專利名稱：經修飾的胞外體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明與生物學和免疫學的領域有關。其涉及含具有特定結構的分子的膜囊泡，特別是含抗原分子的膜囊泡，及其用途。其更特別涉及含主要組織相容性復合體的重組分子的囊泡，及其作為免疫原性試劑或作為診斷或治療工具的用途。本發(fā)明亦涉及制備這些囊泡、基因構建體、細胞和組合物的方法，其可用以實施本發(fā)明方法。
抗原識別的特異性為免疫系統(tǒng)細胞的主要特性。B淋巴細胞識別天然形式的抗原。T淋巴細胞識別由抗原降解衍生的肽與主要組織相容性復合體(MHC)分子結合形成的復合物。從生物細胞合成的抗原(腫瘤或病毒抗原)衍生的肽與Ⅰ類MHC分子結合，其為細胞毒性T淋巴細胞所識別。從外源抗原衍生的肽與Ⅱ類MHC分子結合，其為輔助T淋巴細胞所識別。為MHC分子所呈遞及為細胞毒性(CD8)或輔助(CD4)T淋巴細胞識別的肽的鑒定是新穎的治療與疫苗策略的開始。此免疫療法的進展需要評估抗原特異免疫性反應的技術的發(fā)展。
抗原肽與MHC分子在細胞內區(qū)室結合。以Ⅱ類分子而言，其由屬于細胞內吞途徑的較大顆粒中所含的囊泡組成(Peters等人，自然(Nature)349(1991)669)。其與質膜的融合首先導致肽-MHC復合物在細胞表面上的表達，其次導致稱為胞外體(exosome)的這些囊泡的分泌。
Raposo等人的研究(J.Exp.Med.183(1996)1161)已顯示B淋巴細胞能分泌載有Ⅱ類MHC分子的胞外體囊泡。而且，Zitvogel等人(自然醫(yī)學(Nature Medicine)4(1998)594)已證明由具有利性質的樹狀細胞(稱為右體)產生特殊的膜囊泡。因此，這些囊泡表達Ⅰ類和Ⅱ類MHC分子，并在對相應抗原敏感后，能刺激細胞毒性T淋巴細胞的體內產生及能引起腫瘤的全部或部分再吸收。
本發(fā)明涉及可用于生物學和免疫學領域的新穎方法及組合物。更特別的是，本發(fā)明描述新穎膜囊泡，其組成已以限定方式修飾。特別是，本發(fā)明描述一種新穎方法，其能特供產生表達已知組成的MHC復合物分子且視情況與限定結構的抗原肽復合的膜。因此，有可能用本發(fā)明以控制方式修飾膜囊泡的組成，并因而創(chuàng)造在治療、診斷或甚至實驗水平下特別有利的產物。
截至目前，在最佳情形下，所述的囊泡含內源MHC分子，即由其所衍生的細胞表達的MHC分子。在此考量下，這些分子具有變化的結構，其結構不總是經過鑒定的，且這些分子通常是多重的，這依其所產生的生物HLA型而定。相反地，使用本發(fā)明，有可能產生載有規(guī)定組成的MHC分子的膜囊泡。而且，本發(fā)明的囊泡具有以下的優(yōu)點，即含以此方式確定的高數(shù)目MHC分子，及其提供有力的免疫原性。
本發(fā)明特別涉及含具有特定結構分子的膜囊泡，特別是含具有特定結構的MHC分子的膜囊泡。本發(fā)明特別涉及含具有特定結構的MHC-肽復合物的膜囊泡。本發(fā)明亦涉及一種修飾膜囊泡組成的方法，包括將含由與尋址區(qū)域融合的編碼區(qū)域所組成的雜交區(qū)域的核酸、或編碼蛋白質或多肽的核酸(其蛋白質或多肽(單獨或與一個或多個蛋白質結合)被自然地尋址至這些膜囊泡中)插入產生該囊泡的細胞中。
本發(fā)明亦涉及膜囊泡，包括錨掛在膜部分的確定的抗原分子。該分子可暴露在囊泡外面，或相反地，內含在胞液中。本發(fā)明進一步涉及含具有特定結構的分子并暴露在其表面的膜囊泡，這使其特別能使用親合方法純化。本發(fā)明亦涉及膜囊泡，如上面定義的亦包括示蹤劑的膜囊泡。借助該示蹤劑，特別有可能在樣品中偵測囊泡，例如其在體內的跟蹤。
本發(fā)明亦涉及制備以上規(guī)定囊泡的方法，及這些囊泡的用途。例如，這些囊泡可作為免疫原性試劑以制備抗體。以特別有利的方式，這些囊泡被用以制備MHC限制的抗體，其特異于肽-MHC分子復合物。
本發(fā)明的第一個目的更特別為膜囊泡，其特征在于其含主要組織相容性復合體的重組分子。
膜囊泡一詞，在本發(fā)明的意義中，特別指由脂雙層組成的任何囊泡，且其中裝入了胞質部分。這些囊泡通常經從細胞射出而產生，并因此在本申請中亦稱為“胞外體”。本發(fā)明的膜囊泡(或胞外體)通常具有約60至80納米的直徑。而且，這些囊泡有利地載有膜蛋白質，其具有與在衍生出它們的細胞質膜中相同的取向。
本發(fā)明將在下面證明，以控制、特定的方式，有可能修飾胞外體的組成。更特別是，本發(fā)明顯示了有可能產生表達已(預)確定組成的重組分子復合物的膜囊泡。如將在本說明書中其后說明，從治療觀點及從診斷與實驗觀點，該囊泡具有特別有利的性質。
本發(fā)明首先從選定制備膜囊泡的特別細胞群體開始。本發(fā)明亦經以下發(fā)現(xiàn)開始，即有可能由基因途徑插入重組分子至這些細胞中，且這些重組分子其后以密集、功能性方式表達于胞外體中。
本發(fā)明的首要要素之一在于規(guī)定及鑒定用以制備膜囊泡的細胞群體。有利地是，使用的細胞為含內分泌囊泡的細胞、可經培養(yǎng)、基因修飾且其內囊泡可優(yōu)選在外界刺激作用下分泌的細胞。此主要涉及哺乳類細胞，特別是動物細胞，也涉及人源的細胞。而且，初級培養(yǎng)物可被使用或無限增殖化細胞系。
以特別有利的方式，起始細胞實質上無MHC分子，即其不表達或僅表達一些內源MHC分子。如下說明，可證實此特性在一些應用中極具有重要性。
胞外體生成的細胞的不同類型已述于文獻中，例如樹狀細胞或B淋巴細胞。但是，這些細胞通常難以轉染，并含高數(shù)目的內源MHC細胞。在此考量下，雖然其可用以實施本發(fā)明，但本發(fā)明的囊泡更優(yōu)選能從肥大細胞或肥大細胞衍生的細胞獲得。
在一個特殊實施例下，本發(fā)明的膜囊泡優(yōu)選從肥大細胞或肥大細胞衍生的細胞制備。
肥大細胞與由位于上皮(如皮膚、肺、腸或脾中)內的髓前體衍生的分化后的細胞型在一起，(Smith和Weis，今日免疫學(ImmunologyToday)17(1996)60)。這些細胞實質上特征在于，其細胞質大部分為粒子組成，這些粒子含組胺以及肝素或蛋白酶，且因此其在其表面上表達受體，該受體對E免疫球蛋白(IgE)具有強親合力。而且，根據(jù)本發(fā)明使用肥大細胞的進一步優(yōu)點在于由不同處理起始(特別是強烈刺激)胞外體的胞外分泌(即釋放)的可能性。因此，有可能由在鈣離子載體存在下的處理來調節(jié)囊泡的產生，或以更生理的方式由刺激具有IgE強親合力的受體來調節(jié)囊泡的產生。
這些細胞提供用于實施本發(fā)明的特別有興趣的性質，即內分泌囊泡的存在、其可能培養(yǎng)物及大量胞外分泌的誘導。而且，如實施例所示，這些細胞亦可以穩(wěn)定方式被基因修飾，這提供實施本發(fā)明的特別有利的性質。
更具體而言，本發(fā)明囊泡具有約60至80納米的直徑并是從肥大細胞或肥大細胞衍生的細胞產生。
在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的膜囊泡實質上無內源MHC分子。內源MHC分子(即來自囊泡生成細胞的MHC分子)的缺乏可使用特定抗體以傳統(tǒng)技術證明。其亦可由以囊泡免疫獲得的抗體的選擇性證明。如示于實施例中，在特別有利的實施例中，本發(fā)明的囊泡能在動物中誘導對其表達的規(guī)定重組分子的特定抗體的產生，而未檢出抗非基因修飾細胞的抗體?！皩嵸|上無”一詞指一些MHC分子可以極低量存在，其難以由傳統(tǒng)方法檢出，及對本發(fā)明囊泡的抗原特異性不具有明顯的影響。
本發(fā)明的特殊膜囊泡更特定地經以下性質表征-其實質上無內源MHC分子；-其載有一個或多個規(guī)定結構的重組分子，例如規(guī)定組成的重組肽-MHC復合物。
本發(fā)明的該囊泡有利地從實質上無內源MHC分子的肥大細胞衍生的細胞產生。在此情況下，已知肥大細胞蓄積Ⅱ類MHC分子在其分泌粒中，特別是，肥大細胞能以優(yōu)先方式蓄積MHC-Ⅱ-肽復合物于特定多囊泡細胞內區(qū)室，其為分泌粒子(Raposo等人，Mol.Biol.Cell 8(1997)2619)。取自哺乳類的這些細胞因此含內源MHC分子。以特別有利的方式，用于本發(fā)明的細胞是從實質上無內源MHC分子的肥大細胞衍生。不同的肥大細胞已述于文獻中。本發(fā)明將在下面論證，這些細胞系具有低含量的MHC分子，并因此特別有利于實施本發(fā)明。所舉例說明的方法，可提及從RBL(大鼠嗜堿性細胞白血病)細胞衍生的系，其ATCC登記為CRL1378(Kulczycki等人，J.Exp.Med.139(1974)6007)；KU-812系(Butterfield等人，Leukemia Res.12 198)345)，或甚至未成熟人肥大細胞系，如HMC系(Nilsson等人，Scand.J.Immunol.39(1994)489)。特殊的系實例為RBL-2H3系(Barsumian等人Eur.J.Immunol.11(1981)317)。明顯地，具有上述性質的任何其他細胞均可使用。
對于本發(fā)明，“規(guī)定組成”一詞特別表示以下的事實，即本發(fā)明的囊泡具有例如極大的抗原特異性和單體型特異性。現(xiàn)有技術所述的囊泡通常表達不同的未知單體型的MHC分子。相反地，本發(fā)明的優(yōu)選囊泡表達重組分子，其單體型以準確方式預先確定?！爸亟M”一詞指出囊泡生成細胞中，分子由編碼此分子的重組核酸的表達生成。本發(fā)明的膜囊泡因此優(yōu)選由經基因修飾以表達特定結構成份的細胞系產生。
如上所示，本發(fā)明的囊泡有利地表達規(guī)定的MHC分子。
人MHC的分子被歸類為兩個不同的類別，Ⅰ類MHC分子及Ⅱ類MHC分子。
在一個特殊實施例中，本發(fā)明的囊泡表達一種或多種Ⅱ類主要組織相容性復合體重組分子。對于這種情況，人MHC的Ⅱ類分子由兩個鏈組成，即α鏈及β鏈，β鏈將等位基因特異性授予復合物。
在特定的變異體中，本發(fā)明的囊泡更特別表達Ⅱ類主要組織相容性復合體分子的重組α鏈。在另一個特定變異體中，本發(fā)明的囊泡更特別表達Ⅱ類主要組織相容性復合體分子的重組α鏈與重組β鏈。
不同類型的人MHCⅡ分子被鑒定、表征及定序(例如見免疫遺傳學(Immunogenetics)36(1992)135)?？蓛?yōu)先提及DR1至DR13型的分子，特別是DR1、DR2、DR3、DR4、DR5、DR6及DR7。編碼人DR(特別是DR1至13)的DNA可容易地從細胞、基因庫或質粒使用傳統(tǒng)分子生物技術分離。這些序列已特別述于Bodmer等人(組織抗原(Tissue antigens)44(1994)1)。優(yōu)選本發(fā)明的胞外體因此表達Ⅱ類MHC分子，其α鏈和β鏈選自單體型DR1至DR13，更優(yōu)選選自DR1至DR7。
在特定的實例中，本發(fā)明涉及任何膜囊泡，其包含DR1單體型MHC-Ⅱ分子的重組α和/或β鏈。
在另一個實施例中，本發(fā)明的囊泡表達一種或多種主要組織相容性復合體的Ⅰ類重組分子。Ⅰ類MHC分子亦由兩條鏈組成，即跨膜與多態(tài)的α鏈及恒定且可溶的β2-微球蛋白。在人體中，3個基因座位編碼α鏈，其命名為A、B和C。傳統(tǒng)MHC-Ⅰ分子中，α鏈的各座位A、B及C發(fā)生等位基因變異。因此，等位基因被命名為A1、A2、A3等，A10、B1、B7、B37、B54等，CW3、CW6等(例如見Bodmer等人，如上引用，及免疫遺傳學(Immunogenetices)36,1992，亦引用于上)。
優(yōu)選本發(fā)明的胞外體表達跨膜與多態(tài)的傳統(tǒng)MHC-Ⅰ分子的α鏈。更優(yōu)選其為等位基因A1、A2或A3的MHC-Ⅰ分子的α鏈。
在一個特定的實施例中，本發(fā)明的胞外體表達非傳統(tǒng)MHC-Ⅰ分子(即非多態(tài)的)的α鏈。不象實質為多態(tài)的所謂“傳統(tǒng)”MHC-Ⅰ分子，在人體中存在著“非傳統(tǒng)”MHC-Ⅰ分子，其實質上為非多態(tài)的。如此分子已例如述于Bendelac等人(Ann.Rev.Immunol.(1997)535)。根據(jù)本發(fā)明非傳統(tǒng)MHC-Ⅰ的優(yōu)選實施例為分子Cd1。
明顯地，人MHC-Ⅰ的任何其他分子可在本發(fā)明的范疇內表達。
在一個特定的實例中，本發(fā)明因此涉及含MHC-Ⅰ分子重組蛋白質的任何膜囊泡。
在另一個特殊的實例中，本發(fā)明的囊泡包括一些Ⅰ類和/或Ⅱ類MHC分子。一種有利的囊泡例如包括不同單體型的兩種或更多MHC-Ⅱ分子。MHC分子的任何其他組合是明顯可能的，例如MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ。
表達一種或多種規(guī)定MHC復合物的本發(fā)明囊泡是特別有利的，因為其能在規(guī)定的MHC中呈遞給定的抗原肽。在此情況下，在本發(fā)明的更優(yōu)選實施例中，膜囊泡含由規(guī)定肽與主要組織相容性復合體的重組分子形成的復合物。
除上述MHC分子外或將其替代，本發(fā)明的囊泡亦可包括一種或多種其他異源的目的分子。對于這種情況，在一個特殊的變異體中，本發(fā)明涉及從肥大細胞或肥大細胞衍生的細胞產生的膜囊泡，其特征在于其包括一種或多種異源的目的分子。肥大細胞“衍生的”一詞指是經轉化和/或無限增殖化細胞系及/或從肥大細胞或嗜堿性細胞獲得并具有肥大細胞的性質的(內分泌囊泡的蓄積)?！爱愒础币辉~指目的分子不以此形式存在于處于其天然狀態(tài)的本發(fā)明胞外體中。
由本發(fā)明胞外體所載或內含的目的分子可為任何蛋白質、多肽、肽、核酸、脂質及任何目的物質(化學的、生物的或合成的)。這些分子可為重組的并可被插入生成細胞中，或直接插入在胞外體中/上。更特別優(yōu)選目的分子型特別為MHC分子、抗原(全部或以肽形式)、受體配體、配體的(特定)受體、核酸、藥理產物、示蹤劑或甚至是使囊泡純化的肽或蛋白質。
作為抗原，可特定提及的是任何蛋白質，特別是細胞質蛋白質或源自病毒或腫瘤的蛋白質。作為源自病毒的蛋白質的優(yōu)選實例，由EBV、CMV、HIV病毒、麻疹、肝炎等表達的任何細胞質或膜蛋白質可被引用。這些更優(yōu)選為細胞質蛋白質，即它們在傳統(tǒng)感染過程中實質不出現(xiàn)于免疫系統(tǒng)，并因此在天然狀態(tài)下較少具有免疫原性，或其還可為膜蛋白質或蛋白質片斷。作為腫瘤源蛋白質的優(yōu)選實例，可特別提及的是p53蛋白質(野生或腫瘤中存在的任何突變形式)、MAGE(特別是MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4、MAGE5與MAGE6)、MART(特別是MART1)、Gp100、ras蛋白質(野生或突變p21)等。明顯地，使用本說明書的教導，任何其他目的蛋白質可在本發(fā)明胞外體中或表面上表達。
對于這種情況，重組抗原分子可存在于囊泡的表面上(暴露)，或于囊泡的內部。事實上，以特別驚人的方式，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在其胞質中含重組抗原(特別是p53)的本發(fā)明囊泡能在動物中誘導抗此抗原的抗體的極高量產生。
在配體受體中，通?？商峒暗氖翘烊坏幕蚪浕虿倏v衍生的任何配體受體。特別是，其可為任何激素、生長因子、淋巴因子、營養(yǎng)因子、抗原受體等?？商貏e提及的是白細胞介質IL1至IL15的受體、生長激素受體、粒細胞和/或巨噬細胞(G-CSF、GM-CSF、CSF等)群落刺激因子的受體。一個特殊實例是配體受體由單鏈抗體(ScFv)組成，該單鏈抗體能與特定配體相互作用。在本發(fā)明意義中的另一個特別有利的實例是T淋巴細胞抗原受體(TcR)。本發(fā)明胞外體在其表面上表達一個或多個規(guī)定的TcR，并形成特別有利的分析及診斷工具有，這將詳見于后。
作為藥物產品，可提及的是化學本質的任何活性物質，例如使用傳統(tǒng)化學技術制備的藥物產品。具有生物活性的任何蛋白質、多肽或肽亦可被引用，例如毒素、激素、細胞因子、生長因子、酶、腫瘤抑制物等。
核酸可為編碼如上述蛋白質、多肽或藥理肽的任何DNA或RNA，及具有特殊性質(反義、抗原、啟動子、抑制子、轉錄因子的結合位點等)的任何其他核酸。其可為寡核苷酸、編碼區(qū)、人工染色體等。
載有配體受體的本發(fā)明囊泡可用于檢測在任何生物樣品中具有特別低親合力的任何配體-受體型相互作用，這將更詳盡說明于本公開的后面。而且，如此囊泡亦可用以輸送目的物質(蛋白質、肽、核酸、化學物質等)至細胞中。因此，本發(fā)明的胞外體通?？捎糜谠谠嚬苤小Ⅲw外或體內將任何分子運送與轉移至細胞。本發(fā)明因此涉及如上述包含目的異源分子的任何囊泡，其可作為該分子轉移至細胞中的載體。
在更優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的胞外體被用以定向轉移目的物質至選定的細胞群中。結果，有可能制備本發(fā)明的囊泡，該囊泡包含目的物質(毒素、激素、細胞因子、重組核酸等)并在其表面上表達配體受體或受體配體，并將所述囊泡與表達對應配體或受體的細胞接觸。因此，用此研究途徑有可能完成對準目的的有效轉移。
對于這種情況，本發(fā)明的特殊目的在于如上述的囊泡，其特征是其表達配體受體并包含目的異源分子。
本發(fā)明囊泡亦可含能使囊泡純化的肽或重組蛋白質。結果，本發(fā)明實際上描述基因修飾胞外體組成的可能性，及因此導致其表達特殊“標記”分子的可能性，這使其能夠純化。特別是，有可能獲得暴露特殊結構肽的胞外體，其可被容易地檢測并由受體分子捕捉。在一個特殊實例中，產生的胞外體在其結構中包含His6形態(tài)的肽分子(即6個連續(xù)組氨酸殘基)。如此殘基在胞外體表面上的存在使其在以鎳功能化的載體上的純化簡單。此型的其他重組肽可使用，例如c-myc標簽、VSV或HA。
最后，在另一個特殊的實例中，本發(fā)明囊泡亦含示蹤劑。示蹤劑可為不同本質(酶、熒光、放射性等)并存在于囊泡中或在其表面上。優(yōu)選標記為非放射性的，例如熒光標記。更優(yōu)選所用的示蹤劑為熒光色素或具有發(fā)色性的酶。標記可直接在生產細胞上、或在產生的胞外體上制成。
本發(fā)明亦涉及任何組合物，其包括如上述的一個或多個膜囊泡。本發(fā)明的組合物亦可包括多個如上述載有不同重組分子的膜囊泡。特別是，本發(fā)明組合物可包括如上述的膜囊泡，其載有與一種相同抗原肽結合的不同單體型的重組MHC分子。組合物亦可為包括如上述膜囊泡的組合物，該膜囊泡載有例如與不同抗原肽結合的一種相同單體型的重組MHC分子。本發(fā)明囊泡的其他組合亦是明顯可能的。
本發(fā)明組合物通常包括媒介物，如緩沖液、鹽水或生理溶液等，其使囊泡的結構可保存。其亦可包括任何穩(wěn)定化的表面活性劑等，優(yōu)選其相容于生物用途(試管中或體內)。這些組合物可保存在任何適當裝置中，如試管、瓶子、安瓿、燒瓶、小袋等，并例如保存在4℃或在-20℃下。根據(jù)本發(fā)明的典型組合物包括5至500微克的胞外體，例如5至200微克的胞外體。
本發(fā)明囊泡是從基因修飾細胞獲得的。如上述，本發(fā)明實際上從以下發(fā)現(xiàn)得到，即有可能由基因途徑插入重組分子至一些細胞中，這些分子然后以密集的功能性方式在胞外體中表達。
為產生載有限定組成的重組分子的本發(fā)明囊泡，第一階段包含將能表達選定重組分子的基因構建體插入如上述的囊泡產生細胞中。
用于生產細胞的基因構建體通?？砂ㄖ糜谒眉毎泄δ苄詥幼?表達盒)的控制下的編碼區(qū)域。
通常，所用的啟動子因此為哺乳類細胞內的功能性啟動子。其例如可為病毒、細胞或細菌啟動子。其可為組成型或經調節(jié)的啟動子，優(yōu)選其允許細胞內的高量蛋白質表達。在可使用的啟動子中，可借實例提及的是巨細胞病毒(CMV)的立刻早期啟動子、SV40的啟動子、胸苷激酶基因(特別是HSV-1 TK)的啟動子、反轉錄病毒LTR(特別是LTR-RSV)的啟動子，或甚至是肥大細胞的強內源啟動子。特別優(yōu)選的實施例包括SRα啟動子的使用，這更詳盡述于實施例中。
所用的編碼區(qū)域通常由互補性、基因組的或合成的(經修飾(例如)以包括一些內含子或以獲得密碼子的優(yōu)先使用)DNA組成。更通常地，其為cDNA。此核酸可由任何已知分子生物技術、特別是由基因庫篩選、擴增、合成、酶切割及連接獲得。
根據(jù)使用的編碼區(qū)域類型，亦可對構建體進行一些修飾。例如，在一些例中可特別有利地將信號序列插入編碼區(qū)域中，該信號序列使表達產物能尋址至細胞特殊區(qū)室，特別是朝向膜區(qū)室(內部的、漿的等)尋址。此尋址信號可位于編碼區(qū)域上游(5′)、下游(3′)或在編碼區(qū)域內。優(yōu)選尋址信號位于編碼區(qū)域的3′上；更特別是在其細胞質區(qū)域中，及在具有編碼區(qū)域的讀碼相中。使用尋址信號可特別有用地促進表達產物在給定細胞內區(qū)室中或表面上蓄積，特別是在分泌囊泡中或表面上蓄積。此實施例經特殊調適以表達一種分子，如標記肽、抗原、MHC-Ⅰ分子，甚至受體配體。另一方面，以特殊有利的方式，本說明書論證人MHC-Ⅱ的分子可直接在分泌囊泡的肥大細胞(甚至為異種的)中表達，而無需加入特殊信號。
為實施本發(fā)明，特別有可能使用作為尋址信號的核酸片斷，其具有部分以下基因的序列Lamp1、CD63、LIMPⅡ、Cdlc、FcγR。這些基因包括編碼向細胞內區(qū)室的蛋白質尋址信號的區(qū)域(Sandoval和Bakke，細胞生物趨勢(Trends in Cell Biol.)4(1994)292)?？捎糜诒景l(fā)明的尋址信號例如符合式G-Y-X-X-I，其中X代表任何氨基酸殘基。特別適于本發(fā)明的尋址信號由具有序列SHAGYQTI的LAMPI蛋白質的肽信號組成。允許朝向膜區(qū)室尋址的另一型信號包括蛋白質跨膜區(qū)域的全部或部分。
表達產物尋址至細胞區(qū)室使此產物能存在于胞外體中，亦可通過將此編碼區(qū)域融合至編碼膜蛋白或跨膜蛋白質的區(qū)域的全部或部分而進行，特別是胞外體中表達的膜蛋白或跨膜蛋白質。在本文中，本發(fā)明的特殊實施例必須伴有，通過生產細胞內重組產物的表達，以與膜或跨膜蛋白質的融合體形式插入此產物至胞外體中。該蛋白質的特殊實例為例如MHC插在生產細胞中的重組蛋白質，特別是β鏈，優(yōu)選Ⅱ類MHC的β鏈。因此，實施例中給定的結果顯示如此融合使任何目的肽在胞外體中有效蓄積，而不影響其性質或MHC分子的性質。本發(fā)明的此方面將新穎概念帶入在胞外體中重組產物的引導，并可將其施用至插在任何型胞外體中的任何重組產物。對于這種情況，本發(fā)明因此涉及任何胞外體，其包括目的多肽與尋址信號間形成的重組融合分子。其可為從肥大細胞、樹突或腫瘤細胞或亦從例如B淋巴細胞產生的胞外體。目的多肽可為抗原(或抗原片斷)或任何其他目的生物學產物。尋址信號可為具有引導融合產物朝向膜區(qū)室、特別是如上規(guī)定的細胞內區(qū)室的性質的任何肽、多肽或蛋白質。有利地，其為MHC分子的鏈。
在本發(fā)明的特殊實施例中，這些囊泡由嵌合型核酸插入生產細胞中而產生，該嵌合型核酸編碼包含結合至MHC分子β鏈C-端的重組產物的融合蛋白質，優(yōu)選Ⅱ類MHC。
在使用的構建體中，編碼區(qū)域以功能性方式結合至啟動子，如此允許其在細胞內表達。
而且，本發(fā)明的構建體可有利地包括位于編碼區(qū)域3′的區(qū)域，其指明了轉錄末端信號(例如poly A區(qū)域)。
本發(fā)明的表達盒有利地為載體、質粒、病毒、游離體、人工染色體型等的部分。對于這種情況，該載體有利地包括能選定其所內含細胞的系統(tǒng)。特別是，載體有利地包括編碼對一作用物具有抗性的產物的基因，例如抗生素(氨芐青霉素、潮霉素、遺傳霉素、新霉素、zeocine等)。在一個特殊的實施例中，各載體包括如上述的單一表達盒。在此實施例中，在一些分子(例如MHC-Ⅱ的α鏈和β鏈)要表達于囊泡中時，細胞因此經插入一些載體而得到修飾。在此實施例中，所用的各型載體有利地包括不同的選擇系統(tǒng)，其允許容易地選擇多種轉染物。
在另一個實施例中，載體可包括如上規(guī)定的一些表達盒，例如一個編碼MHC-Ⅱ的α鏈及另一個編碼β鏈。
所用的載體優(yōu)選為質粒型的，并包括例如細菌復制源，這使其易于操作及在體內產生。該載體特別是可從pBR322、pUC、pBS、pSR型等質粒構建。
為產生根據(jù)本發(fā)明的胞外體，基因修飾的細胞因此被用以表達選定的分子。這些基因修飾的細胞通過將亦如上述的基因構建體插入如上規(guī)定的選定細胞中而制備。
基因構建體的插入可以多種方式進行，這主要根據(jù)所用的細胞類型。因此，核酸的轉移可使用任何已知技術進行，如電穿孔、磷酸鈣沉淀、化學劑(陽離子肽、聚合物、脂質等)、標記試劑等。在病毒載體的情況下，轉移通常由簡單感染細胞而獲得。所用的載體量亦可由本領域的技術人員根據(jù)轉移類型及所用的細胞類型而調適。對于這種情況，插入核酸至肥大細胞的一個特殊有效方法包括載體的電穿孔。
而且，當一些構建體(載體)需要插入細胞時，后者可同時或以相繼方式轉移。
轉移后，已有效導入核酸的細胞被選定與克隆，這基于其通過被轉移的DNA中存在的抗性基因而對化合物(例如抗生素)具有的抗性。這些細胞可即席用于制備本發(fā)明的胞外體，或保存供未來使用。對于這種情況，細胞可在通常的保存媒介物中在4℃下保存一段足夠時間，以獲得若干生產批次的胞外體。細胞亦可以冷凍形式(例如在氮氣中)保存供其后作用。對于這種情況，因此有可能根據(jù)本發(fā)明去形成具有特殊性質的胞外體生產細胞庫。特別是，有可能根據(jù)本發(fā)明形成表達主要HLA型Ⅱ類MHC分子的細胞庫。然后將有可能根據(jù)預期應用及根據(jù)HLA型，從庫中選擇相對應MHC的分子生產細胞，而不需依各案的基礎重新構建這些細胞。
對于這種情況，本發(fā)明的一個特殊目的為如上規(guī)定的胞外體生產細胞，特別是肥大細胞，其特征在于其含編碼主要組織相容性復合體分子的重組核酸。本發(fā)明亦涉及如上規(guī)定的任何胞外體生產細胞，特別是肥大細胞，其特征在于其含編碼li不變鏈的重組核酸，特別是一個經修飾以包括替代CLIP區(qū)域的抗原肽，或編碼使胞外體能純化的肽的重組核酸。
更特別是，其為哺乳類細胞，特別是動物源的細胞，尤其是嚙齒類動物源的細胞。其亦可為人源的細胞。在一個特殊的實施例中，其為從肥大細胞衍生的細胞系，特別是從例如嗜堿性細胞白血病的肥大細胞系衍生。借助特殊的實例，可提及RBL系，特別是RBL-2H3、KU-812系的細胞或HMC-1。
優(yōu)選重組核酸編碼Ⅱ類主要組織相容性復合體分子的α鏈和/或β鏈，和/或Ⅰ類主要組織相容性復合體分子。在另一個實施例中，細胞包括分別編碼Ⅱ類主要組織相容性復合體分子的α鏈與β鏈的一些核酸。
借助本發(fā)明，有可能以簡單可再現(xiàn)的方式，產生基本量的已知組成的胞外體。為產生胞外體，上述的基因修飾細胞在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并收集胞外體。
本發(fā)明的特殊目的因此在于一種制備含規(guī)定重組分子的胞外體的方法，其必須有以下的階段
a)培養(yǎng)肥大細胞或肥大細胞衍生的細胞，這些細胞含編碼該規(guī)定重組分子的重組核酸，c)回收由該細胞產生的胞外體，這些胞外體含該規(guī)定的重組分子。
有利地，本發(fā)明方法亦包括中間階段b)，在此期間，細胞被刺激以誘導和/或增加胞外體的分泌。
而且，借助本發(fā)明方法，有可能制備囊泡，其中規(guī)定的重組分子暴露在胞外體外面，或全部或部分包括在胞外體的胞質部分中。
如上所示，在本發(fā)明方法中，重組分子可例如為主要組織相容性復合體的分子、抗原分子、受體配體、配體受體或純化肽，或任何其他目的多肽。而且，如上說明，在一些實施例中，方法中所用的核酸除包括編碼朝向膜區(qū)室的尋址信號的區(qū)域，還特別包含肥大細胞的內分泌囊泡。
本發(fā)明的進一步特殊目的在于一種制備膜囊泡的方法，其包含-培養(yǎng)胞外體生產細胞，其含編碼重組MHC分子(特別是Ⅰ類或Ⅱ類，尤其是人的)的重組核酸，及-視情況在刺激胞外分泌后，收集產生的胞外體。
對于這種情況，本發(fā)明亦涉及一種制備含規(guī)定組成的肽-MHC復合物的胞外體的方法，其特征在于其包括-培養(yǎng)胞外體生產細胞，該細胞含編碼規(guī)定重組MHC分子的一個或多個重組核酸，-細胞刺激以誘導釋放胞外體，-收集由該細胞產生的胞外體，該胞外體在其表面上表達該規(guī)定的重組MHC分子，及-將胞外體與肽(類)接觸。
為實施本發(fā)明，所用的肽(類)可為合成肽、肽混合物、細胞萃取物，例如從腫瘤細胞萃取的肽混合物。肽(類)可為分離形式、或純化的、或如上示的混合物。而且，在胞外體與肽類接觸后，胞外體可使用傳統(tǒng)方法分離或純化。
在另一個實施例中，本發(fā)明涉及一種制備含規(guī)定組成肽-MHC復合物的胞外體的方法，其特征在于其包括-培養(yǎng)胞外體生產細胞，該細胞含編碼規(guī)定的重組MHC分子的一個或多個重組核酸及包括編碼規(guī)定的重組肽區(qū)域的核酸，-刺激細胞以誘導釋放胞外體，-收集由該細胞產生的胞外體，這些胞外體在其表面上表達該規(guī)定的與該重組肽結合的重組MHC分子。
更特殊地，在本方法中，含有編碼重組肽的區(qū)域的核酸編碼不變li鏈的衍生物，其中CLIP區(qū)域已被刪除并由該肽取代。此實施例確保在形成肽-MHC復合物中的重要特異性。
在另一個實施例中，核酸包括編碼肽的區(qū)域及朝向細胞內區(qū)室的尋址區(qū)域。而且，核酸可含編碼相同或不同抗原肽的一些區(qū)域。
優(yōu)選用于本方法的生產細胞為肥大細胞或肥大細胞衍生的細胞。在此實施例中，刺激細胞以誘導釋放胞外體，這優(yōu)選借助一個或多個鈣離子載體，或IgE。
在特別優(yōu)選的實施例中，用于本發(fā)明的生產細胞實質上無內源MHC分子。
本發(fā)明的進一步目的包括一種修飾胞外體組成的方法，包括-將編碼規(guī)定分子的核酸插入胞外體生產細胞中，該分子結合至膜區(qū)室的尋址信號上，及-從該細胞產生胞外體。
借助本方法，有利地，有可能產生表達規(guī)定且可變的重組分子的胞外體。
本發(fā)明的胞外體可用于多種應用，例如作為分析、診斷、治療或實驗工具有。例如其可用于分析特異的T抗原反應；用于研究低親合力的受體/配體相互作用，其中需要不同配偶體的多聚體化，以期增加這些分子復合物的親合力，因而超越了免疫學的應用范疇；用于診斷與治療及用于產生特殊抗體，特別是MHC限制的抗體。這些不同應用及其他被說明于下。
a)用于制備抗體。
本發(fā)明胞外體的首要應用之一在于制備抗體。給定本發(fā)明胞外體的規(guī)定組成，有可能制備具有確定特異性的抗體。而且，如示于實施例中，本發(fā)明胞外體具有極強的免疫原性，特別是考量到在其表面上高密度的MHC-肽復合物、其功能性及其對免疫系統(tǒng)的有效存在。
以此方式產生的抗體可是多克隆或單克隆的。其可使用傳統(tǒng)免疫學技術制備，包括動物免疫、血清收集(多克隆抗體)和/或脾淋巴細胞與不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞融合(以生成產生單克隆的雜種瘤)。
本發(fā)明的進一步目的因此涉及由以如上述的胞外體免疫產生的抗體或抗體片斷?？贵w片斷可例如為Fab、(Fab’)2、ScFv片斷等，及更通常為維持抗體特異性的任何片斷。特別是，本發(fā)明涉及一種制備抗體的方法，包括動物以如上述載有規(guī)定的肽-MHC復合物的胞外體免疫，及回收抗體和/或回收產生抗體的或參與免疫應答的細胞。有利地，借助本發(fā)明方法，有可能制備單克隆抗體，特別是MHC限制的單抗，即特異于MHC-肽結合的單抗。優(yōu)選在本發(fā)明方法中使用實質上無內源MHC分子的胞外體，其表達重組MHC-肽復合物并且從細胞產生，該細胞是免疫動物所固有的。因此，如示于實施例中，借助本方法，有可能在不需添加物下獲得抗肽的有力抗體，特別是受MHC限制的抗體，即特異于以構象與規(guī)定MHC分子結合的肽。如此抗體在實驗、診斷及治療水平上特別有利。而且，本發(fā)明抗體可由任何已知技術(酶、熒光、放射性等)使用本領域技術人員已知的方法標記。
b)診斷應用本發(fā)明的胞外體與抗體具有診斷用途的有利性質。
例如，根據(jù)本發(fā)明獲得的抗體或抗體片斷可用于任何診斷應用，以檢測生物樣品中相對應特異抗原的存在，其中使用不同傳統(tǒng)技術，如流式細胞計數(shù)法、免疫組織化學或免疫熒光法。在受MHC限制的抗體的特殊例中，其有利地允許檢測相對應MHC-肽復合物，并因此診斷相對應的病狀。這些抗體可特別應用至病狀的診斷，該病狀涉及免疫系統(tǒng)的反應缺陷或不適當反應，以期確定先前規(guī)定的可被T淋巴細胞識別的形式的抗原的表達。例如，以非徹底的方式，以下診斷可予考慮-腫瘤病狀，其中對由結合Ⅰ類MHC分子的蛋白質(如p53、Her2、MAGE、BAGE、MART、GP100)衍生的不同肽的腫瘤樣品進行的檢測能使腫瘤顯型化及促進治療選擇性；-在感染前或潛伏階段的病毒疾病，其中病毒粒子不可檢出(肝炎、HIV、CMV或其他病毒感染)；-自身免疫疾病，如多發(fā)性硬化、自身免疫糖尿病、自身免疫甲狀腺機能障礙、類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡，其中檢測顯示自體抗原衍生的肽的MHC分子可指示疾病進一步發(fā)展。
本發(fā)明的胞外體亦可用以檢測生物樣品中蛋白質分子的特異性配偶體。因此，本發(fā)明載有MHC-肽復合物的胞外體可用以檢測生物樣品中對這些復合物特異的T淋巴細胞，例如生物樣品處于不同的病理狀態(tài)，特別是處于上述的病狀中。對于這種情況，胞外體可由本領域技術人員所知的任何標記系統(tǒng)(酶、熒光、放射性等)標記，以允許其在生物樣品中檢出。
在一個特殊的實施例中，本發(fā)明因此涉及使用標記的胞外體，特別是如上述的熒光標記的胞外體，以檢測生物樣品中特異于抗原肽-MHC復合物的T淋巴細胞。生物樣品可為血液、血清、組織、腫瘤、活體組織切片、皮膚、尿液等的任何樣品。而且，生物樣品可經預處理，例如解離細胞、在培養(yǎng)物中擴增細胞、制備膜部分等。有利地，生物樣品是衍生自人類生物。為此目的，本發(fā)明亦涉及一種在生物樣品中檢測對抗原-MHC復合物特異的T淋巴細胞存在的方法，包括將該樣品與含該抗原-MHC復合物的如上述標記的胞外體接觸，及在該樣品中檢測T淋巴細胞的標記。
再者，檢測這些T淋巴細胞不僅能檢測及因此診斷生理病理狀態(tài)，而且亦能跟蹤例如免疫程序的效力及在不同疾病階段下免疫應答的狀態(tài)，并因此評估給予治療的效力。
在一個特殊的應用中，載有TcR受體的本發(fā)明胞外體被用于檢測生物樣品中此受體的特異肽-MHC復合物。
而且，載有規(guī)定組成的任何型蛋白質的本發(fā)明熒光胞外體亦形成能檢測潛在受體的熒光探針。由胞外體打開的新穎領域因此通常可延伸至在體內檢測低親合力的任何蛋白質/蛋白質相互作用。本發(fā)明的進一步目的因此為胞外體的用途，優(yōu)選標記的胞外體，特別是經如上述的熒光標記的胞外體，-用以檢測生物樣品中蛋白質分子的特異受體。在此實施例中，所用的胞外體因此在其表面上包含該規(guī)定結構的生物分子，-用以檢測生物樣品中配體的存在。在此實施例中，所用的胞外體因此在其表面上含該配體的特定受體。
c)治療應用受限制的抗體或其片斷能潛在地抑制T淋巴細胞的受體與其特異的MHC-肽復合物間的相互作用。同樣地，在其表面上載有單一類型的MHC-肽復合物的胞外體可經與特異于這些復合物的T淋巴細胞相互作用，而與其天然配體一T淋巴細胞競爭，并導致其失活。
受限制的抗體及胞外體因此可用于任何情況，其中其需要降低或抑制由T淋巴細胞介導的證實對生物有害的免疫應答，如以下的例子，例如-器官移植或骨髓移植，其中通常借助強劑量的免疫抑制劑以中和宿主對移植的反應；-自身免疫疾病或病毒性病狀，在此期間TCD8或CD4免疫應答慢慢地導致組織破壞；-過敏與哮喘。
在這些類型的病狀中，本發(fā)明胞外體在其表面上表達規(guī)定肽-MHC復合物，其被已知涉及病理狀態(tài)的發(fā)展，因此該胞外體可被用以阻斷免疫應答的發(fā)展，并因此阻斷病理反應的發(fā)展。
載有MHC-肽復合物的本發(fā)明胞外體亦可用以體外擴增(擴展)細胞毒性T淋巴細胞的群體。它被直接從血液樣品使用，因此可形成對抗不同細胞靶的細胞治療的基礎。因此，胞外體可用以挑選出可變組合的T細胞，這些T細胞特異于由作為治療目的的細胞(如腫瘤細胞或病毒感染的細胞)所表達的復合物。本發(fā)明進一步目的因此是使用如上述的胞外體以克隆擴增和/或刺激細胞毒性和/或輔助T淋巴細胞。本發(fā)明亦涉及一種體外克隆擴增(或擴展)T淋巴細胞的方法，特別是細胞毒性淋巴細胞，該方法必須伴隨含有與含規(guī)定的肽-MHC復合物的如上述胞外體接觸的T淋巴細胞的生物樣品、特異的T淋巴細胞的收集及其擴增。此方法特別有利于克隆擴增特異于MHC分子與腫瘤或病毒抗原肽間形成的復合物的細胞毒性T淋巴細胞。
本發(fā)明囊泡特別目的進一步應用為朝向細胞轉移分子。利用其組成，本發(fā)明囊泡能在試管中、體外及體內在分子朝向細胞的轉移中扮演載體的角色。對于這種情況，本發(fā)明涉及使用如上述含目的物質的胞外體以制備意在將該物質轉移至細胞的組合物。有利地，其為在其表面上含配體受體或受體配體的胞外體，這使之有可能定向朝向一個或多個選定的細胞群體的轉移。本發(fā)明亦涉及一種試管中、體外或體內轉移物質至細胞的方法，其必須伴有該細胞與含該物質的本發(fā)明囊泡的接觸。更優(yōu)選所用的囊泡亦表達配體受體及本發(fā)明方法能朝向表達相對應配體的細胞定向轉移物質。為了在體內實施，本發(fā)明囊泡由傳統(tǒng)途徑(靜脈注射、動脈注射、肌肉注射、皮下注射等)施用(優(yōu)選至哺乳類，特別是人)。為了在試管中或體外使用，細胞通過在適當?shù)脑O備(盤、燒瓶、袋、安瓿等)中、優(yōu)選在無菌條件下培養(yǎng)而發(fā)生接觸。發(fā)生接觸階段的參數(shù)(囊泡量、接觸時間、溫度、培養(yǎng)基等)可容易地由本領域技術人員根據(jù)設定的目的及本說明書的教導而調整。
d)研究領域的應用這些明顯涉及所有上述的應用，它們經使用能檢測及分析不同的正?；虿±頎顟B(tài)中MHC-肽復合物形成階段的抗體，以分析在抗體出現(xiàn)中的分子機制。
經使用熒光胞外體及其檢測的能力，它們亦有關于分析與分子表征能識別確定的MHC-肽復合物的T淋巴細胞群體。
在這些不同應用(診斷、治療、實驗、產生T淋巴細胞等)中，本發(fā)明胞外體可以如此被實施，或以在載體介質上固定化的形式實施。因此，實施例中給定的結果顯示有可能將胞外體固定在載體介質上，而不降低其功能特性，特別是例如其抗原特異性。對于這種情況，本發(fā)明的一個特殊目的在于含固定在載體介質上的胞外體的組合物。載體介質優(yōu)選為固體或半固體載體如小珠、濾紙或相似物。其優(yōu)選為在塑膠材料中的聚合物型載體，例如膠乳珠或磁性珠。明顯地，任何其他合成的或生物的材料可被使用，只要其不導致胞外體或細胞品質的任何實質性惡化。有利地，使用具有1至10微米直徑的珠體，例如2至5微米。胞外體在載體介質的固定有利地由共價鍵獲得，例如通過醛或其他任何化學結合試劑的活化。通常，胞外體的固定化由胞外體與載體在溶液中在允許固定的條件下培養(yǎng)而形成，然后載體經離心收集。以此方式獲得的功能化載體可用以表征胞外體或檢測或擴增試管中的T淋巴細胞，這將詳述于實驗一節(jié)中。
本發(fā)明的其他方面及優(yōu)點將在閱讀以下實施例時見到，實施例被認為是說明性的及非限制性的。而且，在本發(fā)明書中所引的所有文獻作為參考被引入。
附圖中的主要內容

圖1RBL 2H3系中功能性MHC-DR1-HA肽復合物的產生。
A．在轉染編碼RBL 2H3系中DR1的α與β鏈的cDNA之前(左)及之后(右)，人MHC-ⅡDR1分子表面表達的流式細胞儀分析。DR1分子用L243抗體(黑線)檢測，該抗體自身由與FITC偶聯(lián)的山羊血清抗小鼠-IgG顯像。
B．在表達不變鏈的系(liHA)中DR1的表面表達，其中CLIP肽已被從流感病毒紅血球凝集素衍生的308-319肽所代替。在RBL DR1liHA系和由相同單體型EBV(Hom2)轉化的B淋巴細胞上用L243抗體(黑線)檢測DR1分子。
C．特異于DR1-HA復合物的T淋巴細胞被表達此復合物的RBL系或相同單體型的B-EBV刺激。RBL DrlliHA系與B-EBV Hom2系在培養(yǎng)皿中用對DR1HA復合物特異的T淋巴細胞稀釋。B-EBVHom2系亦在飽和濃度(10毫摩爾每升)的HA肽的存在下培養(yǎng)。在培養(yǎng)上清液中IL2的產生被用以評估THA淋巴細胞(特異于HA肽的T淋巴細胞)的刺激。IL2借助氚化胸苷導入試驗在CTIL2系中測定，該CTIL2系的增殖為IL2依賴性的。
D．RBL DR1 liHA系的HA肽飽和分析。細胞Hom2與RBL DR1liHA在遞增濃度的HA肽與THA淋巴細胞的存在下培養(yǎng)(每盤100個細胞)。淋巴細胞的刺激如前評估。
圖2DR1分子在RBL 2H3的分泌區(qū)室中的蓄積。
A．在RBL 2H3中DR1分子的細胞內蓄積位點分析。細胞RBLDRLHA以0.5％戊二醛固定，然后以0.05％皂角苷滲透。DR1分子與不變鏈分別以抗體L243與PIN1及隨后的與FITC偶聯(lián)的驢血清抗小鼠-IgG檢測。特異性兔血清檢測5-羥色胺，使用以與德克薩斯紅偶聯(lián)的驢血清抗兔-IgG進行顯像。影像由共焦顯微鏡(Leica)獲得。切片厚度為0.5微米。
B．RBL DrlliHA的胞外體的純化。在DMEM中清洗后，細胞在1毫摩爾每升離子霉素存在下在37℃下培養(yǎng)30分鐘。胞外體由差速超速離心從細胞上清液中純化。被放回PBS懸浮液中的胞外體殘留物由SDS-PAGE分離(5毫克)，然后轉至尼龍膜上。DR1的β鏈以單克隆抗體IB5檢測，以用于胞外體的制備及在相同條件下遷移的RBLDRLHA與Hom2細胞的溶胞產物(相當于每盤105個細胞)中的對照組。
圖3使用胞外體產生抗DR1 HA的抗體。
A．以胞外體免疫的小鼠血清的遞增稀釋液與表達(右)或不表達(左)DR1HA分子的RBL細胞一起培養(yǎng)。獲得的標記用流式細胞儀分析。
B．以胞外體免疫的大鼠的血清(稀釋至1/100)與表達或不表達(左)DR1 HA分子的RBL細胞一起培養(yǎng)。在右邊，表達DR1的細胞經或未經預先在37℃下與10毫摩爾每升HA肽培養(yǎng)2小時，隨后再與相同免疫大鼠的血清稀釋液培養(yǎng)。
C．免疫大鼠的脾與X63A8系在傳統(tǒng)制備單克隆抗體的條件下融合。不同雜交瘤的上清液用免疫熒光法在表達或不表達DR1或DR1HA分子的RBL 2H3細胞上測試。a40、b82及a15克隆為獲得抗體的代表性實例。
圖4使用胞外體檢測特異于DR1 HA復合物的T淋巴細胞。
A．細胞RBL DR1 liHA在5毫摩爾每升“綠示蹤劑”(蓄積在細胞溶酶體區(qū)室中的熒光脂質)的存在下在37℃下培養(yǎng)30分鐘，然后洗滌并在37℃下在無熒光示蹤劑下再培養(yǎng)1小時。將細胞固定(3％多聚甲醛)，然后在共焦顯微鏡下分析。
B．同樣地，胞外體DR1 HA從A中所述的細胞中純化。樣品中存在的熒光以熒光計定量并在共焦顯微鏡下直接顯像。
C.D．熒光胞外體DR1 HA在50毫克/毫升下與特異于DR1 HA復合物的THA淋巴細胞或與特異于另一種復合物(D)的TH30淋巴細胞在37℃下在疊氮化物存在下培養(yǎng)2小時以阻斷內在化。細胞的熒光由流式細胞儀評估。
圖5載有Ⅱ類MHC分子的胞外體的制備。
A．Ⅱ類分子IAb的表達由單克隆抗體Y3P檢測并由流式細胞儀分析。細胞RBL 2H3中獲得的轉染物表達與B414對照組B淋巴瘤相似的由Y3P識別的Ⅱ類分子水平。
B．分子IAb在RBL中的表達的Westem印跡分析。10毫克細胞的溶胞產物及從細胞RBL IAbIi衍生的胞外體制備物由Western印跡法用特異于分子IAα鏈胞質區(qū)域的兔血清分析。
C．胞外體組成的流式細胞儀分析。膠乳床以胎牛血清(FCS)、或以從細胞RBL 2H3衍生的胞外體(胞外體RBL)或以此細胞使用鼠Ⅱ類分子IAbIi(胞外體DR1 IAbIi)或人DR1 IiHA(胞外體DR1IiHA)的轉染物包被。大鼠的分子CD63以抗體AD1檢測，分子IAb以抗體Y3P檢測，而分子DR1由抗體L243檢測。這些不同抗體由與藻紅蛋白偶聯(lián)的二抗顯像。
圖6由RBL-2H3產生的胞外體的形態(tài)表征。
A．以HLA-DR1轉染的細胞RBL-2H3以多聚甲醛固定。超細冷凍切片被制備并以抗分子HLA-DR的多克隆抗體免疫標記。這些抗體以與10納米膠體金粒子偶聯(lián)的蛋白質A顯像。Ⅱ類分子主要在以具有囊泡外形的膜填充的區(qū)室中檢測。柱形250納米。
B.C．由RBL-2H3細胞分泌的胞外體的形態(tài)表征。胞外體以2％多聚甲醛在pH7.4的0.2摩爾每升磷酸鹽緩沖液(PB緩沖液)中固定并放置在以碳酸鹽化的聚醋酸甲基乙烯酯膜覆蓋的電子顯微鏡玻片上。胞外體被對比并于4％乙酸雙氧鈾和甲基纖維素的溶液中包被，或(b)在包被(c)前以抗Ⅱ類分子的抗體免疫標記。如圖(a)所示，抗體以與10納米膠體金粒子偶聯(lián)的蛋白質A顯像。柱形250納米。
圖7胞外體內部組成的操縱，重組蛋白質的插入。
A．Ⅱ類DR1分子的表達由單克隆抗體L243檢測并由流式細胞儀分析。在細胞RBL 2H3中，分子的轉染誘導與B414對照組B-淋巴瘤中的相似的由Y3P識別的Ⅱ類分子表達水平。
B．RBL中分子DR1 GFP表達的Western印跡法分析。10微克細胞的溶胞產物及20微克從細胞RBL DRI GFP衍生的胞外體制備物以GFP-特異的單克隆抗體偶聯(lián)物進行Western印跡分析。
C．胞外體組成的流式細胞儀分析。膠乳珠以胎牛血清(FCS)或以從細胞RBL DRI GFP衍生的胞外體包被。DR1分子由L243抗體及由L243抗體和與藻紅蛋白偶聯(lián)的二抗檢測，而GFP的存在直接在FL1通道中檢測。
圖8A．熒光胞外體與特異T細胞結合。從以綠細胞示蹤劑標記的RBLDR1 liHA細胞產生的胞外體在兩種類型T細胞存在下培養(yǎng)具有對HLA-DR1/HA復合物特異的TCR的THA，及不含此受體的野生T-Jurkat。熒光胞外體在37℃下與兩個T淋巴細胞系培養(yǎng)3小時，生成的標記然后經FACS分析。
B．獲取具有特異標記的T細胞的胞外體示蹤劑。如A進行相同標記，但胞外體(未以綠細胞示蹤劑標記)與T細胞的結合以小鼠單克隆抗體AD1抗大鼠CD63檢測，其后以標記著藻紅蛋白的驢抗體抗小鼠IgG顯像(Jackson Immuno Research,West Grove,PA)。在未暴露于胞外體的T細胞上平行進行相同標記。
C．胞外體對淋巴細胞的刺激。從DR1 GFP細胞純化的胞外體在以與用于流式細胞儀相同的方式制備的膠乳珠上交聯(lián)，但在完全培養(yǎng)基中清洗。各珠殘留物在100微升中收集，50微升被置于96孔多孔板的第1孔中，50微升以2倍增量進行稀釋。T細胞(T-Jurkat和THA1.7)被調至106個細胞/毫升且50微升被置在有或無5微摩爾每升HA307-319肽的各孔中，培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱(37℃,5％CO2,H2O)中20小時，然后收集上清液，IL2的濃度以CTL.L2試驗評估。
圖9HMC-Ⅰ細胞與胞外體的表征。
A．用流式細胞儀分析HMC-Ⅰ細胞，粗實線細胞本身；細實線抗小鼠抗體-FITC本身；密點線特異抗體+抗小鼠-FITC。
B．粘連至膠乳珠的HMC-Ⅰ胞外體的流式細胞儀分析，粗實線膠乳珠-HMC-Ⅰ胞外體本身；細實線抗小鼠抗體-FITC本身；密點線參照膠乳珠-SVF+特異抗體+抗小鼠-FITC；疏點線胞外體-膠乳珠+特異抗體+抗小鼠-FITC。
C．MHC-Ⅰ細胞的溶胞產物的Western印跡分析，與其胞外體比較；每孔10或3微克蛋白質；HC10:1/10上清液；1B5:1/10上清液；CD63:5微克/升，Lamp1:2微克/毫升；H68.4:1/10上清液。胞外體富集于CD63、Lamp1、TfR。Ⅱ類MHC不存在于溶胞產物和胞外體中，這證實細胞熒光分析的結果。Ⅰ類MHC的比例在細胞的溶胞產物及在胞外體中皆相同。
材料與方法細胞在實驗部分中用以制備胞外體的細胞為鼠或人肥大細胞。更特殊地是，使用粘液肥大細胞表型的嗜堿腫瘤細胞系，其命名為RBL-2H3(Barsumian等人，Eur.J.Immunol.(11(1981)317)，和未成熟的人肥大細胞(MHC-1)系。可使用其他肥大細胞，特別是其他系，如從RBL細胞衍生的系(大鼠嗜堿性細胞白血病)，其ATCC歸檔在編號CRL1378下(Kulczycki等人，J.Exp.Med.139(1974)600)。
能在人MHC-Ⅱ范圍(DR1)中識別特殊抗原的T淋巴細胞系亦可使用。特別是，Jurkat系以編碼T(“T-HA”)細胞受體的cDNA轉染，該受體特異于與HLA-DR1結合的流感病毒血球凝集素的肽306-318(Sidhu等人，J.Exp.Med.176(1992)875)。由非洲淋巴細胞瘤病毒(Hom-2系)轉化的人B細胞系被作為對HLA-DR1限制性反應的對照。
細胞被培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)、RPMI或“CLICK”:RPMI培養(yǎng)基補充有10％胎牛血清(Sigma)、1毫克/毫升青霉素-鏈霉素、1毫克/毫升谷氨酰胺、5毫摩爾每升丙酮酸鈉及50毫摩爾每升β-疏基乙醇。適合培養(yǎng)真核細胞、特別是哺乳類的任何其他培養(yǎng)基明顯可使用。
細胞主要培養(yǎng)于25或15毫升培養(yǎng)瓶。因為RBL-2H3細胞為粘附細胞，所以其被從其載體上使用胰蛋白酶-EDTA(Seromed)提起。為了大量產生后者，亦有可能在“旋轉器”中將其培養(yǎng)至106個細胞/毫升的密度。質粒為基因修飾肥大細胞，制備以下的基因構建體。
編碼人HLA-DR1α鏈(Larhammer等人，細胞(Cell)30(1982)153)、人HLA-DR1β鏈(Bell等人，PNAS 82(1985)3405)及人不變鏈p33li(Ciaesson等人，PNAS 80(1983)7395)的cDNA被分離。編碼不變鏈p33li的cDNA然后由PCR修飾，以用限制位點置換編碼CLIP肽(殘基87-102)的區(qū)域。借助此cDNA，有可能替代CLIP肽插入編碼抗原肽的任何目的cDNA片斷(Stumptner等人，EMBO J.16(1997)5807)。在一個明確實例中，編碼流感病毒血球凝集素的HA308-319肽的DNA片斷被插入此編碼嵌合型li多肽(HA308-319)的cDNA。
上述的核酸然后在SRα啟動子的控制下，被分別克隆入pSRα質粒(Takebe等人，Mol.Cell.Bio.8(1988)466)。各質粒然后被修飾，以并入不同抗性基因，其允許選擇出各質粒，并因此選擇出各鏈；鏈α具有對新霉素的抗性基因；鏈β具有對潮霉素的抗性基因，不變鏈具有對zeocine的抗性基因。轉染為插入不同核酸至肥大細胞中，相對應的質粒載體被Scal限制酶線性化。50微克各質粒經線性化，然后乙醇沉淀，殘留物在1×107個細胞/毫升的濃度下在RBL-2H3細胞存在下再次懸浮。穩(wěn)定的轉化細胞由電穿孔5×106個細胞而獲得，其中使用“基因脈沖器”(Bio-Rad,Richmond,CA)，在以下條件下260伏特，960微法拉弟。電穿孔72小時，轉染細胞通過于選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)選定，該培養(yǎng)基包括250微克/毫升G418(Génétine,Gibeo)、1毫克/毫升潮霉素及500微克/毫升zeocine。在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天后，60％至90％現(xiàn)存的細胞被轉染。轉染細胞然后接種于具有能開始個體化粘附群落的濃度的選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。以此方式獲得的克隆經收集并分別置于培養(yǎng)物中。這些克隆可以冷凍形式保存，供未來使用?？贵wY3P(MHC-Ⅰ(IA))為小鼠單克隆抗體，其識別IAb aβ復合物(Janeway等人，1984)?？?IAα為抗IAα鏈細胞質部分的兔血清。抗-GFP為抗“綠熒光蛋白質”的兩種單克隆抗體(克隆7.1和13.1)的混合物，其由Boehringer Mannheim銷售。在流式細胞儀實驗中，使用的二抗為F(ab’)2片斷，其偶聯(lián)至藻紅蛋白，由驢產生并抗小鼠IgG(H+L)(杰克森免疫研究實驗室(Jackson ImmunoresearchLaboratories))。珠膠乳珠無表面活性劑的白色的醛/硫酸膠乳，D:3.9微米(InterfacialDynanics Corp.,Partland,Or.USA)。電子顯微鏡以HLA-DR1轉染的RBL-2H3細胞以pH7.4的0.2摩爾每升磷酸鹽緩沖液(PB緩沖液)中2％的多聚甲醛固定。固定后，細胞以PB緩沖液-50毫摩爾每升甘氨酸洗滌，然后在10％明膠中包被。固化塊被制備后，灌入2.3摩爾每升蔗糖并在液氮中冷凍。超細冷凍切片被制備并以抗HLA-DR分子的多克隆抗體免疫標記。這些抗體以與10納米膠體金粒子偶聯(lián)的A蛋白質顯像。
胞外體以pH7.4的0.2摩爾每升磷酸鹽緩沖液(PB緩沖液)中2％多聚甲醛固定，并放置在以碳酸鹽化的聚醋酸甲基乙烯酯膜覆蓋的電子顯微鏡玻片上。
胞外體被對比并在乙酸雙氧鈾和甲基纖維素的4％液體中包被，或在包被前以抗Ⅱ類分子的抗體免疫標記?？贵w以與10納米膠體金粒子偶聯(lián)的A蛋白質顯像。結果1-DR1HA胞外體的制備1.1基因修飾生產細胞的構建及表征為以受控制的方式制備載有規(guī)定組成的MHC-肽復合物的胞外體，Ⅱ類MHC分子的鏈α和β、DR1在RBL 2H3 lo肥大細胞系中表達，此細胞系衍生自大鼠嗜堿性細胞白血病。為此目的，分別載有編碼各鏈的核酸的兩種載體在SRa啟動子控制下同時轉染至細胞中(見材料與方法)。由流式細胞儀獲得的結果顯示，轉染的細胞有效地表達DR1分子(圖1A)。
這些RBL-2H3細胞然后被制成敏感于明確組成的給定肽，以期生成規(guī)定組成的MHC-肽復合物。為此目的，不同技術可予考慮。在簡單的實施例中，肽可直接與胞外體培養(yǎng)。在另一個方法中，編碼肽的核酸可插入細胞中，以便亦表達此肽。在實施此特殊實例中，為產生含單一抗原特異性的呈遞細胞，選定的抗原肽以與不變的人li鏈基因融合的形式插入細胞中。更特別是，不變鏈的CLIP肽被選定肽的序列置換，其從已知與DR1分子結合的流感病毒血球凝集素(HA308-309)衍生。此構建體(liHA)在細胞中在述于材料與方法的條件下轉染。表達于RBL-2H3 DR+細胞的雜交鏈能構建細胞，其在相似于對照DR1單體型的B-EBV(Hom2)系的量下表達由L243抗體識別的DR1分子(圖1B)。這些結果最終顯示本發(fā)明的肥大細胞有效地表達具預定的受限制組成的人功能性肽-MHC復合物。
由本發(fā)明細胞表達的肽-MHC復合物的功能特質由特異于被細胞運載的DR1-HA聯(lián)合體的T淋巴細胞的刺激試驗確認。為此目的，本發(fā)明的細胞在THA淋巴細胞存在下培養(yǎng)，且通過測定釋放至上清液的白細胞介質-2、由IL-2依賴的細胞系的生長試驗來確定刺激。使用的對照組為以DR1單體型的EBV(Hom2)轉化的B淋巴細胞系，其以飽和濃度(10毫摩爾每升)的HA肽脈沖。
得到的結果被給定于圖1C及1D。其顯示本發(fā)明的肥大細胞表達能刺激特異于此聯(lián)合體的T淋巴細胞的DR1-HA復合物。其亦顯示在本發(fā)明細胞存在下所得的刺激較由飽和濃度(10毫摩爾每升)HA肽脈沖的對照組細胞(DR1單體型的B-EBV)產生的刺激更有效。最后，得到的結果顯示DR1分子似乎僅呈遞HA肽，因為加入飽和濃度的肽不顯著增加RBL DR1 liHA細胞刺激THA淋巴細胞的能力(圖1D)。
所有這些結果因此論證產生的肽-MHC復合物的功能特質。其亦說明得到細胞的特異性特質及因此說明本發(fā)明方法的特異性特質，其使載有規(guī)定、受控制的組成的分子的細胞(及胞外體)能夠獲得。1.2功能化胞外體的制備免疫熒光試驗顯示重組MHC-肽復合物(DR1 HA)蓄積在RBL-2H3細胞系的分泌粒中。圖2A給予DR1分子與5-羥色胺在囊泡細胞內結構中共同定位的證據(jù)。
功能胞外體可由這些細胞釋放的可能性因此被檢測。為此目的，細胞在鈣離子載體存在下培養(yǎng)，隨后產生膜囊泡。更特別是，細胞在300g下在室溫下離心5分鐘。在各細胞殘留物上，加入鈣離子載體的溶液(1毫摩爾每升離子霉素)(約300微升)，在37℃下培養(yǎng)繼續(xù)30分鐘。胞外分泌作用由快速在冰中冷卻及加入300微升冷的1毫摩爾每升PBS-EGTA溶液而停止。細胞然后在300g下在4℃離心5分鐘。上清液被回收，并再次離心先在1200g下離心5分鐘，然后在10000g下離心5分鐘，最后在70000g下離心1小時。在此差速離心后，殘留物(包括胞外體)被收集及在緩沖溶液(30微升Laemml -DDT緩沖液(1X或2X)中溶解。殘留物的一部分亦溶于解離緩沖液中，以測定蛋白質濃度。胞外體溶液可由凝膠遷移(12％聚丙烯酰胺微凝膠)在20毫安培下被分離，然后轉移至Immobilon上。胞外體的分析然后由Western印跡法用Ⅱ類MHC分子不同鏈的特異抗體進行。
得到的結果顯示，胞外體可從RBL-2H3系以實質方式在適當作用物刺激后釋放。這些胞外體可被分離與純化，例如通過制備胞外體組合物的差速超速離心法。最后，圖2B中給定的結果顯示，這些胞外體為功能化的。Western印跡分析論證，得到的胞外體表達Ⅱ類MHC分子的不同重組鏈。此外，這些結果亦顯示在本發(fā)明胞外體的表面上高密度的肽-MHC復合物。
以下實施例特別說明DR1 HA胞外體的用途，其用以制備特異于此聯(lián)合體的抗體，及DR1 HA胞外體結合特異于此相同聯(lián)合體的T淋巴細胞的能力。2．特異于DR1 HA復合物的抗體的產生此實施例說明本發(fā)明胞外體的用途，其用以制備抗體，特別是所謂的“受限制”抗體，即其特異于與MHC分子結合的抗原肽。此實施例特別是說明本發(fā)明胞外體的極強免疫原性，因為其能在無任何添加劑的情況下產生抗體。
從RBL DR1 HA細胞的上清液純化的胞外體(實施例1)被再次懸浮于PBS。這些胞外體然后在無任何添加劑的條件下被用以免疫Balb/c小鼠或LOU大鼠，過程與以下一致-小鼠在由3周的時段分開的2次注射中由皮下途徑注射10微克胞外體，然后由腹膜內注射30微克胞外體，在血清收集前3天由靜脈注射30微克。
-大鼠由腹膜內途徑在由3周的時段分開的2次注射中注射胞外體(10微克)，然后在血清收集前3天由靜脈內途徑注射胞外體(50微克)。
如示于圖3A，從免疫小鼠收集的血清顯示出抗RBL系的極強反應性，不論RBL系表達或不表達DR1 HA復合物，但低至3萬倍稀釋的血清只顯示出表達細胞DR1 HA的RBL系的反應性。
如示于圖3B，免疫大鼠的血清以驚人的方式顯示抗表達DR1 HA復合物的RBL系的反應性，而相同血清以較低強度對初始RBL-2H3系反應。而且，加入HA肽至DR1表達細胞(RB1-2H3 DR1)使產生的抗血清反應性的顯著增加(圖3B)。
這些結果因此顯示RBL系的胞外體能誘導抗體反應，其以未預期的方式在大鼠中主要被引導對抗DR1 HA復合物。
免疫大鼠的脾與X63A8系的細胞融合。得到的雜交瘤通過克隆稀釋使用傳統(tǒng)免疫學技術分類，然后由免疫熒光法選定具有產生的單克隆抗體的特異性的雜交瘤。不同的單克隆抗體以此方式獲得，一些抗RBL系的蛋白質，另一些抗DR1單體型人Ⅱ類分子的單體型決定簇，最后一些抗由DR1分子構成的復合物，此DR1分子與從流感病毒HA蛋白質衍生的肽結合(圖3C)。這些后者單克隆抗體形成受限制抗體，并因此具有特別有利的性質用于診斷或治療應用。3-特異于DR1 HA復合物的T淋巴細胞的檢測。
此實施例說明使用本發(fā)明的胞外體以在生物樣品中檢測特異T淋巴細胞。此實施例亦顯示胞外體如何可用以選擇及擴增特殊T淋巴細胞群體，其特別意在被再次注射至個體(細胞治療)。此研究途徑可明顯地延展至使用述于實施例2的受限制抗體，及檢測任何配位特異的受體。
為實施此應用，標記的胞外體被產生。為此目的，在純化DR1 HA系的胞外體前，后者與熒光示蹤劑一起培養(yǎng)，該示蹤劑強烈蓄積于內含于分泌粒中的胞外體。使用的示蹤劑“綠示蹤劑”為熒光脂質，其蓄積于細胞溶酶體中。在固定后，細胞在共焦顯微鏡下的分析顯示熒光標記存在于細胞的分泌粒中(圖4A)。熒光胞外體然后被產生并從這些細胞在述于實施例1的條件下純化。因此制成熒光性的這些胞外體(圖4B)被用以在生物樣品中檢測特異于DR1 HA聯(lián)合體的T淋巴細胞(THA淋巴細胞)的存在。明顯，任何其他標記可在本發(fā)明的范疇內使用，應用至生產細胞或至產生的胞外體上。
為此目的，胞外體在THA淋巴細胞及特異于另一種復合物的TH30淋巴細胞的樣品存在下培養(yǎng)。由流式細胞儀得到的結果顯示，表達DRLHA的胞外體以特異的方式與THA淋巴細胞結合(圖4C)，其中這些相同胞外體不能識別具有另一種特異性的淋巴細胞(圖4D)。這些結果顯示由本發(fā)明肥大細胞系產生的胞外體檢測特異于此相同復合物的T淋巴細胞的獨特、意外的能力。此應用可使用任何類型的生物樣品實施。
而且，此技術可以相同方式施至表達MHCⅠ-肽復合物的胞外體的制備及用途。借助本發(fā)明，因此有可能在呈遞細胞(甚至腫瘤細胞)的表面上檢測從腫瘤表達的抗原衍生的肽的MHCⅠ類與Ⅱ類分子的呈遞。本發(fā)明因此亦能檢測、甚至純化能識別這些相同復合物的T淋巴細胞。它們因此可被用于擴增特異于特定肽-MHC的T淋巴細胞群體，例如擴增CTL淋巴細胞群體以用于其治療用途。例如已發(fā)展用于癌癥或病毒感染的不同免疫治療方法，其基于從個體收集淋巴細胞樣品及體內擴展特異于參與病癥的抗原(例如腫瘤或病毒抗原)的T淋巴細胞的特殊克隆。這些經擴增的克隆然后被再次作為治療劑施至個體。在選擇與擴增T淋巴細胞的特異克隆，及因此潛在應用與實施這些治療途徑中，本發(fā)明帶來更大的簡便性。4-載有鼠MHCⅡ類分子的胞外體的制備(圖5A、5B)。
編碼IAb單體型鼠Ⅱ類分子的α和β鏈與鼠不變鏈的互補DNA被插入NT真核生物表達載體，其中cDNA轉錄處在αSR啟動子的控制下。各質粒亦載有抗性基因，其針對潮霉素(用于αIAb鏈)、對新霉素(用于βIAb鏈)或zeocine(用于不變鏈)。RBL 2H3細胞由電穿孔轉染(材料與方法)后，細胞基于其對三種抗生素的抗性選定，然后抗性細胞由有限稀釋法克隆，并由流式細胞儀使用特異的Y3P抗體表征對IAb分子的表達。
圖5顯示得到的一些結果。流式細胞儀分析顯示RBL IAbIi細胞由Y3P抗體(特異于IAb分子)以對B淋巴細胞系B414等價的方式識別，而在初始RBL系上未檢測出標記(圖5A)。因為顯微鏡的形態(tài)分析確立，鼠Ⅱ類IAb分子，如人DR1分子一樣，蓄積在細胞的分泌粒中(未示出)，此導致我們去搜尋其在胞外體中的定位。細胞的胞外分泌作用由添加1毫摩爾每升離子霉素而起始，且得到的胞外體由差速超速離心純化(參閱實施例1、2)。這些胞外體制備物的Western印跡顯示，其含與該對照組細胞的溶胞產物中檢測到的完全相同的Ⅱ類MHC鼠分子(圖5B)。
這些結果論證，Ⅱ類人分子(DR1)以及鼠分子(IAb)可被表達，并可蓄積于相對應的RBL 2H3系的胞外體中。5-由RBL 2H3產生的胞外體的形態(tài)表征(圖6)用共焦顯微鏡在RBL細胞的冷凍免疫標記切片上的觀察揭示出存在著充滿膜的多數(shù)細胞內區(qū)室。這些膜的大多數(shù)部分相對應于充滿區(qū)室內腔的囊泡(圖6A)。當轉染至這些細胞中時，Ⅱ類分子蓄積在具有內囊泡的區(qū)室中，并特別是在與這些囊泡膜結合下被顯像(圖6A)。
當RBL細胞經刺激，以誘導其去粒化(IgE-抗原或離子霉素)時，細胞內區(qū)室與質膜融合。與Ⅱ類分子結合的內囊泡被釋放至細胞外介質中。這些囊泡然后被稱為胞外體。
電子顯微鏡中檢測胞外體的形態(tài)與其蛋白質內容物的精選方法為“全支持”方法。借助此技術，有可能顯像無任何其他細胞內容物的全胞外體。借助此方法，亦可能在高效力下檢測與胞外體膜結合的分子。借助使用此技術，我們觀察到RBL細胞分泌的胞外體具有從30至120納米的不均勻大小及對電子具有可變的密度(圖6B)。Ⅱ類分子在具有80至100納米大小及對電子具有平均密度的囊泡群中大量存在。富含Ⅱ類分子的大多數(shù)這些囊泡為碟形的(圖6C)。6-在載體介質上胞外體的固定化(圖5C)。
本實施例描述胞外體固定在固體載體上，并顯示以此方式固定的胞外體維持其功能性質。這些新穎產物(胞外體載體)可用以表征及分析胞外體；或例如作為診斷或試劑產品以檢測和/或刺激試管中T淋巴細胞。
由無論是否表達Ⅱ類人或鼠分子的RBL細胞產生的不同胞外體制備物與由醛硫酸鹽活化的4微米膠乳珠一起培養(yǎng)。更特別是，從RBL2H3去粒化上清液純化的胞外體在PBS中洗滌(在50000rpm下在TLA100.4上離心30分鐘)。30微克胞外體與10微升無菌收集的膠乳珠混合、均質化，然后在室溫下培養(yǎng)10分鐘至15分鐘。珠體積然后用1×PBS達到1毫升，然后在室溫下培養(yǎng)2小時。其后，與胞外體交聯(lián)的珠-通過加入終濃度100毫摩爾每升甘氨酸飽和(在室溫下30分鐘)，-在2200g下在4℃下離心2分鐘，然后珠殘留物在1毫升1×PBS3％SVF0.01％NaN3中收集。
為使用珠體供細胞熒光測定法-在1×PBS3％SVF0.01％NaN3中洗滌珠殘留物2至3次，-在1毫升1×PBS0.01％NaN3中收集，-使用每點在5微升至20微升間及在第1孔中傳統(tǒng)地培養(yǎng)二抗。讀取在Facscalibur(Becton Dickinson)上進行。
借助此技術，有可能以胞外體覆蓋這些膠乳珠的表面，而保留其結構。
當胞外體在珠體上時，其處理變成更簡單。其例如可在低速下離心及由傳統(tǒng)流動細胞計數(shù)法技術檢測。圖5C顯示由流動細胞計數(shù)法檢測進入胞外體組成的不同蛋白質的一些實例。以醛硫酸鹽活化的膠乳珠或與由非轉染的RBL 2H3細胞產生的胞外體一起培養(yǎng)，或與表達Ⅱ類人分子DR1和IiHA構建體或Ⅱ類鼠分子IAb的RBL 2H3細胞的胞外體一起培養(yǎng)，或與胎牛血清(FCS)一起培養(yǎng)作為對照組。以此方式制備的膠乳珠然后與不同單克隆抗體培養(yǎng)；抗體包括識別存在于RBL 2H3分泌粒中CD63分子的AD1、特異于分子IAb的Y3P抗體、及特異于DR1分子的L243抗體。這些不同抗體由與藻紅蛋白偶聯(lián)的二抗顯像，然后得到的標記由流式細胞儀以FACScalibur(Beckman)分析。
因此觀察到CD63分子明顯地存在于從細胞RBL衍生的所有胞外體上，不論其是否表達Ⅱ類分子，而以IAb胞外體包被的膠乳珠特異地由Y3P及非由L243識別，而相反地，DRIiHA胞外體由L243而非由Y3P識別。這些抗體無一識別覆蓋以胎牛血清的膠乳珠(圖5C)。
這些結果顯示此技術能靈敏地特異檢測進入胞外體組成的不同蛋白質的表達。實施例8亦顯示借助如此產物(胞外體載體)，有可能亦能檢測或刺激特異T淋巴細胞的增殖。7-胞外體組成的操作處理(圖7)胞外體為脂質雙層所包圍的囊泡，其中被插入大量分子，如先前所提及的Ⅱ類MHC分子或CD63。在這些囊泡內部發(fā)現(xiàn)前面跨膜分子的胞質區(qū)域，亦發(fā)現(xiàn)從細胞質衍生的可溶性蛋白質。為論證有可能任意修飾這些囊泡的內容物，我們使用綠熒光蛋白質(GFP)作為示蹤劑。
編碼GFP的cDNA在人DR1分子β鏈的羧基末端上融合。此被插入載有潮霉素抗性基因的NT表達載體中的構建體，與載有DR1α鏈及新霉素抗性基因的載體共轉染至細胞RBL 2H3中。對這兩種抗生素具有抗性的細胞被選定，然后陽性挑選表達GFP的細胞。
更特別是，我們制成結合DRβ鏈的細胞質部分(在C端上)至GFP的N端的構建體。DRβ的cDNA在位置565上具有PstⅠ位點。此cDNA3’側的約200個堿基對片斷由PCR從載體pcDNA3/RSV/Dra擴增，其中借助包括5’PstⅠ位點及3’NcoⅠ位點的兩個寡核苷酸，其附加消除終止密碼子。得到的PCR片斷以PstⅠ與NcoⅠ消化，并克隆進載體pEGFP N1(Clontech)的相同位點。以PstⅠ與Xbal消化生成的質粒能使相對應于其后跟著GFP的Dra最后30個氨基酸的片斷釋放。同樣地，質粒pcDNA3/RSV以EcoRV/PstⅠ消化，因而釋放相對應于DRa鏈剩余部分的片斷(從起點至PstⅠ位點)。2個片斷然后被組裝及克隆進pcDNA3/CMV EcoRV與Xbal間。
這些細胞(DR1 GFP)由流動細胞計數(shù)法分析顯示，由L243抗體識別而特異于DR1分子的細胞亦放出在管道FL1中檢測的綠熒光，而以未包括GFP的DR1α與β鏈轉染的細胞在管道FL1中未放出任何熒光(圖7A)。
為了論證GFP真的內含于細胞RBL 2H3的胞外體中，從細胞RBLDR1 GFP衍生的胞外體由差速超速離心制備，然后用Western印跡法(圖7B)及在膠乳珠上交聯(lián)后用流動細胞計數(shù)法(圖7C)分析。在Western印跡法下，GFP的特異抗體在細胞DR1 GFP及在其胞外體中檢測相對應于與GFP融合的DR1β鏈分子量的65 kDa的蛋白質(圖7B)，而在細胞RBL 2H3的溶胞產物中沒有檢測到信號，不論其是否單獨表達DR1分子。以胎牛血清或以從DR1 GFP細胞衍生的胞外體交聯(lián)的膠乳珠之間的比較顯示，單獨地以胞外體包被的珠體在管道FL1中誘導熒光(FITC)，并由L243抗體識別，其特異于DR1，并由與藻紅蛋白偶聯(lián)的二抗檢測。
這些結果因此論證有可能插入外源蛋白質至由RBL 2H細胞產生的胞外體內部。這些結果進一步顯示，有可能由在生產細胞中的表達以與跨膜分子如MHC分子融合的形式引導蛋白質至胞外體上。8-胞外體的功能件表征(圖8)此實施例顯示由RBL 2H3細胞產生并載有Ⅱ類MHC分子的胞外體能結合抗原肽并能刺激表達此肽-MHCⅡ類復合物的特異抗體的T淋巴細胞。
從以綠細胞示蹤劑標記的RBL DR1 IiHA細胞產生的胞外體在兩個類型的T細胞存在下培養(yǎng)具有特異于HLA-DR1/HA復合物的TCR的THA，及無該受體的野生T Jurkat。結合實驗使用圓底孔的96孔多重盤，RPMI 1640培養(yǎng)基補充以10％胎牛血清、緩沖以10毫摩爾每升Hepes至終體積為每孔50微升，每格105個T細胞及可變量的熒光胞外體，在37℃下培養(yǎng)3小時。然后在以FACS在400微升PBS中分析收集的細胞前，在相同培養(yǎng)基中進行兩次洗滌。
劑量作用范圍被擬定顯示THA的標記強度與使用的胞外體量成比例。108個RBL DR1 IiHA細胞得到700微升胞外體。每孔從32至2微升胞外體范圍的劑量被測試。每點16微升而得的標記被保留，其相對應于產生由2300萬個細胞制成的胞外體(結果未示出)。
得到的結果顯示THA群體由熒光胞外體標記，其產生在FL1上細胞熒光測定法可檢出的熒光，而野生Jurkat則未經修飾(圖8A)。
進行同一類型標記，但是，在胞外體結合后，T細胞與AD1小鼠單克隆抗體抗大鼠CD63一起培養(yǎng)，其后由藻紅蛋白標記的驢抗體抗小鼠IgG顯像(Jackson Immuno Research,West Grove,PA)。相同標記同樣地在T細胞上制成，該T細胞曾暴露至胞外體?？梢姷?圖8B)，如由其在FL1上的熒光證實，僅結合THA細胞的胞外體亦在FL2上標記，其指示在其表面上新存在著大鼠CD63。
我們的結果因此顯示熒光胞外體可由流動細胞計數(shù)法用以顯像T淋巴細胞群體，其特異于由胞外體載有的HLA-DR/抗原肽復合物。
為評估胞外體以依賴肽存在的方式刺激T淋巴細胞的能力，將從DR1 GFP細胞獲得的胞外體交聯(lián)在膠乳珠上，然后在T Jurkat淋巴細胞系的細胞存在下培養(yǎng)，不論該細胞系是否表達復合物DR1-HA肽307-319的特異T受體。
膠乳珠以與用于流動細胞計數(shù)法相同的方式制備，但在完全培養(yǎng)基(RPMI,10％胎牛血清，1％青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺、0.1％β-疏基乙醇、4％丙酮酸鈉)中洗滌。為刺激T淋巴細胞，各珠殘留物在100微升中收集50微升，放在96孔多重盤的第1孔及50微升被稀釋成兩半。對照組以相同方式用在胎牛血清中培養(yǎng)的珠進行。T細胞(TJurkat Pasteur及THA1.7)被調至106個細胞/毫升，每孔被放置50微升。在完全培養(yǎng)基中被稀釋至15微摩爾每升的肽亦加入至每格50微升的部分中。在無肽的系列中，每孔50微升完全培養(yǎng)基被加入。培養(yǎng)盤置于培養(yǎng)箱(37℃,5％CO2,H2O)中20小時，然后上清液被收集，IL2的濃度以CTL.L2試驗來評估。
觀察到HA肽(5毫摩爾每升)的加入特異地誘導對表達DR1-HA(THA)復合物的受體的T Jurkat細胞的刺激，而其對對照組T淋巴細胞(T Jurkat)不具有影響。而且，一些胞外體在無HA肽存在下不能刺激THA(圖8C)。9．人肥大細胞系的胞外體(圖9)本實施例顯示根據(jù)本發(fā)明修飾的胞外體可產生自其他細胞，特別是人細胞。特別是，我們得到的結果論證，人MHCⅠ源的肥大細胞系能在增加細胞內鈣的推動下及在與誘導由大鼠系RBL 2H3分泌胞外體相同的條件下產生胞外體。
由流動細胞計數(shù)法對MHCⅠ系的表征指出，這些細胞的表面表達Ⅰ類MHC分子(W6.32)，但非Ⅱ類分子(L243)。而且，其對分子CD9、CD63和CD81為陽性，但對分子Lamp1和Lamp2為陰性(圖9A)。
胞外體從MHCⅠ系經加入離子霉素(1毫摩爾每升)產生，但從上清液經差速超速離心純化。在交聯(lián)至膠乳珠上后由流動細胞計數(shù)法及由Western印跡法分析其組成。
以使用膠乳珠的方法對胞外體分析的顯示，其載有分子Lamp1、CD9、CD63、CD81及Ⅰ類MHC分子，但無Ⅱ類分子，亦無Lamp2分子(圖9B)。此外，在電子顯微鏡下觀察的這些胞外體的形態(tài)與該由RBL 2H3系產生的胞外體的形態(tài)完全相同。最后，由Western印跡法所觀察的蛋白質組成確認這些結果，因為，借助此技術，我們發(fā)現(xiàn)分子CD63、Lamp1、MHCⅠ類，而Lamp2、MHCⅡ類仍為陰性的(圖9C)。
總結，系MHCⅠ似乎為RBL 2H3大鼠系的人同系物，這是由于在增加細胞內鈣后MHCⅠ產生具有相同結構與分子特征的胞外體的能力。借助這些細胞，因此有可能產生表達Ⅱ類MHC分子或特異性尋址至它們的任何其他分子的重組人胞外體。
權利要求
1．一種膜囊泡，其特征在于其包含人主要組織相容性復合體的重組分子。
2．如權利要求1的囊泡，其特征在于主要組織相容性復合體的重組分子為Ⅱ類分子。
3．如權利要求2的囊泡，其特征在于主要組織相容性復合體的重組Ⅱ類分子為α鏈。
4．如權利要求2的囊泡，其特征在于主要組織相容性復合體的重組Ⅱ類分子包括α鏈與β鏈。
5．如權利要求2至4中任一項所述的囊泡，其特征在于主要組織相容性復合體的重組Ⅱ類分子從血清型DR1至DR13中選擇，優(yōu)選從DR1至DR7中選擇。
6．如權利要求1的囊泡，其特征在于主要組織相容性復合體的重組分子為Ⅰ類分子。
7．如權利要求1至6中任一項所述的囊泡，其特征在于其含有由規(guī)定肽與主要組織相容性復合體的重組分子形成的復合物。
8．如前述任一項權利要求所述的囊泡，其特征在于其亦含一種或多種目的異源分子。
9．如前述任一項權利要求所述的囊泡，其特征在于其亦含一種肽或使其能純化的重組蛋白質。
10．如前述任一項權利要求所述的囊泡，其特征在于其包含示蹤劑。
11．如前述任一項權利要求所述的囊泡，其特征在于其基本上不含內源MHC分子。
12．一種膜囊泡，其特征在于其是從肥大細胞或肥大細胞衍生的細胞獲得，并且其含一種或多種目的異源分子。
13．如權利要求12的囊泡，其特征在于所述的目的分子為蛋白質、多肽、肽、核酸、脂質，或化學、生物或合成的物質。
14．如權利要求13的膜囊泡，其特征在于異源分子為主要組織相容性復合體分子、抗原、受體配體、配體受體、核酸、藥物產品、示蹤劑和/或純化肽。
15．如權利要求14的囊泡，其特征在于其表達配體受體，并且其包含另一種目的異源分子。
16．一種膜囊泡，其特征在于其含有在目的多肽與尋址信號間形成的重組融合分子。
17．一種胞外體生產細胞，其特征在于其含一種或多種編碼主要組織相容性復合體分子的重組核酸。
18．如權利要求17的細胞，其特征在于其為肥大細胞。
19．如權利要求18的細胞，其特征在于其為嗜堿性細胞白血病的肥大細胞系，特別是RBL系，優(yōu)選RBL-2H3。
20．如權利要求17至19的細胞，其特征在于其包含編碼Ⅱ類主要組織相容性復合體分子的α鏈和/或β鏈和/或編碼Ⅰ類主要組織相容性復合體分子的重組核酸。
21．一種制備含規(guī)定的重組分子的胞外體的方法，其包括以下步驟a)培養(yǎng)含有編碼所述規(guī)定的重組分子的重組核酸的肥大細胞或肥大細胞衍生的細胞，c)回收由該細胞產生的胞外體，這些胞外體含有所述規(guī)定的重組分子。
22．如權利要求21的方法，其特征在于其包括一中間步驟b)，在該步驟b)中，細胞被刺激而誘導和/或增加胞外體的分泌。
23．如權利要求21或22的方法，其特征在于所述規(guī)定的重組分子被暴露在胞外體外面，或全部或部分地包含在胞外體的胞質部分中。
24．如權利要求21至23中任一項所述的方法，其特征在于重組分子為主要組織相容性復合體分子、抗原分子、受體配體、配體受體、純化肽或任何其他目的多肽。
25．如權利要求21至24中任一項所述的方法，其特征在于所述核酸亦包括編碼朝向肥大細胞膜區(qū)室的尋址信號的區(qū)域。
26．一種制備含規(guī)定組成的肽-MHC復合物的胞外體的方法，其特征在于包括-培養(yǎng)含一種或多種編碼規(guī)定的MHC重組分子的重組核酸的胞外體生產細胞，-刺激細胞以誘導胞外體的釋放，-回收由該細胞產生的胞外體，這些胞外體在其表面上表達所述規(guī)定的MHC重組分子，及-使胞外體與肽或肽類接觸。
27．一種制備含規(guī)定組成的肽-MHC復合物的胞外體的方法，其特征在于包括-培養(yǎng)含一種或多種編碼規(guī)定的MHC重組分子的重組核酸及含編碼規(guī)定的重組肽的區(qū)域的核酸的胞外體生產細胞，-刺激細胞以誘導胞外體的釋放，-回收由該細胞產生的胞外體，這些胞外體在其表面上表達與該重組肽結合的所述規(guī)定的重組MHC分子。
28．如權利要求27的方法，其特征在于編碼重組肽的核酸編碼li不變鏈的衍生物，其中CLIP區(qū)域被刪除并由所述肽取代。
29．如權利要求26至28中任一項所述的方法，其特征在于所述生產細胞為肥大細胞或肥大細胞衍生的細胞。
30．如權利要求26至29中任一項所述的方法，其特征在于所述生產細胞基本上不含內源MHC分子。
31．一種修飾胞外體組成的方法，包括-將一種編碼規(guī)定分子的核酸插入胞外體生產細胞，所述核酸與膜區(qū)室中的尋址信號結合，及-從所述細胞產生胞外體。
32．含一種或多種如權利要求1至16中任一項所述的膜囊泡的組合物。
33．一種如權利要求1至16中任一項所述的囊泡用以制備多克隆和/或單克隆抗體的用途。
34．一種制備抗體的方法，包括以權利要求7的囊泡免疫動物，回收抗體和/或回收產生抗體或參與免疫應答的細胞。
35．如權利要求34的方法，該方法用以制備單克隆抗體，特別是特異于MHC-肽結合體的單克隆抗體。
36．如權利要求34或35所得的抗體或該抗體的片斷的用途，用以在生物樣品中檢測相對應的特異抗原的存在。
37．如權利要求34或35產生的抗體、或該抗體的片斷、或如權利要求1的囊泡的用途，用以制備治療組合物，該組合物用以抑制T淋巴細胞的受體與其所特異的MHC-肽復合物間的相互作用。
38．如權利要求1至16中任一項所述的膜囊泡的用途，用以在生物樣中檢測特異于蛋白質分子的配偶體。
39．如權利要求38的載有MHC-肽復合物的胞外體的用途，用以在生物樣品中檢測特異于此復合物的T淋巴細胞。
40．如權利要求38的載有TcR受體的胞外體的用途，用以在生物樣品中檢測特異于此受體的肽-MHC復合物。
41．如權利要求38的載有配體受體的胞外體的用途，用以在生物樣品中檢測所述配體的存在。
42．在生物樣品中檢測特異于抗原-MHC復合物的T淋巴細胞存在的方法，包括將該樣品與如權利要求7標記且含所述抗原-MHC復合物的胞外體接觸，及在該樣品中證實T淋巴細胞的標記。
43．一種如權利要求7的囊泡的用途，用以克隆增殖及/或體外刺激細胞毒性和/或輔助T淋巴細胞。
44．一種如權利要求11至16中任一項所述的囊泡的用途，用以制備意在將所述分子向細胞轉移的組合物。
45．含一種或多種固定在載體上的胞外體的組合物。
46．如權利要求1至16中任一項所述的膜囊泡的用途，特別是固定在載體上的膜囊泡的用途，用以純化細胞。
全文摘要
本發(fā)明與生物學和免疫學的領域有關。本發(fā)明涉及含具有特定結構的分子的膜囊泡,特別是含抗原分子的膜囊泡,及其用途。更特別涉及含主要組織相容性復合體的重組分子的囊泡(胞外體),及其作為免疫原性試劑或作為診斷或治療工具的用途。本發(fā)明亦涉及制備這些囊泡、基因構建體、細胞及組合物的方法,其可用以實施本發(fā)明的方法。
文檔編號C07K16/18GK1325441SQ99812879
公開日2001年12月5日 申請日期1999年11月4日 優(yōu)先權日1998年11月5日
發(fā)明者菲利普·貝納羅赫, 埃萊娜·樊尚－施奈德, 帕梅拉·施通普尼爾, 塞巴斯蒂昂·阿米戈雷納, 克里斯蒂昂·博納羅, 格拉卡·拉波索 申請人:法國國家衛(wèi)生及研究醫(yī)學協(xié)會, 法國居里學院, 法國國家科學研究中心