專利名稱：一種大車前的體外繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的體外繁殖方法，特別是涉及大車前的一種體外繁殖方法。
背景技術(shù)：
車前屬(Plantago)植物全世界有190余種，多數(shù)分布于受人為干擾強(qiáng)烈的環(huán)境中，該屬中的許多種類屬于典型的雜草，是理論生態(tài)學(xué)、生理生態(tài)學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)研究的理想材料。該屬植物的藥用價(jià)值也較高，其中，車前(Plantago.asiatica)、大車前(Plantago.major)和平車前(Plantago.depressa)等歷來被列為中藥中的上品，全草及種子皆可入藥。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，車前子有利水通淋、清肝明目的功效，可用于治療小便不利、水腫等病癥(Ji DH(季大洪)，Xiao ZY(肖振宇).Study andapplication of chinese traditional medicine Plantain.The Journal ofPharmaceutical Practice(藥學(xué)實(shí)踐雜志)，2001，19(6)361-362)。目前，對車前屬植物的現(xiàn)代藥理學(xué)研究也在不斷地深入進(jìn)行當(dāng)中。
車前屬中包括大約20種鹽生植物，例如Plantago maritima L.能夠耐受環(huán)境中250-300mM NaCl濃度；Plantago.coronopus L.能夠在150mM NaCl環(huán)境中生存(Oscar V.，Monica B.，Miguel Angel N.，et al.Responses to salt stress in thehalophyte Plantago crassifolia(Plantaginaceae).Journal of AridEnvironments，2004，58463-481)，它們都可作為鹽堿灘涂的先鋒植物加以應(yīng)用，對灘涂鹽堿地的改造、防風(fēng)固沙、水土保持、環(huán)境溫度調(diào)節(jié)等方面具有積極作用，同時(shí)又是固碳、供氧和轉(zhuǎn)化能量的良好材料的植物，但它們均存在生物量小的缺陷。與車前屬其它種類植物相比，大車前(Plantago major L.)具有生物量大的特點(diǎn)，其園藝品種除可作為藥用和觀賞植物外，現(xiàn)正致力于將其開發(fā)為蔬菜品種。研究表明，大車前對鹽分比較敏感在68.4mM(0.4％)NaCl濃度下，其生長便受到抑制，在111.2mM(0.65％)NaCl濃度下，相對生長量只達(dá)到正常生長條件下對照植株的一半。基于大車前具有上述優(yōu)點(diǎn)，迫切需要一種大車前的體外培養(yǎng)和再生方法，以期獲得能夠大量積累有效藥用成分的突變體及大車前的耐鹽突變體。
有關(guān)車前屬植物的組織培養(yǎng)研究的報(bào)道較少，涂藝聲(Tu YS(涂藝聲).Cultivation of Plantago asiatica in vitro and plantlet regeneration..JiangxiScience(江西科學(xué))，1995，13(3)149-152)和王秀芝(Wang XZ(王秀芝)，Wang L(王琳)，Hon XY(侯信營).Tissue culture and plantlet regeneration of Plantagoasiatica.Plant physiology Communications(植物生理學(xué)通訊)，1998，34(3)204)等分別用不同的外植體實(shí)現(xiàn)了國內(nèi)常見野生種車前(Plantago asiatica L.)愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生；王秀芝等對平車前(Plantago depressa Willd.)的組織培養(yǎng)工作也有過報(bào)道(Wang XZ(王秀芝)，Zhang QP(張謙鵬)，Guo SL(郭善利).Tissueculture of Plantago depressa Willd.Jounal of Liaocheng Teachers College(Nat.Sci.)(聊城師院學(xué)報(bào)自然科學(xué)版)，1997，10(2)82-85)。Mederos等對大車前(Plantago major L.)的微繁(micropropagation)作了相關(guān)研究，取12mm長的頂芽在補(bǔ)充葡萄糖和0.5μM BAP(6-benzylaminopurine)的改良MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，25天后觀察到芽的增殖，平均每個頂芽可得到7個增殖芽(Mederos S.，MartinC.，Navarro E.，et al.Micropropagation of a medicinal plant，Plantago majorL..Biologia Plantarum，1997/98；40(3)465-468)。但以頂芽為外植體，可取的材料不多，并受植物生長階段的限制，迄今未得到培養(yǎng)細(xì)胞系。上述研究工作為大車前的組織培養(yǎng)方法的建立提供了參考，但同屬不同種的植物盡管進(jìn)化關(guān)系相近，但基因型不同，對組培條件的要求也相差甚遠(yuǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供大車前的培育周期較短、產(chǎn)率較高的一種體外繁殖方法。
本發(fā)明所提供的大車前的體外繁殖方法，包括以下步驟1)以種子為外植體，將其接種于直接再生培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽；直接再生培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了噻二唑苯基脲(TDZ)和吲哚乙酸(IAA)；2)將不定芽置于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。
直接再生培養(yǎng)基中TDZ的濃度為0.5-4.0mg/L，優(yōu)選為1.0mg/L；IAA的濃度為0.1-0.3mg/L，優(yōu)選為0.2mg/L。
所述培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，光照時(shí)間10-14h/天，光照強(qiáng)度2500-3500lux；優(yōu)選的培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，光照時(shí)間12h/天，光照強(qiáng)度3000lux。
所述不定芽的誘導(dǎo)時(shí)間為28-42天，優(yōu)選為35天。
本發(fā)明所提供的大車前(Plantago major L.″Giant Turkish.″)的體外培養(yǎng)方法，是以大車前種子作為外植體，通過誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生、得到再生株系，從種子到再生株系只需要4-5周時(shí)間，平均每個外植體得到14.6個叢生芽，提高了培養(yǎng)效率，也為在植物組織水平進(jìn)行相關(guān)研究提供了前提和保障。本發(fā)明為篩選具有高生物量的大車前抗鹽突變體和基因轉(zhuǎn)化建立了高效的體外再生系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)平臺體系，同時(shí)，可在保持高生物量產(chǎn)出的基礎(chǔ)上篩選出有價(jià)值的細(xì)胞系，以獲得能夠大量積累有效藥用成分的突變體及大車前的耐鹽突變體；此外，還可在此基礎(chǔ)上建立基因轉(zhuǎn)化體系，把有利的農(nóng)藝性狀以及相關(guān)抗性基因轉(zhuǎn)入大車前，從而提高大車前的品質(zhì)和抗逆性。


圖1為葉片外植體在培養(yǎng)基DRM-1上生長5周后不定芽的再生情況圖2為種子外植體在培養(yǎng)基DRM-1上生長3周后不定芽的再生情況圖3為種子外植體在培養(yǎng)基DRM-1上生長5周后不定芽的再生情況圖4為在引物S252引導(dǎo)下的再生植株進(jìn)行RADP分析的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖5為在引物S256引導(dǎo)下的再生植株進(jìn)行RADP分析的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖6為在引物S405引導(dǎo)下的再生植株進(jìn)行RADP分析的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、大車前的體外繁殖植物材料大車前的園藝品種(Plantago major L.″Giant Turkish.″)，種子購自Horizon Herbs公司(Oregon，USA)。
一、不同濃度的TDZ對不定芽再生的影響將大車前的園藝品種(Plantago major L.″Giant Turkish.″)的種子50℃催芽1h后，用常規(guī)方法進(jìn)行消毒(用70％酒精消毒30s后，用10％NaClO消毒15min，最后用無菌水沖洗4次)，將其作為外植體接種于表1所列的含不同濃度激素的外植體直接再生培養(yǎng)基(DRM1-DRM4，在MS基本培養(yǎng)基(參照文獻(xiàn)Murashige T，Skoog F.Arevised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant，1962，15473-497配制)的基礎(chǔ)上添加TDZ和IAA)上，DRM1-DRM4培養(yǎng)基中TDZ濃度形成梯度，依次為0.5、1.0、2.0、4.0mg/L，IAA的濃度為0.2mg/L。培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，光照12h/天，光照強(qiáng)度3,000lux。觀察并記錄數(shù)據(jù)，分別于第四周和第五周統(tǒng)計(jì)不定芽的再生數(shù)量及再生頻率，結(jié)果如表1所示，種子外植體在DRM-1、DRM-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后的再生率比在DRM-2、DRM-4培養(yǎng)基上的再生率高，5周后再生率均達(dá)到100％，但在DRM-1、DRM-2培養(yǎng)基上得到的再生苗比DRM-3、DRM-4上長出的再生苗的生活力強(qiáng)，外植體在DRM-1培養(yǎng)基上培養(yǎng)5周后的叢生芽數(shù)目最多。因此，將含1.0mg/L TDZ和0.2mg/L IAA的MS培養(yǎng)基(DRM-1)作為本發(fā)明所用的優(yōu)選的外植體直接再生培養(yǎng)基。
表1 不同培養(yǎng)基上不定芽再生頻率


*上述不同激素組合添加于MS基本培養(yǎng)基中；數(shù)據(jù)為兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值二、不同外植體直接再生不定芽的比較及再生植株的獲得用與步驟一相同的方法對大車前(Plantago major L.″Giant Turkish.″)的種子進(jìn)行催芽及消毒處理，在無菌條件下，將其接種于MS固體培養(yǎng)基上，(25±1)℃下暗培養(yǎng)，2天后轉(zhuǎn)移至光下培養(yǎng)，約6周后成苗。分別取上述6周無菌苗的葉片和發(fā)芽4周無菌苗的下胚軸作為外植體，接種于直接再生培養(yǎng)基DRM-1上，4周后有近半數(shù)外植體褐化死亡，生長5周后的葉片外植體的不定芽再生情況如圖1所示；存活的外植體在傷口處產(chǎn)生小團(tuán)綠色愈傷，直接出現(xiàn)再生芽的頻率很低?？梢娪萌~片和下胚軸作為外植體來產(chǎn)生不定芽的效率很低。
將用步驟一方法處理得到的種子外植體接種于外植體再生培養(yǎng)基DRM-1上，4-5天后發(fā)芽，3周后(如圖2所示)可觀察到下胚軸部分膨大、長出小芽，同時(shí)根不再向下伸展。此后，苗與培養(yǎng)基接觸的部分持續(xù)膨大、叢生多個小芽。5周后(如圖3所示)每個外植體再生芽的平均數(shù)目為10個以上，最多可達(dá)20個。5-6周后扦插叢生芽到MS培養(yǎng)基上，正常生根，并長成完整植株。
實(shí)施例2、再生植株的RAPD分析植物體細(xì)胞無性系變異是植物組織培養(yǎng)中的普遍現(xiàn)象。選用20條隨機(jī)引物引物序列如表2所示，對實(shí)施例1由不定芽發(fā)生形成的大車前再生植株進(jìn)行RAPD分析以確定再生植株的變異情況，具體方法為采用CTAB法提取再生植株的基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行RAPD分析，20uL RAPD反應(yīng)體系(不加礦物油)為引物(8pmol/L，Sangon公司)2uL，Taq DNA聚合酶(2.5U/uL，北京天為時(shí)代生物技術(shù)公司)0.5uL，10×緩沖液2uL，基因組DNA 1.5uL，dNTP(10mmol/L，Sangon公司)0.5uL，超純水13.5uL。擴(kuò)增程序?yàn)橄?4℃( 4min；再94℃ 1min，36℃ 1min，72℃ 2min，共40個循環(huán)；最后72℃ 10min。反應(yīng)在同一PCR儀(Whatman BiometraT-gradient PCR儀)中完成。反應(yīng)結(jié)束后，取10uL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，Alphaimager凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。其中，在引物S252、S256、S405引導(dǎo)下的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖4-6所示(泳道M為DL2000 Ladder DNAMarker，泳道1-9為再生植株，泳道10為親本對照)，圖4為以引物S252對再生植株進(jìn)行RAPD分析的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，再生植株4擴(kuò)增出了一條特異條帶(箭頭所指)，圖5為以引物S256對再生植株進(jìn)行RAPD分析的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，再生植株5擴(kuò)增出了一條特異條帶(箭頭所指)，圖6為以引物S405對再生植株進(jìn)行RAPD分析的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，再生植株5擴(kuò)增出了一條特異條帶(箭頭所指)，表明用引物S252、S256、S405擴(kuò)增可檢測到對照親本和再生植株在DNA水平上有差異。20條隨機(jī)引物的RAPD分析結(jié)果如表2所示，每條引物分別擴(kuò)增出4-8條帶，20條引物在基因組DNA中擴(kuò)增共得到115條電泳條帶，絕大多數(shù)擴(kuò)增條帶大小在200-2000bp之間。其中有3條引物(S252、S256、S405)檢測到了對照親本和再生植株在DNA水平上的差異，表明用本發(fā)明的繁殖方法得到再生植株在分子水平上有變異的發(fā)生，變異頻率約為2.6％。
表2 再生植株的RAPD結(jié)果統(tǒng)計(jì)

權(quán)利要求
1.大車前的一種體外繁殖方法，包括以下步驟1)以種子為外植體，將其接種于直接再生培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽；直接再生培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了噻二唑苯基脲和吲哚乙酸；2)將不定芽置于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的繁殖方法，其特征在于所述直接再生培養(yǎng)基中噻二唑苯基脲的濃度為0.5-4.0mg/L，吲哚乙酸的濃度為0.1-0.3mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的繁殖方法，其特征在于所述直接再生培養(yǎng)基中噻二唑苯基脲的濃度為1.0mg/L，吲哚乙酸的濃度為0.2mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的繁殖方法，其特征在于所述培養(yǎng)條件為溫度24-26℃，光照時(shí)間10-14h/天，光照強(qiáng)度2500-3500lux。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的繁殖方法，其特征在于所述培養(yǎng)條件為溫度25℃，光照時(shí)間12h/天，光照強(qiáng)度3000lux。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的繁殖方法，其特征在于所述不定芽的誘導(dǎo)時(shí)間為28-42天。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的繁殖方法，其特征在于所述不定芽的誘導(dǎo)時(shí)間為35天。
全文摘要
本發(fā)明公開了大車前的一種體外繁殖方法。該方法包括以下步驟1)以種子為外植體，將其接種于直接再生培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽；直接再生培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了噻二唑苯基脲和吲哚乙酸；2)將不定芽置于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。本發(fā)明為篩選具有高生物量的大車前抗鹽突變體和基因轉(zhuǎn)化建立了高效的體外再生系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)平臺體系，同時(shí)，可在保持高生物量產(chǎn)出的基礎(chǔ)上篩選出有價(jià)值的細(xì)胞系，以獲得能夠大量積累有效藥用成分的突變體及大車前的耐鹽突變體；此外，還可在此基礎(chǔ)上建立基因轉(zhuǎn)化體系，把有利的農(nóng)藝性狀以及相關(guān)抗性基因轉(zhuǎn)入大車前，從而提高大車前的品質(zhì)和抗逆性。
文檔編號A01H4/00GK1685811SQ20051007490
公開日2005年10月26日 申請日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者李銀心, 李平 申請人:中國科學(xué)院植物研究所