縱特定基因?qū)ζ渌虻挠绊懼惺怯幸娴摹１磉_(dá)圖譜對(duì)于識(shí)別復(fù)雜、多基因情況下的基因表達(dá)尤其有益。由于這個(gè)原因，表達(dá)圖譜在將多醣合成基因表達(dá)關(guān)聯(lián)至植物表型和植物組織的形成中有益，并在將其相互關(guān)系關(guān)聯(lián)至多醣生物合成中有益。僅小部分植物多醣合成基因在給定時(shí)間給定組織樣品中表達(dá)，并且所有的表達(dá)基因均可能不影響植物表型。為識(shí)別能夠影響有關(guān)表型的基因，本發(fā)明提供用于測(cè)定(例如)植物發(fā)育中給定點(diǎn)的多醣合成基因表達(dá)圖譜，和用于測(cè)定給定組織樣品中多醣合成基因表達(dá)圖譜的方法和手段。本發(fā)明也提供用于識(shí)別表達(dá)可被操縱以改變植物表型的多醣合成基因的方法和手段。在支援這些方法中，本發(fā)明也提供區(qū)分相同家族的不同基因的表達(dá)的方法和手段，例如區(qū)別纖維素合成酶或纖維素合成酶類似蛋白的方法和手段。如本文中所使用的“基因表達(dá)”是指DNA序列至RNA序列的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，接著RNA翻譯成可或不可經(jīng)歷翻譯后處理的蛋白，。因此，植物表型與多醣合成基因表達(dá)之間的關(guān)系可通過(guò)定量或定性地探測(cè)RNA或蛋白含量的變化來(lái)觀測(cè)。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“生物活性”包括(但不限于)蛋白基因產(chǎn)物活性，所述蛋白基因產(chǎn)物活性包括酶活性，諸如糖基轉(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明提供在這些表達(dá)圖譜方法中有益的寡核苷酸。在一組給定條件下，每一寡核苷酸都能夠雜交到多醣合成基因或基因產(chǎn)物。本發(fā)明的一方面提供復(fù)數(shù)種寡核苷酸，其中在一組給定條件下，每一寡核苷酸都能夠雜交到不同多醣合成基因產(chǎn)物。本發(fā)明的寡核苷酸實(shí)例包括SEQIDNO59-83。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每一SEQIDNO59-83的寡核苷酸雜交到SEQIDNO1-29中的一種的不同基因產(chǎn)物。本發(fā)明的寡核苷酸在以上文所描述的方法中的任一個(gè)測(cè)定一個(gè)或一個(gè)以上多醣合成基因表達(dá)時(shí)有益。1.細(xì)胞、組織、核酸與蛋白樣品本發(fā)明的方法中所使用的樣品可從植物組織中獲得。合適的植物組織包括(但不限于)體細(xì)胞胚、花粉、葉、干、愈傷、匍匐枝、微型薯、幼苗、木質(zhì)部、malestrolbili、花粉球花、維管組織、頂端分生組織、維管形成層、木質(zhì)部、根、花朵和種子。根據(jù)本發(fā)明，“植物組織”按照本文中先前所描述來(lái)使用。植物組織可從上文描述的任意植物類型或種類獲得。根據(jù)本發(fā)明的一方面，樣品可從不同發(fā)育階段的植物組織獲得，從一年中不同時(shí)間的植物組織獲得(例如春天對(duì)夏天)，從經(jīng)受不同環(huán)境條件(例如光和溫度變化)的植物組織獲得和/或從不同植物組織和細(xì)胞類型獲得。根據(jù)一實(shí)施例，植物組織在成熟的多個(gè)階段中和一年中不同季節(jié)時(shí)獲得。在另一實(shí)施例中，植物組織從顯示不同表型的植物中獲得。舉例來(lái)說(shuō)，植物組織可從干分裂細(xì)胞、分化型木質(zhì)部、早期發(fā)育木質(zhì)細(xì)胞、分化型早期木質(zhì)細(xì)胞和分化型晚期木質(zhì)細(xì)胞收集。作為另一實(shí)例，可將在從具有發(fā)育木質(zhì)的植物獲得的樣品中的基因表達(dá)與從不具有發(fā)育木質(zhì)的植物獲得的樣品中的基因表達(dá)相比較。作為另一實(shí)例，可將從顯示反應(yīng)性木質(zhì)表型的植物獲得的樣品中的基因表達(dá)與從不具備反應(yīng)性木質(zhì)的植物獲得的樣品中的基因表達(dá)相比較。分化木質(zhì)部包括從反應(yīng)性木質(zhì)獲得的樣品。反應(yīng)性木質(zhì)包括壓縮木質(zhì)、邊木和正常垂直木質(zhì)部。已知從松樹和桉樹獲得用于表達(dá)圖譜的樣品的方法。參見例如Allona等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.959693-8(1998)和Whetton等人，PlantMol.Biol.47275-91，和Kirst等人，Int′lUnionofForestryResearchOrganizationsBiennialConference，S6.8(2003年6月，Umea，Sweden)。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，將一種類型植物組織中的基因表達(dá)與不同類型組織中的基因表達(dá)相比較，或與不同發(fā)育階段的相同類型組織中的基因表達(dá)相比較。也可比較在一年中多個(gè)時(shí)間(不同季節(jié))采集的一種類型組織基因中的基因表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，可將不成熟的第二木質(zhì)部中的基因表達(dá)與成熟期第二木質(zhì)部中的基因表達(dá)相比較。類似地，可將形成層中的基因表達(dá)與木質(zhì)部中的基因表達(dá)相比較。另外，可將頂端分生組織中的基因表達(dá)與形成層的基因表達(dá)相比較。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，從具有特定表型的植物獲得樣品，并且將所述樣品中的基因表達(dá)與從相同種類但不具有所述表型的植物獲得的樣品中的基因表達(dá)相比較。舉例來(lái)說(shuō)，可從顯示快速生長(zhǎng)的植物獲得樣品，并且基因表達(dá)可與從顯示正常或慢速生長(zhǎng)的植物獲得的樣品中的基因表達(dá)相比較。從這種比較識(shí)別的不同表達(dá)基因可與生長(zhǎng)速率相關(guān)聯(lián)，且因此對(duì)于操縱生長(zhǎng)速率有益。在另一實(shí)施例中，從克隆繁殖植物獲得樣品。在一實(shí)施例中，克隆繁殖植物是松屬或桉屬種類。來(lái)自相同基因型的個(gè)別無(wú)性系分株可在一年中的不同時(shí)間砍伐。因此，對(duì)于任何基因型都有至少兩個(gè)遺傳一致的樹木被砍伐，一個(gè)在季節(jié)初期而另一個(gè)在季節(jié)晚期。這些樹木的每一個(gè)都可劃分為不成熟期(頂部)到成熟期(底部)樣品。另外，組織樣品可以至少5層剝皮分為(例如)韌皮部到木質(zhì)部?？稍u(píng)估每一這些樣品的表型和基因表達(dá)。參見圖32。其中細(xì)胞組份可能干擾分析技術(shù)，諸如雜交探測(cè)、酶探測(cè)、配體結(jié)合探測(cè)或生物活性探測(cè)，可能需要從這些細(xì)胞組份分離基因產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)所屬領(lǐng)域中已知的任何方法將包括核酸和氨基酸基因產(chǎn)物的基因產(chǎn)物從細(xì)胞片段或溶解產(chǎn)物分離。根據(jù)本發(fā)明使用的核酸可通過(guò)任何可利用的方法或工藝來(lái)制備，或通過(guò)在所屬領(lǐng)域中已知的其它工藝來(lái)制備。例如在Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology，HybridizationWithNucleicAcidProbes，第3章(Elsevierpress，1993)，Berger和Kimmel，MethodsEnzymol.中詳細(xì)說(shuō)明了用于分離核酸的傳統(tǒng)技術(shù)。已知用于制備核酸樣品和使自松樹和桉樹的多核苷酸定序的技術(shù)。參見例如上文的Allona等人和上文的Whetton等人。合適的核酸樣品可含有從多醣合成基因轉(zhuǎn)錄獲得的任何類型的核酸，即RNA或其子序列，或從多醣合成基因轉(zhuǎn)錄的mRNA用作其模板的核酸。合適的核酸包括從轉(zhuǎn)錄物反向轉(zhuǎn)錄的cDNA、從所述cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA、從所述cDNA放大的DNA和從所述經(jīng)放大的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA。對(duì)這些產(chǎn)物或所獲得產(chǎn)物的探測(cè)表明樣品中轉(zhuǎn)錄物的存在和/或豐度。因此，合適樣品包括(但不限于)一個(gè)或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄物、從轉(zhuǎn)錄物反向轉(zhuǎn)錄的cDNA、從cRNA轉(zhuǎn)錄的cDNA、從所述基因放大的DNA和從經(jīng)放大的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA。如本文中所使用，“轉(zhuǎn)錄物”的種類包括(但不限于)預(yù)mRNA初生轉(zhuǎn)錄物、轉(zhuǎn)錄過(guò)程中間體和成熟mRNA和其降解產(chǎn)物。不需監(jiān)測(cè)所有類型的轉(zhuǎn)錄以實(shí)踐本發(fā)明。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的表達(dá)分布方法可通過(guò)僅探測(cè)一種類型的轉(zhuǎn)錄來(lái)進(jìn)行，例如通過(guò)僅探測(cè)成熟mRNA含量。在本發(fā)明的一方面中，制備染色體DNA或cDNA基因庫(kù)(包含例如熒光標(biāo)記的從總細(xì)胞mRNA合成的cDNA)以根據(jù)所屬領(lǐng)域中公認(rèn)的方法用于雜交方法中。參見上文的Sambrook等人。在本發(fā)明的另一方面中，使用(例如)信息放大套組(MessageAmpki)(Ambion)放大mRNA。在另一方面，以可探測(cè)的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記mRNA。舉例來(lái)說(shuō)，可使用諸如CyDye(AmershamBiosciences)的熒光發(fā)色團(tuán)標(biāo)記mRNA。在一些應(yīng)用中，在用于雜交技術(shù)之前，可能需要抑制或破壞經(jīng)常存在于均質(zhì)物或溶解產(chǎn)物中的核糖核酸酶(RNase)。抑制或破壞核酸酶的方法已為人們所熟知。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，在存在離液劑時(shí)，將細(xì)胞或組織均質(zhì)化以抑制核酸酶。在另一實(shí)施例中，通過(guò)加熱處理，接著通過(guò)蛋白酶處理來(lái)抑制或破壞RNase。可通過(guò)所屬領(lǐng)域中的任何已知方法來(lái)獲得蛋白樣品。在本發(fā)明的所述技術(shù)中有益的蛋白樣品包括原細(xì)胞溶解產(chǎn)物和原組織均質(zhì)物?；蛘?，可純化蛋白樣品。所屬領(lǐng)域中已熟知的各種蛋白純化方法可在Marshak等人，STRATEGIESFORPROTEINPURIFICATIONANDCHARACTERIZATIONALABORATORYCOURSEMANUAL(ColdSpringHarborPress，1996)中找到。a.寡核苷酸探針在本發(fā)明采用的核酸雜交技術(shù)中有益的寡核苷酸探針是通過(guò)一或多種類型的化學(xué)鍵，通常通過(guò)經(jīng)由形成氫鍵互補(bǔ)堿基對(duì)配對(duì)，能夠結(jié)合至互補(bǔ)核酸序列的核酸。探針可包括天然堿基對(duì)(例如，A、G、U、C或T)或經(jīng)修飾的堿基對(duì)(7-脫氮鳥苷、肌苷等等)。此外，所述探針中的核苷酸堿基對(duì)可通過(guò)聯(lián)接而非磷酸二酯酶鍵結(jié)合，只要其不干擾雜交。因此，探針可為肽核酸，其中組成堿基對(duì)是通過(guò)肽鍵而非磷酸二酯酶鍵聯(lián)接結(jié)合。寡核苷酸探針可通過(guò)所屬領(lǐng)域中任何已知方法制備。在本發(fā)明中有益的探針是能夠雜交到多醣合成基因的核苷酸產(chǎn)物，例如雜交到SEQIDNO1-29之一的探針。在本發(fā)明中有益的探針可使用在SEQIDNO1-29中揭示的核苷酸序列產(chǎn)生。本發(fā)明包括具有任一SEQIDNO1-29的相應(yīng)鄰近序列的至少2、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或100個(gè)核苷酸片段的寡核苷酸探針。本發(fā)明包括長(zhǎng)度小于2、1、0.5、0.1或0.05的寡核苷酸。在一實(shí)施例中，寡核苷酸在長(zhǎng)度上是60核苷酸?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域中任何已知方法設(shè)計(jì)寡核苷酸探針。參見例如Li和Stormo，Bioinformatics171067-76(2001)。可使用軟件實(shí)現(xiàn)寡核苷酸探針設(shè)計(jì)。示范性軟件包括ArrayDesigner、GeneScan和ProbeSelect。與所定義核酸序列互補(bǔ)的探針可使用限定酶從較長(zhǎng)核苷酸來(lái)化學(xué)合成產(chǎn)生，或可使用例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)獲得。已熟知PCR方法，并且其描述于例如Innis等人編輯，PCRPROTOCOLSAGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONS，ACADEMICPRESS，INC.，SanDiego，CA(1990)中。探針可用例如放射性、經(jīng)結(jié)合生物素或熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。理想地，標(biāo)記樣品中的核酸序列，不標(biāo)記探針。通過(guò)上文的方法產(chǎn)生的寡核苷酸探針可用于溶液或基于固體支撐件的方法。本發(fā)明包括雜交到編碼區(qū)或雜交到多醣合成基因的3′未翻譯區(qū)(3UTR)的產(chǎn)物的寡核苷酸探針。在一實(shí)施例中，寡核苷酸探針雜交到任一SEQIDNO1-29的3′UTR。3′UTR通常是基因的獨(dú)特區(qū)，甚至在同一家族的各成員之間。因此，能夠雜交到3′UTR的產(chǎn)物的探針可有益于區(qū)分基因的編碼區(qū)可能高度一致的家族內(nèi)的個(gè)別基因的表達(dá)。這就允許設(shè)計(jì)寡核苷酸探針以用作每一個(gè)都能夠獨(dú)特地結(jié)合到單一基因的復(fù)數(shù)個(gè)寡核苷酸中的成員。在另一實(shí)施例中，寡核苷酸探針包含任一SEQIDNO59-83。在另一實(shí)施例中，寡核苷酸探針包含任一SEQIDNO1-29。b.寡核苷酸陣列方法本發(fā)明的一實(shí)施例采用兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸探針相結(jié)合以探測(cè)一個(gè)或一個(gè)以上多醣合成基因表達(dá)水平，例如探測(cè)SEQIDNO1-29的基因的表達(dá)水平。在這個(gè)實(shí)施例的一方面，探測(cè)兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的表達(dá)水平。所述兩個(gè)或兩個(gè)以上基因可來(lái)自上文討論的相同或不同多醣合成基因家族。所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸的每一個(gè)均可雜交到一個(gè)不同所述基因。本發(fā)明的一實(shí)施例采用兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸探針，其中每一個(gè)均特異地雜交到自SEQIDNO1-29提供的基因的轉(zhuǎn)錄獲得的多核苷酸。另一實(shí)施例采用兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸探針，其中至少一個(gè)包含SEQIDNO59-83的核酸序列。另一實(shí)施例采用兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸探針，其中至少一個(gè)由SEQIDNO59-83組成。寡核苷酸探針可包含從大約5至大約60，或從大約5至大約500個(gè)核苷酸堿基對(duì)，例如從大約60至大約100個(gè)核苷酸堿基對(duì)，包括從大約15至大約60個(gè)核苷酸堿基對(duì)。本發(fā)明的一實(shí)施例使用基于固體支撐件的寡核苷酸雜交方法以探測(cè)基因表達(dá)。適于實(shí)踐本發(fā)明的基于固體支撐件的方法已廣泛得知，并且在例如PCT申請(qǐng)案WO95/11755；Huber等人，Anal.Biochem.29924(2001)；Meiyanto等人，Biotechniques.31406(2001)；Relogio等人，NucleicAcidsRes.30e51(2002)中描述。寡核苷酸可結(jié)合的任何固體表面可共價(jià)地或非共價(jià)地使用。這些固體支撐件包括過(guò)濾器、聚氯乙烯盤、基于硅或玻璃的晶片等等。一實(shí)施例使用寡核苷酸陣列，即微陣列，其可用于同時(shí)觀測(cè)許多基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)。寡核苷酸陣列包含在固體支撐件上提供的兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸探針，其中每一探針在所述固體支撐件上占據(jù)一個(gè)獨(dú)特位置?？深A(yù)測(cè)定每一探針的位置，因此在給定位置探測(cè)到可探測(cè)信號(hào)是表明至已知身份的寡核苷酸探針的雜交。每一預(yù)測(cè)定位置可含有探針的多個(gè)分子，但預(yù)定位置的每一分子具有一致序列。這些預(yù)測(cè)定位置被稱作特征。在一個(gè)固體支撐件上可有例如從2、10、100、1,000、2,000或5,000或更多這些特征。在一實(shí)施例中，每一寡核苷酸在陣列上至少2次，至少3次，至少4次，至少5次，至少6次，或至少10次位于一個(gè)獨(dú)特位置。用于探測(cè)基因表達(dá)的寡核苷酸探針陣列可根據(jù)(例如)在Lockhart等人，Nat′lBiotech.141675(1996)，McGall等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA9313555(1996)與Hughes等人，NatureBiotechnol.19342(2001)中描述的傳統(tǒng)技術(shù)制造并使用。大量寡核苷酸陣列設(shè)計(jì)適于實(shí)踐本發(fā)明。在一實(shí)施例中，一個(gè)或一個(gè)以上寡核苷酸包括每一個(gè)都雜交到特異組織類型中表達(dá)的不同基因的復(fù)數(shù)個(gè)寡核苷酸。舉例來(lái)說(shuō)，組織可為正發(fā)育木質(zhì)。在一實(shí)施例中，自植物獲得的核酸樣品可放大，并且視情況地以可探測(cè)標(biāo)簽標(biāo)記?？墒褂玫娜魏魏怂岱糯蠓椒ê蜑檫@個(gè)目的的任何可探測(cè)標(biāo)簽。舉例來(lái)說(shuō)，放大反應(yīng)可使用(例如)Ambion信息放大執(zhí)行，其產(chǎn)生“反義”RNA或“aRNA”(核酸序列與從樣品組織提取的RNA互補(bǔ))。RNA可視情況地使用CyDye熒光標(biāo)簽標(biāo)記。在放大步驟時(shí)，aaUTP被并入所得aRNA。在非酶反應(yīng)中，將CyDye熒光標(biāo)簽偶合至aaUTPs。放大與標(biāo)記步驟后，經(jīng)標(biāo)記的放大反義RNA沉淀，并以適當(dāng)緩沖溶液沖洗，并接著探測(cè)純度。舉例來(lái)說(shuō)，純度可使用NanoDrop分光光度計(jì)探測(cè)。接著將核酸樣品與已附加至固體基板(“微陣列”載玻片)的寡核苷酸陣列接觸，寡核苷酸樣品探針能夠雜交到可能存在于樣品中的有關(guān)核酸。在有關(guān)核酸與陣列上存在的寡核苷酸探針間可發(fā)生雜交的條件下執(zhí)行接觸步驟。接著沖洗陣列以移除非特異性結(jié)合核酸，并且探測(cè)來(lái)自仍保持雜交到固體基板上寡核苷酸探針的經(jīng)標(biāo)記分子的信號(hào)。探測(cè)步驟可使用任何適于所使用標(biāo)簽類型的方法而完成。舉例來(lái)說(shuō)，探測(cè)步驟可使用激光掃描儀與探測(cè)器完成。舉例來(lái)說(shuō)，可使用Axon掃描儀，其視情況地使用GenePixPro軟件以分析微陣列載玻片上信號(hào)的位置。可通過(guò)所屬領(lǐng)域中已知的任何合適方法分析來(lái)自一個(gè)或一個(gè)以上微陣列載玻片的數(shù)據(jù)。在本發(fā)明的方法中使用的寡核苷酸探針包括微陣列技術(shù)，其可使用PCR產(chǎn)生。選擇在產(chǎn)生所述擇探針中使用的PCR引子，舉例來(lái)說(shuō)，基于SEQIDNO1-29的序列選擇，以導(dǎo)致多醣合成基因獨(dú)特片段(即，在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下僅雜交到任一SEQIDNO1-29的一個(gè)多核苷酸的片段)的放大。計(jì)算機(jī)程序在設(shè)計(jì)具有所需特異性與最佳雜交特性的引子中有益。舉例來(lái)說(shuō)，上文的Li和Stormo在1075處討論了使用ProbeSelect選擇探針的方法，ProbeSelect基于整個(gè)基因序列以及同時(shí)其它以待用探針探查的基因序列選擇最佳寡核苷酸探針。在一實(shí)施例中，也使用寡核苷酸控制探針。示范性控制探針可至少分為3類，在本文中稱作(1)正規(guī)化控制探針；(2)表達(dá)水平控制探針和(3)負(fù)控制探針。在微陣列方法中，可在陣列上將一個(gè)或一個(gè)以上這些控制探針與發(fā)明的多醣合成基因相關(guān)的寡核苷酸一起提供。正規(guī)化控制探針校正染色偏移、組織偏移、灰塵、載玻片不規(guī)則、畸形載玻片點(diǎn)等等。正規(guī)化控制探針是與加入待篩選樣品的經(jīng)標(biāo)記的參考寡核苷酸或其它核酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸或其它核酸探針。在雜交后，從正規(guī)化控制探針獲得的信號(hào)提供對(duì)雜交條件、標(biāo)記強(qiáng)度、讀取效率變化的控制和對(duì)其它可引起完整雜交信號(hào)在陣列間變化的因素的變化的控制。在一實(shí)施例中，從所述方法中使用的所有其它探針讀取的信號(hào)(例如熒光強(qiáng)度或放射性)通過(guò)來(lái)自控制探針的信號(hào)劃分，進(jìn)而使測(cè)量正規(guī)化。實(shí)際上任何探針可用作正規(guī)化控制探針。然而雜交效率隨著堿基對(duì)組成與探針長(zhǎng)度而變化。選擇優(yōu)選正規(guī)化探針以反映所使用的其它探針的平均長(zhǎng)度，但其也可選擇涵蓋長(zhǎng)度范圍。另外，可選擇正規(guī)化控制探針以反映所使用的其它探針的平均堿基對(duì)組成。在一實(shí)施例中，只使用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)正規(guī)化探針，且其以使得其雜交良好(即不形成次級(jí)結(jié)構(gòu))且不會(huì)匹配任何測(cè)試探針的方式來(lái)選擇。在一實(shí)施例中，正規(guī)化控制探針是哺乳動(dòng)物基因。表達(dá)水平控制探針特異地與存在于生物樣品中的組成表達(dá)基因雜交。實(shí)際上任何組成表達(dá)基因向表達(dá)水平控制探針提供合適靶位。通常，表達(dá)水平控制探針具有與組成表達(dá)“看家基因”子序列互補(bǔ)的序列，所述組成表達(dá)“看家基因”包括(但不限于)某些光合基因?！柏?fù)控制”探針并不與任何測(cè)試寡核苷酸(即發(fā)明的多醣合成基因相關(guān)的寡核苷酸)、正規(guī)化控制探針、或表達(dá)控制探針互補(bǔ)。在一實(shí)施例中，負(fù)控制探針是并不與樣品中任何其它序列互補(bǔ)的不容動(dòng)物基因。術(shù)語(yǔ)“背景”和“背景信號(hào)強(qiáng)度”是指自非特異性結(jié)合或經(jīng)標(biāo)記目標(biāo)核酸(即存在于生物樣品中的mRNA)與寡核苷酸陣列的組份間的其它相互作用所得的雜交信號(hào)。背景信號(hào)也可通過(guò)陣列組份自身的內(nèi)在熒光產(chǎn)生?？捎?jì)算整個(gè)陣列的單一背景信號(hào)，或可計(jì)算每一目標(biāo)核酸的不同背景信號(hào)。在一實(shí)施例中，將背景信號(hào)計(jì)算為所使用寡核苷酸探針的最低5％至10％的平均雜交信號(hào)強(qiáng)度，或其中計(jì)算每一目標(biāo)基因的不同背景信號(hào)，每一基因的不同背景信號(hào)為探針的最低5％至10％。其中對(duì)應(yīng)于特定多醣合成基因的寡核苷酸探針雜交充分，并且因此似乎特異地結(jié)合到目標(biāo)序列，其不應(yīng)用于背景信號(hào)計(jì)算中?；蛘呖蓪⒈尘靶盘?hào)計(jì)算為通過(guò)雜交到不與樣品中發(fā)現(xiàn)的任何序列互補(bǔ)的探針?biāo)a(chǎn)生的平均雜交信號(hào)強(qiáng)度(例如針對(duì)反義核酸或針對(duì)樣品中未發(fā)現(xiàn)的基因的探針)。在微陣列方法中，可將背景信號(hào)計(jì)算為通過(guò)根本缺少任何寡核苷酸探針的陣列區(qū)所產(chǎn)生的平均信號(hào)強(qiáng)度。c.基于PCR的方法在另一實(shí)施例中，使用基于PCR的方法探測(cè)基因表達(dá)。這些方法包括反向轉(zhuǎn)錄酶調(diào)節(jié)的聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)包括實(shí)時(shí)與終點(diǎn)定量反向轉(zhuǎn)錄酶調(diào)節(jié)的聚合酶鏈反應(yīng)(Q-RTPCR)。這些方法在所屬領(lǐng)域中已熟知。舉例來(lái)說(shuō)，可使用從(例如)AppliedBioSystemsandStratagene(應(yīng)用生物系統(tǒng)與策略基因公司)商業(yè)獲得的套組和方法進(jìn)行定量PCR方法。也請(qǐng)參見Kochanowski，QuantitativePCRProtocols(HumanaPress，1999)；上文的Innis等人；Vandesompele等人，GenomeBiol.3RESEARCH0034(2002)；Stein，CellMol.LifeSci.591235(2002)。也可在溶液中使用Q-RTPCR觀測(cè)基因表達(dá)。Q-RTPCR依賴在放大PCR產(chǎn)物時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)比例的探測(cè)。見上文的Innis等人。與傳統(tǒng)PCR方法相類似，這個(gè)技術(shù)采用雜交到有關(guān)DNA區(qū)的側(cè)面相反鏈和區(qū)的PCR寡核苷酸引子，通常是15到30個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的引子。此外，設(shè)計(jì)探針(例如TaqMan，應(yīng)用生物系統(tǒng))使其雜交到在PCR技術(shù)中慣常使用的前與反向引子之間的目標(biāo)序列。在5′端以報(bào)導(dǎo)子熒光團(tuán)，例如6-羧基螢光素(6-FAM)與如6羧基四甲基羅丹明的淬滅熒光團(tuán)(TAMRA)標(biāo)記探針。只要探針完整，熒光能量便會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，其導(dǎo)致報(bào)導(dǎo)子熒光團(tuán)的熒光發(fā)射被淬滅熒光團(tuán)吸收。然而，由于Taq聚合酶擴(kuò)展引子，因此Taq的內(nèi)在5′到3′核酸酶活性降解探針，釋放報(bào)導(dǎo)子熒光團(tuán)。放大周期間所探測(cè)到的熒光信號(hào)增加與每一周期中產(chǎn)生的產(chǎn)物量成比例。向前與反向放大引子和內(nèi)部雜交探針經(jīng)設(shè)計(jì)以特異地并獨(dú)特地與自目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄獲得的一個(gè)核苷酸雜交。在一實(shí)施例中，引子與探針序列的選擇標(biāo)準(zhǔn)包括關(guān)于核苷酸含量與尺寸的限制以滿足TaqMan的要求。SYBRGreen可用作上文所討論的Taqman類型陣列的少探針Q-RTPCR替代方法。ABIPrism7900SequenceDetectionSystemUserGuideAppliedBiosystems，第1到8章，應(yīng)用A到F.(2002)。在PCR放大期間，以設(shè)備測(cè)量熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化。所述測(cè)量實(shí)時(shí)完成，即當(dāng)反應(yīng)中放大產(chǎn)物積累時(shí)完成測(cè)量。可使用其它方法測(cè)量從探針消解所得的熒光變化。舉例來(lái)說(shuō)，可基于分子翻滾法辨別大與小分子間的熒光偏振。d.蛋白探測(cè)方法可使用所屬領(lǐng)域中已知的任何方法觀測(cè)蛋白，包括免疫學(xué)探測(cè)、酶探測(cè)與蛋白探測(cè)/類蛋白體技術(shù)?？筛鶕?jù)幾種蛋白方法執(zhí)行翻譯狀態(tài)的測(cè)量。舉例來(lái)說(shuō)，蛋白-“蛋白體”-的整個(gè)基因組監(jiān)測(cè)可通過(guò)構(gòu)造微陣列進(jìn)行，所述微陣列中的結(jié)合位置包含具有任一SEQIDNO30到48的氨基酸序列的復(fù)數(shù)個(gè)蛋白的固定、優(yōu)選地單克隆、特定抗體，或以SEQIDNO1-29或其保守變體的基因編碼的復(fù)數(shù)種蛋白的固定、優(yōu)選地單克隆、特定抗體。見Wildt等人，NatureBiotechnol.18989(2000)。已熟知制造多克隆與單克隆抗體的方法，如在(例如)Harlow與Lane，AntibodiesALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress，1988)中所描述。或者，可通過(guò)二維膠體電泳技術(shù)系統(tǒng)分離蛋白。所屬領(lǐng)域中已熟知二維膠體電泳技術(shù)系統(tǒng)，并且其通常包括沿第一維等電聚焦，接著沿第二維進(jìn)行SDS-PAGE電泳技術(shù)分析。見例如Hames等人，GelElectrophoresisofProteinsAPracticalApproach(IRLPress，1990)。所得電子影像分析圖可通過(guò)多種技術(shù)分析，包括質(zhì)譜技術(shù)、西方轉(zhuǎn)漬分析(westernblotting)和使用多克隆和單克隆抗體的免疫轉(zhuǎn)漬分析(immunoblotanalysis)和內(nèi)部與N端子微定序分析。3.將基因表達(dá)與表型和組織發(fā)育相關(guān)聯(lián)如上文所討論，本發(fā)明提供將基因表達(dá)與植物表型相關(guān)聯(lián)的方法和手段?；虮磉_(dá)可在具有有關(guān)表型的植物中研究，并與不具所述表型的植物或具有不同表型的植物相比較。這個(gè)表型包括(但不限于)干旱耐受性增加、除草劑抗性、高度減小或增大、分枝減少或增多、抗冷凍與霜耐受性增強(qiáng)、生命力改善、色彩增強(qiáng)、健康與營(yíng)養(yǎng)特征增強(qiáng)、儲(chǔ)藏改善、產(chǎn)量提高、鹽耐受性增強(qiáng)、木質(zhì)腐爛抗性增強(qiáng)、真菌病癥抗性增加、蟲害吸引力改變、疾病耐受性增大、昆蟲耐受性增大、水壓耐受性增大、質(zhì)地改善、發(fā)芽率增大、微量營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量增大、新穎樹脂產(chǎn)生、纖維素含量增大、木質(zhì)素含量降低和新穎蛋白或肽產(chǎn)生。在另一實(shí)施例中，表型包括下文特征的一個(gè)或一個(gè)以上形成反應(yīng)性木質(zhì)傾向、不成熟期降低、不成熟期增加、自我剪切分枝、生殖發(fā)育加速、或生殖發(fā)育延緩。在另一實(shí)施例中，植物比較中不同的表型包括下文的一個(gè)或一個(gè)以上木質(zhì)素質(zhì)量、木質(zhì)素結(jié)構(gòu)、木質(zhì)組成、木質(zhì)外觀、木質(zhì)密度、木質(zhì)強(qiáng)度、木質(zhì)剛性、纖維素聚合性、纖維尺寸、內(nèi)腔大小、花冠比例、導(dǎo)管分子比例、其它植物組份、植物細(xì)胞分裂、植物細(xì)胞發(fā)育、單位面積的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、細(xì)胞壁組成、木質(zhì)形成速率、木質(zhì)審美外觀、干缺陷形成、平均微纖維角度、S2細(xì)胞壁層寬度、生長(zhǎng)速率、根的根部形成速率與分枝植物生長(zhǎng)的比、葉面積指數(shù)與葉形狀?？赏ㄟ^(guò)上文討論的任何合適方法評(píng)估表型，例如上文的Hertzberg；上文的Ye和Sundstrom；美國(guó)專利申請(qǐng)公開案號(hào)2002/0107644與2002/0113212；上文的Marita等人。對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明的方法和組合物做出多種改進(jìn)和變化。因此，本發(fā)明用于涵蓋本發(fā)明的改進(jìn)和變化，只要所述改進(jìn)與變化在所附權(quán)利要求范圍和其等效物的范圍內(nèi)。下文給出實(shí)例解釋本發(fā)明。然而，應(yīng)了解不應(yīng)將本發(fā)明限制于這些實(shí)例中所描述的特定條件或細(xì)節(jié)中。在整個(gè)所述說(shuō)明書中，公開可利用文獻(xiàn)，包括美國(guó)專利的任何專利和所有參考文獻(xiàn)都特定地以全部引用的方式并入本文中。實(shí)例實(shí)例1實(shí)例1證明如何將巨桉與輻射松中的纖維素合成酶和纖維素合成酶類似基因分離和表征。從植物組織提取總RNA(使用Chang等人，PlantMol.Biol.Rep.11113-116(1993)中的方法)。從韌皮部(P)、形成層(C)、擴(kuò)展木質(zhì)部(X1)和經(jīng)分化與木質(zhì)素化的木質(zhì)部(X2)獲得植物組織樣品。使用Poly(A)QuikmRNA分離套組(Stratagene，LaJolla，CA)或DynalBeadsOligo(dT)25(Dynal，Skogen，Norway)從總RNA制備物分離mRNA。根據(jù)使用制造商的方法，通過(guò)反向轉(zhuǎn)錄酶合成，接著通過(guò)使用ZAP表達(dá)cDNA合成套組(Stratagene)將所得cDNA克隆體插入LambdaZAP，由經(jīng)純化的mRNA構(gòu)造cDNA表達(dá)基因庫(kù)。使用GigapackII封裝提取(Stratagene)，使用依賴所述基因庫(kù)的5μL接合反應(yīng)中的等分試樣封裝所得cDNAs。使用XLl-BlueMRF′細(xì)胞和具有ExAssist輔助性噬菌體(Stratagene)的XLOLR細(xì)胞(Stratagene)完成所述基因庫(kù)的大量切離。以NZY肉湯(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)將經(jīng)切離的噬菌粒稀釋，并將其涂在含有X-gal(5-溴-4-錄-3-吲哚-β-半乳糖苷)和異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)的LB-卡那霉素瓊脂板上。在經(jīng)涂布和選擇用于DNA小量制備的克隆體中，99％含有適于定序的插入物。在NZY肉湯中以卡那霉素培養(yǎng)陽(yáng)性克隆體，并且借助堿性溶菌法和聚乙二醇沉淀純化cDNA。使用1％的瓊脂糖凝膠篩選染色體污染的定序模板。根據(jù)制造商的方法，使用Turbo催化800儀制備染色引子序列(PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivision，F(xiàn)osterCity，CA)。使用PerkinElmer/AppliedBiosystemsDivisionPrism377377定序儀獲得陽(yáng)性克隆體的DNA序列。cDNA首先從5′端定序，且在某些狀況下，也從3′端定序。對(duì)于某些克隆體來(lái)說(shuō)，使用核酸外切酶III刪除分析獲得內(nèi)部序列，在pBK-CMV中產(chǎn)生不同大小的子克隆體庫(kù)，或通過(guò)使用經(jīng)設(shè)計(jì)識(shí)別有關(guān)基因區(qū)的基因特異性引子直接定序而獲得某些克隆的內(nèi)部序列。所測(cè)定的cDNA序列在SEQIDNO1-29中提供。經(jīng)預(yù)測(cè)的多肽序列是SEQIDNO30到58。為在輻射松和巨桉數(shù)據(jù)庫(kù)中識(shí)別纖維素合成酶(Ces)與纖維素合成酶類似(Csl)候選物，將cDNA序列與阿布屬纖維素合成酶超級(jí)家族相比較。Richmon和Somerville，PlantPhysiol.124495(2000)。下一步，使用公共域序列(通過(guò)SWISS-PROT/TrEMBL蛋白識(shí)別號(hào))相對(duì)于松樹和桉樹數(shù)據(jù)庫(kù)搜索(非冗余片段重疊群，期望值＜1.0e-2)。松樹獲得80次匹配，桉樹獲得82次匹配。對(duì)于這些匹配來(lái)說(shuō)，26個(gè)松樹和15個(gè)桉樹是潛在全長(zhǎng)(即含有起始Met)或接近全長(zhǎng)序列。接著獲得所有162個(gè)匹配樹木的片段重疊群一致DNA與蛋白序列，并且識(shí)別復(fù)制序列。著對(duì)蛋白序列進(jìn)行多重比較。使用剩余的29個(gè)松樹與桉樹序列與阿布屬成員，與2個(gè)胼胝質(zhì)合成酶和2個(gè)纖維素酶建立蛋白比較。從所述蛋白比較，建立系統(tǒng)樹狀圖。這個(gè)系統(tǒng)樹狀圖以ces家族或csl家族序列命中為基。通過(guò)引子行走分析這些序列以提供全長(zhǎng)序列(分析從片段重疊群挑選的最佳HT全長(zhǎng)序列)。還提取了玉米、棉花、水稻與白楊的公共域纖維素合成酶序列，并且對(duì)照松樹和桉樹數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。還將已完成引子行走的松樹與桉樹序列對(duì)照其自身的序列進(jìn)行比對(duì)，并獲取最前面的500個(gè)匹配。完成這個(gè)步驟，以使所述序列可用于進(jìn)一步搜索，并且通過(guò)使用阿布屬超級(jí)家族確保未錯(cuò)失松樹與桉樹數(shù)據(jù)庫(kù)中的任何數(shù)據(jù)。這個(gè)搜索產(chǎn)生了在以前的搜索中未發(fā)現(xiàn)的4個(gè)其它序列。然后，也發(fā)送這些序列以獲得經(jīng)引子行走的全長(zhǎng)序列。引子行走后，移除少數(shù)附加復(fù)制子，然后識(shí)別30個(gè)松樹與桉樹經(jīng)引子行走的纖維素合成酶超級(jí)家族成員。通過(guò)與ClustalX的比較、相應(yīng)的系統(tǒng)樹狀圖與MEME/MAST分析證實(shí)這些序列的分類CES或CSL。實(shí)例2為在cDNA基因庫(kù)中識(shí)別部分cDNA序列的附加序列5′或3′，使用SMARTRACEcDNA放大套組(ClontechLaboratories.PaloAlto.Calif.)執(zhí)行cDNA端(RACE)的5′與3′快速放大。通常，所述方法必須首先分離聚合(A)mRNA，執(zhí)行第一與第二鏈cDNA合成以產(chǎn)生雙鏈cDNA，鈍化cDNA末端，并接著連接SMARTRACE。cDNA的調(diào)節(jié)子形成經(jīng)調(diào)節(jié)子連接的dscDNA基因庫(kù)。設(shè)計(jì)基因特異性引子以與調(diào)節(jié)子特異性引子一起用于5′與3′RACE反應(yīng)。使用5′與3′RACE反應(yīng)，獲得5′與3′RACE片段，并將其定序、克隆?？芍貜?fù)所述過(guò)程直到識(shí)別出全長(zhǎng)基因的5′與3′末端。通過(guò)使用基因5′與3′末端特異性引子(以末端對(duì)末端PCR而特異)的PCR，可產(chǎn)生全長(zhǎng)cDNA。舉例來(lái)說(shuō)，為放大自第一鏈cDNA的基因的缺失5′區(qū)，將引子設(shè)計(jì)成從模板序列相反鏈及從模板序列的約100到200bp之間區(qū)的5′→3′。成功的放大應(yīng)在模板5′末端與PCR產(chǎn)物之間產(chǎn)生約100bp的DNA序列重合。使用Concert試劑方法(Invitrogen，Carlsbad，CA)與標(biāo)準(zhǔn)分離和提取過(guò)程從4種松樹組織提取RNA，即子葉、木質(zhì)部、韌皮部與結(jié)構(gòu)性根。接著使用10U/μl脫氧核糖核酸酶I(RocheDiagnostics，Basel，Switzerland)將所得RNA以脫氧核糖核酸酶處理。使用100μgRNA、9μl10x脫氧核糖核酸酶緩沖溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、10μlRoche脫氧核糖核酸酶I與90μl不含核糖核酸酶的水。接著在室溫下將RNA培養(yǎng)15分鐘，并添加1/10體積的25mMEDTA。根據(jù)制造商的方法，使用核糖核酸酶微套組(Qiagen，Venlo，Dutch)純化RNA。為合成cDNA，根據(jù)制造商的方法，使用從木質(zhì)部、韌皮部、子葉與根提取的RNA，接著使用SMARTRACEcDNA放大套組(ClontechLaboratoriesInc，PaloAlto，CA)。對(duì)于RACEPCR，結(jié)合來(lái)自4種組織類型的Cdna。通過(guò)結(jié)合等體積的來(lái)自木質(zhì)部、韌皮部、根與子葉組織的cDNA產(chǎn)生快速PCR通用試劑(mastermixforPCR)。在96孔PCR載玻片上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其具有1μl來(lái)自引子稀釋載玻片(10mM)的引子對(duì)應(yīng)孔位置。將49μl快速PCR通用試劑整分放入具有引子的PCR載玻片上。以下列參數(shù)在GeneAmp9700(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster，CA)上開始熱循環(huán)94℃(5秒)，72℃(3分鐘)，循環(huán)5次；94℃(5秒)，70℃(10秒)，72℃(3分鐘)，循環(huán)5次；94℃(5秒)，68℃(10秒)，72℃(3分鐘)，循環(huán)25次。按下述標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程在瓊脂糖凝膠上分離cDNA。剪切膠體片段，并遵循制造商指示，通過(guò)使用96孔膠體洗提套組從膠體將其洗提。遵循下文說(shuō)明將PCR產(chǎn)物隔夜連接放入96孔板的pGEMTeasy(Promega，Madison，Wl)將60-80ngDNA、5il2X快速連接緩沖液、0.5μlpGEMT簡(jiǎn)易載體、0.1μlDNA連接酶用水填充到10μl并隔夜培養(yǎng)。遵循標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程將每一克隆轉(zhuǎn)型進(jìn)入大腸桿菌，并從按照下文標(biāo)準(zhǔn)方法選取的12克隆中提取DNA。在1％的瓊脂糖凝膠上校驗(yàn)DNA提取與DNA質(zhì)量。通過(guò)限制性消化，使用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI與膠體電影技術(shù)，遵循標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室過(guò)程，測(cè)定校正尺寸插入物的出現(xiàn)。具有有義UDP葡萄糖結(jié)合域序列可操作性地連接到組成型啟動(dòng)子的桉樹原種克隆的轉(zhuǎn)型具有增加的生長(zhǎng)表型，如以纖維素合成、初級(jí)細(xì)胞壁合成、木質(zhì)密度與拉伸強(qiáng)度所證明。從儲(chǔ)備桉樹植物收獲移植葉，并將移植植物在預(yù)處理媒介上培養(yǎng)。與培養(yǎng)基包含植物生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素與土壤桿菌誘導(dǎo)子，例如乙酰丁香酮，刺激沿移植組織剪切邊緣的細(xì)胞分裂。四天預(yù)培養(yǎng)后，以含有質(zhì)體的土壤桿菌種類GV2260培養(yǎng)移植植物，所述質(zhì)體的一部分UDP葡萄糖結(jié)合域可操作性地連接到泛激素啟動(dòng)子。在轉(zhuǎn)入到Euc再生媒介中之前，將移植植物共培養(yǎng)3天。在Euc再生媒介上培養(yǎng)4天后，將移植植物轉(zhuǎn)移到含有除草劑的選擇性媒介上。在選擇除草劑抗性轉(zhuǎn)化株后，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化株的GUS表達(dá)。當(dāng)確認(rèn)GUS表達(dá)時(shí)，收獲幼苗并將其轉(zhuǎn)移到生根媒介中。生根媒介含有以MeadWestvacoNuchar活性炭補(bǔ)充的5g/l的BTM-1鹽，并且生根發(fā)育通常發(fā)生在2到4周后。當(dāng)初級(jí)根系統(tǒng)發(fā)育時(shí)，將經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物轉(zhuǎn)移到土壤中?？刹僮餍缘剡B接到泛激素啟動(dòng)子的攜帶任一SEQIDNO1-29的轉(zhuǎn)基因桉樹植物顯示生長(zhǎng)加速。實(shí)例3實(shí)例3說(shuō)明RNA提取與純化過(guò)程，其對(duì)從松針、木質(zhì)部、形成層與韌皮部獲得的RNA特定地有益。從松針、木質(zhì)部、形成層或韌皮部獲得組織。在液氮中冷凍所述組織，并將其置于地面上。使用Concert植物RNA試劑提取總RNA(Invitrogen)。將所得RNA樣品放入苯酚氯仿中提取，并以脫氧核糖核酸酶處理。接著，在65℃將所述RNA培育2分鐘，然后在4℃離心30分鐘。離心后，將RNA放入苯酚中提取至少10分鐘，以移除污染物。進(jìn)一步使用RNeasy柱(Qiagen)清潔RNA。經(jīng)純化的RNA使用RiboGreen試劑(分子探針)定量，并以膠體電泳技術(shù)評(píng)估純度。接著使用MessageAmp(Ambion)放大RNA。將氨烯丙基-UTP與從由UTP以4∶1的比例加入經(jīng)純化RNA的活體外轉(zhuǎn)錄。當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)，氨烯丙基-UTP被并入新的RNA鏈中。接著所述氨烯丙基基團(tuán)與Cy標(biāo)記反應(yīng)以使用Amersham過(guò)程將比色標(biāo)記附加到所得經(jīng)放大RNA，所述Amersham過(guò)程為與RNA一起使用而改進(jìn)。未并入的標(biāo)記以乙醇沉積移除。經(jīng)標(biāo)記的RNA分光光度定量(NanoDrop分光光度計(jì))。如在Hughes等人，NatureBiotechnol.19342(2001)中所描述，通過(guò)加熱到95℃將經(jīng)標(biāo)記的RNA分段。實(shí)例4實(shí)例4說(shuō)明如何測(cè)定對(duì)輻射松木質(zhì)發(fā)育重要的纖維素合成酶或纖維素合成酶類似基因，并且說(shuō)明如何設(shè)計(jì)并合成在微陣列上使用的獨(dú)特地結(jié)合到那些基因的寡核苷酸。輻射松種松樹在自然光條件下生長(zhǎng)。如在例如Sterky等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.9513330(1998)中所描述制備組織樣品。特定地，從高度為5m的木質(zhì)數(shù)目收集組織樣品。木質(zhì)樹木的組織樣品通過(guò)經(jīng)由樹干的形成層區(qū)切線部分制備。將樹干水平地劃分為從不成熟木質(zhì)(上部)到成熟木質(zhì)(底部)變化的部分。以發(fā)育階段分離的樹干部分進(jìn)一步通過(guò)剝皮為韌皮部部分、分化韌皮部、形成層、分化木質(zhì)部、發(fā)育木質(zhì)部和成熟木質(zhì)部，分為5層。也從輻射松種的樹苗制備包括葉，芽、幼苗與根的組織樣品。如在實(shí)例1或在上文的Sterky等人中所描述，分離RNA并產(chǎn)生EST。將從含有發(fā)育木質(zhì)的樣品獲取的EST核酸序列與已知在多醣合成中包括的基因的核酸序列相比較。也將來(lái)自不含發(fā)育木質(zhì)的樣品的EST序列與已知在植物細(xì)胞周期中包括的基因的序列相比較。使用BLAST(NCBI)執(zhí)行計(jì)算機(jī)雜交分析。下面的表6與表7說(shuō)明巨桉(表6)和輻射松(表7)中纖維素合成酶與纖維素合成酶類似蛋白的計(jì)算機(jī)雜交數(shù)據(jù)。表6.巨桉的計(jì)算機(jī)雜交數(shù)據(jù)表7輻射松的計(jì)算機(jī)雜交數(shù)據(jù)選擇來(lái)自已知纖維素合成酶與纖維素合成酶類似蛋白基因中的序列用于進(jìn)一步研究，所述纖維素合成酶類似蛋白基因在計(jì)算機(jī)中顯示雜交到由含有發(fā)育木質(zhì)的樣品制造EST，但其并不雜交到由未含有發(fā)育木質(zhì)的樣品制造EST。使用分子生物學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員已熟知的技術(shù)從cDNA基因庫(kù)選擇cDNA克隆體，所述cDNA克隆體含有雜交到顯示木質(zhì)優(yōu)選表達(dá)的基因的序列。使用所述序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸，因此每一寡核苷酸僅對(duì)于基因庫(kù)中的一個(gè)cDNA序列特異。表5中提供寡核苷酸序列。使用上文的Li與Stormo的方法或使用軟件例如ArrayDesigner、GeneScan與ProbeSelect設(shè)計(jì)60mer長(zhǎng)度的寡核苷酸探針。接著根據(jù)Hughes等人，NatureBiotechnol.19324(2002)或Kane等人，NucleicAcidsRes.284552(2000)中所描述的合成寡核苷酸，并使用氨基連接子將其固定到經(jīng)活化的玻璃載玻片(Sigma-Genosis，Woodland，TX)。已知載玻片上每一寡核苷酸的位置。實(shí)例5實(shí)例5說(shuō)明如何使用實(shí)例4中所描述的從輻射松cDNA序列獲得的微陣列選擇來(lái)從多種松樹種的組織RNA(在這個(gè)情況下是輻射松與火炬松(P.taeda)樹)，用于不成熟木質(zhì)和成熟木質(zhì)中與木質(zhì)發(fā)育相關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)模式的分析，所述不成熟木質(zhì)和成熟木質(zhì)形成樹木區(qū)。從種植園生長(zhǎng)點(diǎn)選擇大約16年生開放授粉樹木，在美國(guó)選擇火炬松，在新西蘭選擇輻射松。在春季與夏季砍伐樹木以比較與這些不同木質(zhì)形成發(fā)育階段相關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)。從距基部大于1到2米的末端區(qū)域?qū)€(gè)別砍伐的樹木與樹干區(qū)移除，并在活樹冠下1到2米內(nèi)將個(gè)別砍伐的樹木與樹干區(qū)移除。從樹干基部末端移除的部分含有成熟木質(zhì)。從活樹冠下移除的部分含有不成熟木質(zhì)。在春季收集的樣品被稱作早期木質(zhì)或春季木質(zhì)，而在夏季收集的樣品被認(rèn)為是晚期木質(zhì)或夏季木質(zhì)。Larson等人，Gen.Tech.Rep.FPL-GTR-129.Madison，WlU.S.DepartmentofAgriculture，F(xiàn)orestService，F(xiàn)orestProductsLaboratory，，第42頁(yè)。從樹干部分分離組織，因此韌皮部、形成層、發(fā)育木質(zhì)部與成熟木質(zhì)部被移除。這些組織僅從當(dāng)年生長(zhǎng)環(huán)收集。當(dāng)在每一種情況下移除組織時(shí)，將材料迅速浸入液氮中以保存核酸與其它組份。從所述部分剝掉樹皮，并從樹皮的內(nèi)表面通過(guò)以刀鋒切削將韌皮部移除。從剝皮部分的外表面通過(guò)輕輕切削表面將形成層分離。通過(guò)順序執(zhí)行剩余組織的更多有力切削分離發(fā)育木質(zhì)部與木質(zhì)素化木質(zhì)部。將組織從液氮移入容器中以在-70℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存，直到執(zhí)行RNA提取和隨后的分析。實(shí)例6實(shí)例6說(shuō)明替代那些在實(shí)例3中使用的用于RNA提取和純化的過(guò)程，其對(duì)于從木質(zhì)植物多種組織獲得的RNA尤其有益，而且實(shí)例6說(shuō)明使用實(shí)例4中所描述的陣列用于雜交與數(shù)據(jù)分析的過(guò)程。根據(jù)Chang等人，PlantMol.Biol.Rep.11113中描述的方法分離RNA。根據(jù)制造商建議使用DNaseI(Invitrogen，Carlsbad，CA)移除DNA。使用Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies，USA)測(cè)定RNA樣品的整體性。使用已知方法將每一組織的10μg總RNA反向轉(zhuǎn)錄于cDNA中。在輻射松韌皮部組織的情況下，難以提取足夠量的總RNA用于標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記過(guò)程。提取總RNA并如前所描述將其處理，并且使用來(lái)自NuGENTM的OvationTM納米樣品RNA放大系統(tǒng)將100ng總RNA放大?；蛘呖墒褂妙愃品糯筇捉M，例如那些Ambion制造的套組。將經(jīng)放大的RNA反向轉(zhuǎn)錄于cDNA，并按照上文所描述將其標(biāo)記。按照美國(guó)專利申請(qǐng)(上文的)“用于微陣列分析的cDNA標(biāo)記與雜交的方法和套組”中描述的方法在42℃下執(zhí)行雜交與嚴(yán)謹(jǐn)性沖洗。使用掃描陣列4000微陣列分析系統(tǒng)(ScanArray4000MicroarrayAnalysisSystem)(GSILumonics，Ottawa，ON，Canada)掃描陣列(載玻片)。使用QUANTARRAY軟件(GSILumonics，Ottawa，ON，Canada)產(chǎn)生原始的未正規(guī)化的強(qiáng)度值。使用完全平衡、不完全區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Kerr和Churchill，Gen.Res.123123，2001)以審計(jì)允許從分析數(shù)據(jù)的最大統(tǒng)計(jì)推測(cè)的陣列實(shí)驗(yàn)。使用SAS微陣列方法軟件包分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)(SASInstitute，Gary，NC，USA)。接著使用JMp檢驗(yàn)所得數(shù)據(jù)(SASInstitute，Gary，NC，USA)。為這個(gè)實(shí)驗(yàn)所做的分析是具有混合模型特異性的ANOVA(方差分析)方法(Wolfinger等人，J.Comp.Biol.8625-637)。應(yīng)用2個(gè)線性混合模型步驟。第一個(gè)，正規(guī)化模型，其應(yīng)用于載玻片水平上的全面正規(guī)化。第二個(gè)，基因模型，其應(yīng)用于在每一個(gè)基因上進(jìn)行精確統(tǒng)計(jì)推測(cè)。模型(1)和模型(2)中說(shuō)明2個(gè)模型。log2(Yikls)＝θij+Dk+Sl+DSkl+ωikls(1)Rijkls(g)=μij(g)+Dk(g)+Sl(g)+DSkl(g)+SSls(g)+ϵijkls(g)----(2)]]>Yijkls表示第I載玻片上第s點(diǎn)的強(qiáng)度，第I載玻片具有第j處理應(yīng)用于第i細(xì)胞系的第k染色。θij、Dk、Sl與DSki第I細(xì)胞系中平均第J處理影響、第K染色影響、第I載玻片隨機(jī)影響與第I載玻片上第K染色的隨機(jī)交互影響，Wijkls是隨機(jī)誤差項(xiàng)，除θij、Dk、Sl，與Dski對(duì)第g基因的特異性外，Wijkls表示與θij、Dk、Sl，與Dski類似的作用。Rijkls(g)表示來(lái)自模型(1)的第g基因的殘差。除θij、Dk、Sl，與Dski對(duì)第g基因的特異性外，D(g)k，S(g)l，和DSkl(g)表示與θij、Dk、Sl和DSki的類似作用，SSls(g)表示第g基因的受到載玻片隨機(jī)影響的點(diǎn)。εijkls(g)表示隨機(jī)誤差項(xiàng)。認(rèn)為所有隨機(jī)項(xiàng)均正態(tài)分布，并且在每一模型中相互獨(dú)立。根據(jù)上文所描述的分析，其中一些已在表4中展示的某些cDNA，被發(fā)現(xiàn)分化表達(dá)。木質(zhì)發(fā)育中這些特異性基因的包括是通過(guò)基因的上調(diào)或下調(diào)與木質(zhì)發(fā)育特定階段的關(guān)聯(lián)推測(cè)到的。當(dāng)確立基因表達(dá)與木質(zhì)發(fā)育中相關(guān)性的聯(lián)系時(shí)，考慮特定季節(jié)，橫貫一個(gè)區(qū)(韌皮部、形成層、發(fā)育木質(zhì)部、成熟木質(zhì)部)中木質(zhì)發(fā)育的空間連續(xù)性與樹干位置和季節(jié)與樹干的關(guān)系。實(shí)例7實(shí)例7證明如何將多醣基因表達(dá)與諸如密度、剛性、強(qiáng)度、分枝間的距離和螺旋紋理的農(nóng)藝學(xué)重要木質(zhì)表型相關(guān)聯(lián)。在已知親本樹木的子代中選擇較好生長(zhǎng)特點(diǎn)于重要真菌疾病抗性的成熟克隆繁殖松樹。將樹皮從切線部分移除，在胸高處檢查第五年輪中平均木質(zhì)密度、木質(zhì)剛性與強(qiáng)度和螺旋紋理。所述樹木的特征也在于其高度、主要述木分枝間的平均距離、樹冠大小與分枝。為獲得隔離主要基因的幼苗家族，所述主要基因影響密度、剛性、強(qiáng)度、分枝間的距離、螺旋紋理與可連接到任一影響這些特點(diǎn)的基因的其它特點(diǎn)，在其顯示彼此間關(guān)于密度、剛性、分枝間距離與螺旋紋理標(biāo)準(zhǔn)的最大范圍變化的標(biāo)準(zhǔn)下，選擇缺少共同親本的樹木用于特定交叉。因此，來(lái)自顯示高密度、低主要分枝間平均距離和高螺旋紋理的樹木的花粉用于對(duì)來(lái)自可選擇樹木中的不相關(guān)優(yōu)勢(shì)木的球果授粉，所述可選擇樹木顯示最低密度、最高主要分枝間平均距離與最低螺旋紋理。有必要注明“優(yōu)勢(shì)木”經(jīng)交叉，因此例如將來(lái)自顯示高密度的優(yōu)勢(shì)木的花粉用于對(duì)來(lái)自其它顯示高密度的優(yōu)勢(shì)木的發(fā)育球果授粉，并且來(lái)自顯示低主要分枝間平均距離的樹木的花粉將用于對(duì)來(lái)自其它顯示低主要分枝間平均距離的優(yōu)勢(shì)木的發(fā)育球果授粉。從這些經(jīng)控制授粉的樹木收集種子，并使其生長(zhǎng)，因此每一種子將保持親本特性，并且每一種子可用于植物繁殖，因此每一基因型以多個(gè)無(wú)性分株表示。使用微繁殖、籬植、肌束插枝完成植物繁殖。當(dāng)每一基因型的植物繁殖體長(zhǎng)到用于建立野外種植足夠大的尺寸時(shí)，每一基因型的一些無(wú)性分株存儲(chǔ)。在復(fù)制設(shè)計(jì)中探測(cè)所述基因型，并使其在日間溫度與降雨測(cè)量并記錄的野外條件下生長(zhǎng)。在多種年齡測(cè)量樹木以測(cè)定密度、剛性、強(qiáng)度、分枝間距離、螺旋紋理與可連接到任一影響這些特點(diǎn)的基因的其它可觀測(cè)特點(diǎn)。收獲樣品用于表征纖維素含量、木質(zhì)素含量、纖維素微纖維角度、密度、強(qiáng)度、剛性、管胞形態(tài)、年輪寬度和類似特征。如在實(shí)例6中所描述也研究樣品的基因表達(dá)。每一基因型的無(wú)性分株與同一基因型不同年齡的無(wú)性分株相比較以確立這些特點(diǎn)的年齡年齡關(guān)系。實(shí)例8實(shí)例8證明如何響應(yīng)環(huán)境條件例如光與季節(jié)來(lái)改變植物表型，且證明如何使用微陣列與多醣合成基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。詳細(xì)來(lái)說(shuō)，研究與木質(zhì)密度相關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)的改變。3種不同克隆繁殖的巨桉樹雜交體基因型在具有氣象站測(cè)量日溫與降雨的地點(diǎn)生長(zhǎng)。在春季與隨后而來(lái)的夏季期間，3種不同基因型的遺傳一致無(wú)性分株首先以北到南方向標(biāo)記攝影，接著將其砍伐，使用充分分辨率的攝影術(shù)以展示植物不成熟與成熟部分的樹皮特點(diǎn)。樹木的年齡通過(guò)種植記錄測(cè)定，并且通過(guò)年輪計(jì)數(shù)證實(shí)。在每一顆這些樹中，成熟木質(zhì)被定義為胸高以下最外環(huán)，且不成熟木質(zhì)被定義為胸高以上最內(nèi)環(huán)。因此，每一顆樹按照如下劃分NM北部成熟SM南部成熟NT北部過(guò)渡ST南部過(guò)渡NJ北部不成熟SJ南部不成熟從植物樹干以及不成熟和成熟形式葉收獲組織。同時(shí)制備樣品用于表型與基因表達(dá)分析，包括植物形態(tài)學(xué)與生物化學(xué)特點(diǎn)。記錄獲得每一部分的點(diǎn)的樹木高度和直徑，并獲取樹木基部的土壤樣品用于化學(xué)化驗(yàn)。稱重經(jīng)制備用于基因表達(dá)分析的樣品，并將其放入液氮中用于隨后在微陣列試驗(yàn)中使用的RNA樣品的制備。將組織表示為如下P韌皮部C形成層X1擴(kuò)展木質(zhì)部X2分化與木質(zhì)素化木質(zhì)部將樹干每一部分的切線與半徑區(qū)中的薄層按照Ruzin，PlantMicrotechniqueandMicroscopy，OxfordUniversityPress，Inc.，NewYork，NY(1999)中所描述的固定，用于木質(zhì)發(fā)育階段的解剖研究與證實(shí)。在木質(zhì)不同發(fā)育階段研究微纖維角度，例如在巨按木質(zhì)的不成熟、過(guò)渡與成熟階段研究。所研究的其它特點(diǎn)是每一部分中纖維與導(dǎo)管分子和花冠組織的比例。此外，研究這些樣品在不成熟與成熟木質(zhì)間和春季木質(zhì)與夏季木質(zhì)間變化的特點(diǎn)，例如纖維素形態(tài)、內(nèi)腔大小、S2(最厚)細(xì)胞壁層寬度。進(jìn)一步檢查第五環(huán)中密度的測(cè)量與使用木質(zhì)陣列領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的技術(shù)的彈性系數(shù)的測(cè)量。參見例如，Wang等人，Non-destructiveEvaluationsofTrees，ExperimentalTechniques，第28到30頁(yè)(2000)。對(duì)于生物化學(xué)分析，使用植物生物化學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的單一瓊脂、氨基酸、脂、其它提取物、木質(zhì)素和纖維素量的生物化學(xué)化驗(yàn)，冷干并分析50g每一所收獲樣品。見，例如Pettersen與Schwandt，J.WoodChem.&Technol.11495(1991)。在本實(shí)例中，為比較而選擇的表型是高密度木質(zhì)、平均密度木質(zhì)與低密度木質(zhì)。按照實(shí)例3中所描述，由在春季與夏季收獲的樹木制備核酸樣品。按照上文描述執(zhí)行雜交的基因表達(dá)圖譜與數(shù)據(jù)分析。當(dāng)多醣合成基因表達(dá)與其它綜合木質(zhì)特點(diǎn)例如強(qiáng)度、剛性和螺旋形性關(guān)聯(lián)時(shí)，使用類似技術(shù)與克隆繁殖單體可研究多醣合成基因表達(dá)。實(shí)例9實(shí)例9證明纖維素合成酶如何連接到組織優(yōu)選啟動(dòng)子，并且在松樹中表達(dá)，導(dǎo)致具有木質(zhì)密度增加的植物。以實(shí)例7中描述的方法識(shí)別多醣合成基因，所述多醣合成基因在早期春季更高度表達(dá)。將具有可操作性地連接到啟動(dòng)子的密度相關(guān)多肽的DNA構(gòu)造放于合適二元載體中，并使用本文所描述的方法將其轉(zhuǎn)型為松樹。如在本文中所描述轉(zhuǎn)型松樹植物，并且將所述轉(zhuǎn)基因松樹植物用于確立林業(yè)種植。相對(duì)于未以密度相關(guān)DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的控制松樹植物，在轉(zhuǎn)基因松樹植物中，甚至在春季木質(zhì)(早期木質(zhì))中即可觀測(cè)到密度增加。實(shí)例10使用分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已熟知的技術(shù)，在從紫花苜蓿分離的基因組DNA中分析實(shí)例9中分離的纖維素合成酶序列。這就使得紫花苜蓿中直系同源性的識(shí)別成為可能，接著將紫花苜蓿的序列用于建立RNAi剔除構(gòu)造。然后將這個(gè)構(gòu)造轉(zhuǎn)型入紫花苜蓿。參見例如Austin等人，Euphytica85，381(1995)。所述再生轉(zhuǎn)基因植物顯示低纖維含量與木質(zhì)部中射線細(xì)胞含量的增加。與相同種類野生型紫花苜蓿相比，所述特性改善可消化性，所述可消化性的改善導(dǎo)致喂食這種紫花苜蓿的?？焖偕L(zhǎng)。實(shí)例11實(shí)例11證明如何將基因表達(dá)分析用于在具有所需表型的成熟植物中發(fā)現(xiàn)存在于其中的基因變體。這個(gè)變體的出現(xiàn)或缺失可用于預(yù)測(cè)成熟植物表型，允許在子葉期篩選植物。盡管這個(gè)實(shí)例采用桉屬，但本文使用的方法也有益于松樹和其它樹種的培養(yǎng)計(jì)劃。公認(rèn)密度相關(guān)基因序列用于從桉屬分離的探針基因組DNA，如在前實(shí)例中所描述桉屬的密度可發(fā)生變化。研究不同木質(zhì)表型的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生桉屬雜交體。一個(gè)雜交體顯示高木質(zhì)密度，并且另一雜交體顯示低木質(zhì)密度。在編碼區(qū)的3′部分發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記，其將高密度基因變體從低密度基因變體區(qū)分開來(lái)。這個(gè)分子標(biāo)記使得當(dāng)樹木仍處于子葉期時(shí)，樹木育種人便能夠探測(cè)非轉(zhuǎn)基因桉屬雜交體的可能密度譜圖，然而當(dāng)缺少所述標(biāo)記時(shí)，樹木育種人必須等到樹木成長(zhǎng)多年，直到收獲時(shí)的密度能夠可靠預(yù)測(cè)之前，才能探測(cè)非轉(zhuǎn)基因桉屬雜交體的可能密度譜圖。這就使得最佳樹木在子葉期即可選擇性的出圃，而不是進(jìn)行昂貴精選并導(dǎo)致在疏伐階段腐蝕。這個(gè)分子標(biāo)記在培育階段測(cè)定何者親本將產(chǎn)生高密度異型雜交子代中進(jìn)一步有益。在基因的編碼區(qū)部分3′發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記也有益，所述分子標(biāo)記并不對(duì)應(yīng)于在較高或較低木質(zhì)密度非轉(zhuǎn)基因桉屬雜交體樹木中常見的變體。我們發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記對(duì)于桉屬的指紋不同表型有益，對(duì)于用在培育計(jì)劃與種植園中的一致性追蹤有益。實(shí)例12這個(gè)實(shí)例描述用于識(shí)別基因表達(dá)差異的微陣列，所述基因表達(dá)差異促成商業(yè)木質(zhì)中重要的表型特點(diǎn)，即木質(zhì)外觀、剛性、強(qiáng)度、密度、纖維尺寸、粗糙度、纖維素與木質(zhì)素含量、可提取含量與類似物質(zhì)含量。為從發(fā)育木質(zhì)部、形成層、韌皮部、葉、芽、根和其它組織收集和分離RNA，從不同地點(diǎn)和在一年的多個(gè)時(shí)間砍伐產(chǎn)生商業(yè)重要木質(zhì)產(chǎn)品的木質(zhì)樹種，在本發(fā)明狀況下是松屬和按屬。也從相同種的子葉分離RNA。將所有片段重疊群與由RNA制造的EST相比較，所述RNA從含有發(fā)育木質(zhì)的樣品中分離，并將所有片段重疊群與由多種組織的RNA制造的EST的序列相比較，所述多種組織并不含有發(fā)育木質(zhì)。測(cè)定主要含有EST的片段重疊群以對(duì)應(yīng)發(fā)育木質(zhì)中特定表達(dá)的可能的新穎基因，與由從不含有發(fā)育木質(zhì)的樣品分離的RNA制造的EST相比，片段重疊群的EST在計(jì)算機(jī)中顯示更傾向于雜交到由從含有發(fā)育木質(zhì)的樣品中分離的RNA制造的EST。接著將這些片段重疊群用于BLAST搜索公共域序列。下個(gè)步驟中選擇那些在計(jì)算機(jī)中以高度嚴(yán)謹(jǐn)性雜交到未知基因或雜交到被注解為僅具有“假定蛋白”的基因的片段重疊群。這些片段重疊群被公認(rèn)是顯示木質(zhì)優(yōu)選表達(dá)的新穎基因。使用分子生物學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員已熟知的技術(shù)從cDNA基因庫(kù)選擇最長(zhǎng)cDNA克隆體，所述cDNA克隆體含有雜交到顯示木質(zhì)優(yōu)選表達(dá)的公認(rèn)新穎基因的序列。將所述cDNA定序，并在可能之處獲得全長(zhǎng)基因編碼序列與未翻譯側(cè)翼序列。從顯示木質(zhì)優(yōu)選表達(dá)的公認(rèn)新穎基因的每一個(gè)序列選擇45到80核苷酸(或寡核苷酸)段，因此每一寡核苷酸探針在高度嚴(yán)謹(jǐn)性條件下僅雜交到在由RNA制造的EST中表示的一個(gè)序列，所述RNA從相同種的樹木或子葉分離。接著化學(xué)合成低聚物，并如實(shí)例4中所描述將其放置于微陣列載玻片上。每一低聚物對(duì)應(yīng)于顯示木質(zhì)優(yōu)選表達(dá)的公認(rèn)新穎基因的特定序列，而且并不對(duì)應(yīng)其它基因，所述其它基因的序列在由從相同種的樹木或幼苗分離的RNA制造的EST中表示。按照實(shí)例4進(jìn)行樣品制備和雜交。這個(gè)實(shí)例中使用的技術(shù)比使用cDNA探針的微陣列的使用更有效，因?yàn)楸硎咎囟ɑ虮磉_(dá)的顯著證據(jù)的信號(hào)的出現(xiàn)，而非許多基因中任一個(gè)的出現(xiàn)，由于保守功能域或共同進(jìn)化史，所述許多基因含有與cDNA的類似性。因此，可能區(qū)分同源基因，例如那些同一家族，但在表型測(cè)定中可能具有不同功能的基因。這個(gè)用實(shí)例6的方法獲得的雜交數(shù)據(jù)使得用戶能夠識(shí)別何者公認(rèn)新穎基因真正具有與已知基因協(xié)調(diào)的表達(dá)模式、與特定發(fā)育職能一致的表達(dá)模式和/或暗示基因具有以有用方式驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子的表達(dá)模式?？墒褂糜眠@個(gè)方法獲得的雜交數(shù)據(jù)，例如識(shí)別在發(fā)育春季木質(zhì)(早期木質(zhì))中顯示具有最低纖維素微纖維角度的管胞特定表達(dá)模式的公認(rèn)新穎基因。也可按照實(shí)例8分離這個(gè)基因的啟動(dòng)子，并且可可操作性地將其連接到如照實(shí)例9中所展示的基因，以與晚期木質(zhì)(夏季木質(zhì))相關(guān)聯(lián)。使用實(shí)例9的方法產(chǎn)生含有這種構(gòu)造的轉(zhuǎn)基因松樹植物，并且接著展示這些植物的早期木質(zhì)以顯示幾個(gè)晚期木質(zhì)特點(diǎn)，例如較高微纖維角度、較高密度、較小平均內(nèi)腔等等。實(shí)例13實(shí)例13證明使用功能性地連接到多醣合成基因的木質(zhì)部特異啟動(dòng)子以用于增加植物生物量。如在實(shí)例6中所描述，經(jīng)由不同次級(jí)維管結(jié)構(gòu)層的陣列分析識(shí)別木質(zhì)部特異多醣合成轉(zhuǎn)錄。使用(例如)BD克隆技術(shù)基因組行走套組(BDClontechGenomeWalkerkit)，從松樹染色體組DNA克隆候選啟動(dòng)子，所述候選啟動(dòng)子連接到對(duì)應(yīng)于這些轉(zhuǎn)錄的基因，并在轉(zhuǎn)基因煙草中經(jīng)由形成層的特異/優(yōu)選報(bào)導(dǎo)子探測(cè)測(cè)試所述候選啟動(dòng)子。過(guò)量表達(dá)次級(jí)木質(zhì)部細(xì)胞分裂中包括的多醣合成基因的木質(zhì)部特異啟動(dòng)子用于增加木質(zhì)生物量。構(gòu)造串接木質(zhì)部特異性啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)多醣合成基因ORF。提高候選多醣合成基因的轉(zhuǎn)錄水平可導(dǎo)致木質(zhì)部生物量表型的增加。***盡管參考示范性實(shí)施例描述了本發(fā)明，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，可做出多種變化，而且其元素可被對(duì)等元素取代。此外，在不偏離本發(fā)明的基本范圍的情況下，可做出許多改進(jìn)以使特定情況或物質(zhì)適于本發(fā)明的教導(dǎo)。因此，希望本發(fā)明不限制于涵蓋用于進(jìn)行本發(fā)明的最佳模式來(lái)揭示特定實(shí)施例。本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)和公開案以全文引用的方式并入本文中。序列表表1巨桉多醣合成基因表2輻射松多醣合成基因表3巨桉多醣合成肽表4輻射松多醣合成肽表5寡核苷酸序列權(quán)利要求1.一種經(jīng)分離的多核苷酸，其包含選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酸序列是選自由SEQIDNO1-2、7-14、16-18、20-21、24-25與27-30和其保守變體組成的群組。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有與桉屬或松屬種類的野生型植物中表達(dá)的基因中所包含的序列相一致的序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述變體與SEQIDNO1-29的任一個(gè)具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的序列一致性。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的經(jīng)分離的多核苷酸，其中變體編碼與SEQIDNO1-29的任一個(gè)具有大于或等于60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列一致性。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述變體編碼具有氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列與SEQIDNO30-58的任一個(gè)具有大于或等于60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列一致性，且其中通過(guò)所述多核苷酸編碼的所述蛋白擁有通過(guò)SEQIDNO1-29的所述任一個(gè)編碼的所述蛋白的活性。7.一種植物細(xì)胞，其以權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的多核苷酸轉(zhuǎn)型。8.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的多核苷酸。9.一種DNA構(gòu)造，其包含至少一個(gè)多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQIDNO1-29的任一個(gè)和其保守變體的序列。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA構(gòu)造，其進(jìn)一步包含一個(gè)啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子與所述多核苷酸可操作地連接。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)造，其中所述啟動(dòng)子是選自由組成型啟動(dòng)子、強(qiáng)啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、可調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子、暫時(shí)調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子和組織優(yōu)選型啟動(dòng)子組成的群組。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA構(gòu)造，其中所述多核苷酸編碼RNA轉(zhuǎn)錄物。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA構(gòu)造，其中所述多核苷酸相對(duì)于所述啟動(dòng)子處于同義或反義定向。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA構(gòu)造，其中所述RNA轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)多核苷酸的RNA干擾，所述多核苷酸具有選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列。15.一種植物細(xì)胞，其以權(quán)利要求14所述的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型。16.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求15所述的植物細(xì)胞。17.一種制造經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物的方法，其包含以權(quán)利要求14所述的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型一植物細(xì)胞；在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞。18.一種植物細(xì)胞，其以權(quán)利要求9所述的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型。19.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求18所述的植物細(xì)胞。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物的表型不同于相同種類的未經(jīng)所述DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物的表型。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中在所述轉(zhuǎn)基因植物中不同的表型是選自由以下各表型組成的群組木質(zhì)素質(zhì)量、木質(zhì)素結(jié)構(gòu)、木質(zhì)組成、木質(zhì)外觀、木質(zhì)密度、木質(zhì)強(qiáng)度、木質(zhì)剛性、纖維素聚合性、纖維尺寸、內(nèi)腔大小、花冠比例、導(dǎo)管分子比例、植物細(xì)胞分裂、植物細(xì)胞發(fā)育、單位面積的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、細(xì)胞壁組成、木質(zhì)形成速率、木質(zhì)審美外觀、干缺陷形成、平均微纖維角度、S2細(xì)胞壁層寬度、生長(zhǎng)速率、根的根形成速率與分枝植物發(fā)育的比、葉面積指數(shù)和葉形狀。22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是木質(zhì)植物。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是樹。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是桉屬或松屬種類。25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中與相同種類的未經(jīng)所述DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物相比，所述植物呈現(xiàn)選自由以下各特點(diǎn)組成的群組的一個(gè)或一個(gè)以上特點(diǎn)干旱耐受性增加、除草劑抗性、高度減小或增大、分枝減少或增多、冷凍或霜耐受性增強(qiáng)、生命力改善、色彩增強(qiáng)、健康與營(yíng)養(yǎng)特征增強(qiáng)、儲(chǔ)藏改善、產(chǎn)率提高、鹽耐受性增強(qiáng)、木質(zhì)腐爛抗性增強(qiáng)、真菌疾病抗性增強(qiáng)、蟲害吸引力改變、疾病耐受性增大、昆蟲耐受性增大、水壓耐受性增大、質(zhì)地改善、發(fā)芽率增大、微量營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量增大、新穎樹脂產(chǎn)生、纖維素含量增大、木質(zhì)素含量降低和新穎蛋白或多肽產(chǎn)生。26.根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中與相同種類的未經(jīng)所述DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物相比，所述植物呈現(xiàn)選自由以下各特點(diǎn)組成的群組的一個(gè)或一個(gè)以上特點(diǎn)不成熟期降低、不成熟期增加、形成反應(yīng)性木質(zhì)傾向、自我脫落分枝、生殖發(fā)育加速或生殖發(fā)育延遲。27.一種經(jīng)分離的多核苷酸，其包含編碼選自SEQIDNO30-58的任一個(gè)的多肽的催化性或基質(zhì)結(jié)合域的序列，其中所述多核苷酸編碼一多肽，所述多肽具有選自SEQIDNO30-58的任一個(gè)的所述多肽的活性。28.一種制造經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物的方法，其包含以DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)造包含至少一個(gè)具有SEQIDNO1-29的任一個(gè)的序列的多核苷酸，和在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述DNA構(gòu)造進(jìn)一步包含一啟動(dòng)子，其中所述多核苷酸與所述啟動(dòng)子可操作地連接。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述至少一個(gè)多核苷酸編碼選自由纖維素合成酶和纖維素合成酶類似蛋白組成的群組的蛋白。31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述植物細(xì)胞位于植物移植組織中。32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物呈現(xiàn)不同于相同種類的未經(jīng)所述DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物的表型。33.根據(jù)權(quán)利要求28所述方法，其中在所述轉(zhuǎn)基因植物中不同的表型是選自由以下各表型組成的群組木質(zhì)素質(zhì)量、木質(zhì)素結(jié)構(gòu)、木質(zhì)組成、木質(zhì)外觀、木質(zhì)密度、木質(zhì)強(qiáng)度、木質(zhì)剛性、纖維素聚合性、纖維尺寸、內(nèi)腔大小、花冠比例、導(dǎo)管分子比例、植物細(xì)胞分裂、植物細(xì)胞發(fā)育、單位面積的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、細(xì)胞壁組成、木質(zhì)形成速率、木質(zhì)審美外觀、干缺陷形成、平均微纖維角度、S2細(xì)胞壁層寬度、生長(zhǎng)速率、根的根形成速率與分枝植物發(fā)育的比、葉面積指數(shù)和葉形狀。34.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中與相同種類的未經(jīng)所述DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物呈現(xiàn)選自由以下各特點(diǎn)組成的群組的一個(gè)或一個(gè)以上特點(diǎn)干旱耐受性增加、除草劑抗性、高度減小或增大、分枝減少或增多、冷凍或霜耐受性增強(qiáng)、生命力改善、色彩增強(qiáng)、健康與營(yíng)養(yǎng)特征增強(qiáng)、儲(chǔ)藏改善、產(chǎn)率提高、鹽耐受性增強(qiáng)、木質(zhì)腐爛抗性增強(qiáng)、真菌疾病抗性增強(qiáng)、蟲害吸引力改變、疾病耐受性增大、昆蟲耐受性增大、水壓耐受性增大、質(zhì)地改善、發(fā)芽率增大、微量營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量增大、新穎樹脂產(chǎn)生、纖維素含量增大、木質(zhì)素含量降低和新穎蛋白或多肽產(chǎn)生。35.一種從轉(zhuǎn)基因樹獲得的木質(zhì)，所述轉(zhuǎn)基因樹經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型。36.一種轉(zhuǎn)基因樹獲得的木漿，所述轉(zhuǎn)基因樹已以權(quán)利要求9所述的DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的木漿，其中所述DNA構(gòu)造包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO30-58的任一個(gè)的氨基酸序列。38.一種制造木質(zhì)的方法，其包含以DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型一植物，所述DNA構(gòu)造包含具有選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列的多核苷酸；在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物；和從所述植物獲得木質(zhì)。39.一種制造木漿的方法，其包含以DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型一植物，所述DNA構(gòu)造包含具有選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列的多核苷酸；在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物；和從所述植物獲得木漿。40.一種經(jīng)分離的多肽，其包含通過(guò)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的多核苷酸編碼的氨基酸序列。41.一種經(jīng)分離的多肽，其包含選自由SEQIDNO30-58組成的群組的氨基酸序列。42.一種改變植物的植物表型的方法，其包含改變通過(guò)SEQIDNO1-29的任一個(gè)編碼的多肽在所述植物中的表達(dá)。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述表達(dá)經(jīng)上調(diào)、下調(diào)、沉默或發(fā)育調(diào)節(jié)。44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述植物是木質(zhì)植物。45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述植物表型是選自由以下各表型組成的群組木質(zhì)素質(zhì)量、木質(zhì)素結(jié)構(gòu)、木質(zhì)組成、木質(zhì)外觀、木質(zhì)密度、木質(zhì)強(qiáng)度、木質(zhì)剛性、纖維素聚合性、纖維尺寸、內(nèi)腔大小、花冠比例、導(dǎo)管分子比例、植物細(xì)胞分裂、植物細(xì)胞發(fā)育、單位面積的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、細(xì)胞壁組成、木質(zhì)形成速率、木質(zhì)審美外觀、干缺陷形成、平均微纖維角度、S2細(xì)胞壁層寬度、生長(zhǎng)速率、根的根形成速率與分枝植物發(fā)育的比、葉面積指數(shù)和葉形狀。46.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中與相同種類的未經(jīng)所述DNA構(gòu)造轉(zhuǎn)型的植物相比，所述植物呈現(xiàn)選自由以下各特點(diǎn)組成的群組的一個(gè)或一個(gè)以上特點(diǎn)干旱耐受性增加、除草劑抗性、高度減小或增大、分枝減少或增多、冷凍或霜耐受性增強(qiáng)、生命力改善、色彩增強(qiáng)、健康與營(yíng)養(yǎng)特征增強(qiáng)、儲(chǔ)藏改善、產(chǎn)率提高、鹽耐受性增強(qiáng)、木質(zhì)腐爛抗性增強(qiáng)、真菌疾病抗性增強(qiáng)、蟲害吸引力改變、疾病耐受性增大、昆蟲耐受性增大、水壓耐受性增大、質(zhì)地改善、發(fā)芽率增大、微量營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量增大、新穎樹脂產(chǎn)生、纖維素含量增大、木質(zhì)素含量降低和新穎蛋白或多肽產(chǎn)生。47.一種多核苷酸，其包含選自由SEQIDNO59-83組成的群組的核酸序列。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由少于約100個(gè)核苷酸堿基組成。49.一種使兩個(gè)不同樣品中的基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)的方法，其包含探測(cè)編碼產(chǎn)物的一個(gè)或一個(gè)以上基因在第一樣品中的表達(dá)水平，所述產(chǎn)物通過(guò)選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列編碼；探測(cè)所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在第二樣品中的表達(dá)水平；將所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在所述第一樣品中的所述表達(dá)水平與所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在所述第二樣品中的所述表達(dá)水平相比較；和使所述第一樣品與第二樣品之間的所述一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)水平差異相關(guān)聯(lián)。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述第一樣品與所述第二樣品各自來(lái)自不同類型的植物組織。51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述第一樣品為正常木質(zhì)且所述第二樣品為反應(yīng)性木質(zhì)。52.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述第一樣品與所述第二樣品來(lái)自相同組織，且其中所述第一樣品與所述第二樣品各自在一年中的不同季節(jié)期間收獲。53.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述第一樣品與所述第二樣品是從處于不同發(fā)育階段的植物獲得。54.一種使植物表型擁有物與一個(gè)或多個(gè)基因在所述植物中的基因表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)的方法，其包含探測(cè)編碼產(chǎn)物的一個(gè)或一個(gè)以上基因在擁有一表型的第一植物中的表達(dá)水平，所述產(chǎn)物通過(guò)選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列編碼；探測(cè)所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在缺少所述表型的第二植物中的表達(dá)水平；將所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在所述第一植物中的所述表達(dá)水平與所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在所述第二植物中的所述表達(dá)水平相比較；和使所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在所述第一與第二植物之間的表達(dá)水平差異與所述表型擁有物相關(guān)聯(lián)。55.一種使基因表達(dá)與形成反應(yīng)性木質(zhì)的傾向相關(guān)聯(lián)的方法，其包含探測(cè)編碼產(chǎn)物的一個(gè)或一個(gè)以上基因在顯示正常木質(zhì)表型的木質(zhì)部中的第一植物細(xì)胞中的表達(dá)水平，所述產(chǎn)物通過(guò)選自由SEQIDNO1-29和其保守變體組成的群組的核酸序列編碼；探測(cè)所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在顯示反應(yīng)性木質(zhì)表型的木質(zhì)部中的第二植物細(xì)胞中的表達(dá)水平；將所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在所述第一植物細(xì)胞中的所述表達(dá)水平與所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在所述第二植物細(xì)胞中的所述表達(dá)水平相比較；和使所述一個(gè)或一個(gè)以上基因在所述第一與第二樣品之間的表達(dá)水平差異與形成反應(yīng)性木質(zhì)的所述傾向相關(guān)聯(lián)。56.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述第一與第二植物或植物細(xì)胞是選自桉屬和松屬種類的相同種類。57.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述第一與第二植物或植物細(xì)胞是選自巨桉和輻射松的種類。58.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中使用一個(gè)或一個(gè)以上多核苷酸來(lái)實(shí)施所述探測(cè)步驟，所述多核苷酸在標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件下能夠雜交到選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列。59.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中使用一個(gè)或一個(gè)以上多核苷酸來(lái)實(shí)施所述探測(cè)步驟，所述多核苷酸在標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件下能夠雜交到通過(guò)選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列編碼的基因產(chǎn)物。60.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中通過(guò)雜交到經(jīng)標(biāo)記的核酸來(lái)實(shí)施所述探測(cè)步驟。61.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中以可探測(cè)的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記所述一個(gè)或一個(gè)以上多核苷酸。62.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上多核苷酸的至少一個(gè)雜交到所述一個(gè)或一個(gè)以上基因之一的3′未翻譯區(qū)。63.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上多核苷酸的至少一個(gè)雜交到所述一個(gè)或一個(gè)以上基因的一個(gè)基因的所述3′未翻譯區(qū)。64.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上多核苷酸包含選自由SEQIDNO59-83組成的群組的核酸序列。65.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上多核苷酸包含選自由SEQIDNO59-83組成的群組的核酸序列。66.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上多核苷酸是選自由DNA和RNA組成的群組。67.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上多核苷酸是選自由DNA和RNA組成的群組。68.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其在所述探測(cè)步驟之前進(jìn)一步包含放大所述第一和第二植物或植物細(xì)胞中的所述一個(gè)或一個(gè)以上基因的步驟。69.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其在所述檢定探測(cè)之前進(jìn)一步包含在所述第一與第二植物或植物細(xì)胞中以可探測(cè)的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記所述一個(gè)或一個(gè)以上基因的步驟。70.一種用于探測(cè)一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)的組合，其包含兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸，其中每一寡核苷酸都能夠雜交到選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列。71.一種用于探測(cè)一個(gè)或一個(gè)以上基因的表達(dá)的組合，其包含兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸，其中每一寡核苷酸都能夠雜交到通過(guò)選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列編碼的基因產(chǎn)物。72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一者都雜交到選自由SEQIDNO1-29組成的群組的所述核酸序列的一個(gè)不同核酸序列。73.根據(jù)權(quán)利要求71所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一者都雜交到通過(guò)選自由SEQIDNO1-29組成的群組的所述核酸序列的一個(gè)不同核酸序列編碼的核苷酸序列。74.根據(jù)權(quán)利要求71所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的至少一個(gè)雜交到選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列的3′未翻譯區(qū)。75.根據(jù)權(quán)利要求71所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的至少一個(gè)雜交到與選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列的3′未翻譯區(qū)互補(bǔ)的核酸序列。76.根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都由少于約100個(gè)核苷酸堿基組成。77.根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的至少一個(gè)包含選自由SEQIDNO59-83組成的群組的核酸序列。78.根據(jù)權(quán)利要求71所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的至少一個(gè)包含是選自由SEQIDNO59-83組成的群組的核酸序列。79.根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都雜交到編碼選自由纖維素合成酶與纖維素合成酶類似蛋白組成的群組的蛋白的基因。80.根據(jù)權(quán)利要求71所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都雜交到通過(guò)編碼選自由纖維素合成酶和纖維素合成酶類似蛋白組成的群組的蛋白的基因編碼的核酸序列。81.根據(jù)權(quán)利要求79所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都雜交到編碼所述蛋白的一個(gè)不同蛋白的基因。82.根據(jù)權(quán)利要求80所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸的每一個(gè)都雜交到通過(guò)編碼所述蛋白的一個(gè)不同蛋白的基因編碼的核酸序列。83.根據(jù)權(quán)利要求79所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸的每一個(gè)都雜交到一個(gè)不同基因。84.根據(jù)權(quán)利要求80所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸的每一個(gè)都雜交到通過(guò)不同基因編碼的核酸序列。85.根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合，其包含所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸的約2個(gè)到約5000個(gè)。86.根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都以可探測(cè)的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。87.一種微陣列，其包含在固體支撐件上提供的權(quán)利要求70所述的組合，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸的每一者在所述固體支撐件上占據(jù)一個(gè)獨(dú)特位置。88.一種用于探測(cè)一樣品中一個(gè)或一個(gè)以上基因的方法，其包含使所述樣品與兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸接觸，其中每一寡核苷酸在標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件下都能夠雜交到包含選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列的基因；和探測(cè)雜交到所述一個(gè)或一個(gè)以上寡核苷酸的所述一個(gè)或一個(gè)以上有關(guān)基因。89.一種用于探測(cè)一樣品中通過(guò)一個(gè)或一個(gè)以上基因編碼的一個(gè)或一個(gè)以上核酸序列的方法，其包含使所述樣品與兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸接觸，其中每一寡核苷酸在標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件下都能夠雜交到通過(guò)包含選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列的基因編碼的核酸序列；和探測(cè)雜交到所述一個(gè)或一個(gè)以上寡核苷酸的所述一個(gè)或一個(gè)以上核酸序列。90.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都雜交到包含選自由SEQIDNO1-29組成的群組的所述核酸序列的一個(gè)不同核酸序列的基因。91.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都雜交到通過(guò)包含選自由SEQIDNO1-29組成的群組的所述核酸序列的一個(gè)不同核酸序列的基因編碼的核酸序列。92.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的至少一個(gè)雜交到包含選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列的基因的3′未翻譯區(qū)。93.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的至少一個(gè)雜交到與包含選自由SEQIDNO1-29組成的群組的核酸序列的基因的3′未翻譯區(qū)互補(bǔ)的核酸序列。94.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都由少于約100個(gè)核苷酸堿基組成。95.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的至少一個(gè)包含選自由SEQIDNO59-83組成的群組的核酸序列。96.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的至少一個(gè)包含是選自由SEQIDNO59-83組成的群組的核酸序列。97.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都雜交到編碼選自由纖維素合成酶和纖維素合成酶類似蛋白組成的群組的蛋白的基因。98.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都雜交到通過(guò)編碼選自由纖維素合成酶和纖維素合成酶類似蛋白組成的群組的蛋白的基因編碼的核酸序列。99.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都雜交到編碼所述蛋白的一個(gè)不同蛋白的基因。100.根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)都雜交到通過(guò)編碼所述蛋白的一個(gè)不同蛋白的基因編碼的核酸序列。101.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中在一固體支撐件上提供所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸，其中所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸中的每一個(gè)在所述固體支撐件上都占據(jù)一個(gè)獨(dú)特位置。102.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述固體支撐件包含所述兩個(gè)或兩個(gè)以上寡核苷酸的約2個(gè)到約5000個(gè)。103.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其在所述接觸步驟之前進(jìn)一步包含放大所述樣品中的所述一個(gè)或一個(gè)以上基因或核酸序列的步驟。104.根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其在所述接觸步驟之前進(jìn)一步包含在所述樣品中以可探測(cè)的標(biāo)記來(lái)標(biāo)記所述一個(gè)或一個(gè)以上基因或核酸序列的步驟。105.一種用于探測(cè)基因表達(dá)的套組，其包含權(quán)利要求87所述的微陣列和用于核苷酸雜交反應(yīng)的一個(gè)或一個(gè)以上緩沖液或試劑。全文摘要本發(fā)明提供新穎植物多醣合成基因和通過(guò)所述基因編碼的多肽。這些基因和多核苷酸序列適用于調(diào)節(jié)多醣合成和植物表型。另外，這些基因適用于植物多醣合成基因的表達(dá)分布。文檔編號(hào)A01H1/00GK1871352SQ200480021499公開日2006年11月29日申請(qǐng)日期2004年6月7日優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日發(fā)明者倫納德·N·布洛克斯貝格,瑪麗·B·康內(nèi)特－波爾切杜,薩拉·簡(jiǎn)·埃默森,邁克爾·J·弗羅斯特,理查德·盧埃林·辛迪·弗羅斯特,默里·羅伯特·格里戈?duì)?伊爾卡·哈烏卡拉,科倫·M·希金斯,羅伯特·J·科德奇基,史蒂文·特洛伊·倫德,安德烈亞斯·馬古辛申請(qǐng)人:阿博根有限公司