專利名稱：抗嗜水氣單胞菌卵黃免疫球蛋白蛋黃粉包膜劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及飼料添加劑的制備工藝，特別是一種用于水產(chǎn)的具有調(diào)節(jié)動(dòng)物生長(zhǎng)和免疫機(jī)能的飼料添加劑，具體為抗嗜水氣單胞菌卵黃免疫球蛋白蛋黃粉包膜的制備方法。
背景技術(shù)：
嗜水氣單胞菌(Aetomonas hydrophila)是一種革蘭氏陰性短桿菌，有運(yùn)動(dòng)力。在自然界中分布廣泛。越來(lái)越多的證據(jù)表明，嗜水氣單胞菌可引起軟體動(dòng)物、魚(yú)類、兩棲類、爬行類、鳥(niǎo)類及哺乳類等多種動(dòng)物的全身性敗血癥或局部感染，常致動(dòng)物大量死亡。20世紀(jì)80年代末在中國(guó)、菲律賓、泰國(guó)、印度等傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖大國(guó)的魚(yú)類爆發(fā)性疾病中，該菌被認(rèn)為是重要的病原。
為了預(yù)防和控制在養(yǎng)殖過(guò)程中的魚(yú)、蝦、蟹、鱉、鰻魚(yú)、龜類等水生動(dòng)物嗜水氣單胞菌病的發(fā)生，往往采用疫苗、抗菌素和其他化合物等。但是，利用疫苗控制水生動(dòng)物傳染性疾病免疫途徑和免疫效率尚待考證；嗜水氣單胞菌又具有與磺胺、四環(huán)素、鏈霉素以及氯霉素的抗藥性有關(guān)的天然R質(zhì)粒，為提高養(yǎng)殖動(dòng)物的抗病能力和增加動(dòng)物源食品的安全性，必須尋找無(wú)毒，無(wú)殘留、低成本、高效的材料用于該病的防治。
雞蛋作為一種食品營(yíng)養(yǎng)的來(lái)源已廣為人所知，蛋黃中不僅含有包括蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸等在內(nèi)的多種氨基酸，而且還含有卵黃免疫球蛋白、卵黃高磷蛋白、脂蛋白、唾液酸、唾液酸低聚糖等可以抵抗細(xì)菌和病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能生物活性物質(zhì)。尤其是當(dāng)其中含有高特異性卵黃免疫球蛋白的時(shí)候，就可能成為預(yù)防感染及替代或減少抗生素的材料使用。
但在利用特異性卵黃免疫球蛋白添加劑研制雞卵黃粉的過(guò)程中，需要注意以下四方面的問(wèn)題1)高效價(jià)抗體的制備技術(shù)，2)在保留黃免疫球蛋白等生物活性物質(zhì)活性的同時(shí)，去除蛋黃中的水分(約48％)，3)產(chǎn)品在口服過(guò)程中具有緩釋特性，以減少胃蛋白酶對(duì)其活性的影響，4)生產(chǎn)成本低廉和工藝的便捷，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明在原有的高效價(jià)抗體的制備技術(shù)基礎(chǔ)上，通過(guò)包被劑的選擇和主要生產(chǎn)工藝關(guān)鍵參數(shù)的制定，提供一種包膜含抗嗜水氣單胞菌卵黃免疫球蛋白的蛋黃粉飼料添加劑的方法，并將其產(chǎn)品在飼養(yǎng)中進(jìn)行應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將檢測(cè)合格后雞蛋收集，將收集的雞蛋用一定的方法去殼、殼膜和蛋清后，將蛋黃、水、β-環(huán)糊精、淀粉按一定程序和比例添加后，通過(guò)生產(chǎn)工藝流程、干燥過(guò)程中關(guān)鍵參數(shù)的控制，制成包膜含抗嗜水氣單胞菌卵黃免疫球蛋白蛋黃粉飼料添加劑，經(jīng)檢測(cè)合格后以口服途徑的方式可應(yīng)用于魚(yú)、蝦、鰻、蟹、鱉等水產(chǎn)動(dòng)物飼料。所述動(dòng)物包括但并不局限于魚(yú)、蝦、蟹、鱉、鰻魚(yú)、龜類等水產(chǎn)類動(dòng)物。
本發(fā)明的抗嗜水氣單胞菌卵黃免疫球蛋白蛋黃粉包膜劑的制備方法包括下述步驟(1)將含有滴度為1∶640及以上抗嗜水氣單胞菌卵黃抗體的雞蛋收集；(2)將雞蛋用常規(guī)的方法去殼、殼膜和蛋清，收集蛋黃液；(3)以重量比將β-環(huán)糊精、水按1∶2比例混合，調(diào)節(jié)pH至6.5，用轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘的手提攪拌機(jī)攪拌30分鐘，獲β-環(huán)糊精水溶液；(4)按體積比為5.6∶1取蛋黃液與β-環(huán)糊精水溶液，將蛋黃液緩慢加入至β-環(huán)糊精水溶液中，用轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘的手提攪拌機(jī)攪拌30-60分鐘，獲β-環(huán)糊精蛋黃液；(5)將含水率小于＜8％的淀粉與β-環(huán)糊精蛋黃液混合，淀粉與β-環(huán)糊精蛋黃液的重量比為16∶1，在轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌機(jī)上攪拌25-40分鐘，獲混合物料；(6)將上述混合物料于80目篩網(wǎng)的搖擺制粒機(jī)上制粒；(7)將制粒后的混合物料在45℃條件下于臥式沸騰干燥機(jī)上干燥2小時(shí)；(8)干燥后的產(chǎn)物于60目篩網(wǎng)上過(guò)篩。
產(chǎn)品直徑約為0.3-0.5mm的小顆粒，具有良好的滾動(dòng)性，呈淡黃色。


圖1為兩種添加劑20×稀釋后的OD492值A(chǔ).抗嗜水氣單胞菌IgY添加劑；B.非特異性IgY抗體添加劑。
圖2為抗嗜水氣單胞菌IgY添加劑抗體滴度。
圖3為抗體溶出曲線圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施對(duì)本發(fā)明的包膜劑制備技術(shù)作進(jìn)一步描述。
1、含特異性抗體蛋黃液收集
1.1、收集100公斤以一定技術(shù)制備的含有滴度為1∶640及以上抗嗜水氣單胞菌卵黃抗體的雞蛋。
1.2、將雞蛋用常規(guī)的方法去殼、殼膜和蛋清，收集蛋黃，100公斤鮮蛋獲得28公斤的蛋黃液。
2、蛋黃液包埋2.1、將β-環(huán)糊精、水按1∶1～2比例混合，調(diào)節(jié)pH至6.5，并用轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘的手提攪拌機(jī)攪拌30分鐘。
2.2、將1.2中的蛋黃液緩慢加入至2.1(蛋黃液與β-環(huán)糊精的比例為2.8～5.6∶1)，并用轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘的手提攪拌機(jī)攪拌30-60分鐘。
2.3、將淀粉(含水率小于＜8％)與2.2所得物料混合(淀粉與β-環(huán)糊精的比例為16～32∶1)，并在轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌機(jī)上攪拌均勻，時(shí)間為25-40分鐘。
3、制粒、干燥3.1、將2.3于80目的篩網(wǎng)的搖擺制粒機(jī)上制粒。
3.2、將3.1在45℃條件下于臥式沸騰干燥機(jī)XF30上干燥2小時(shí)。
3.3、將3.2的產(chǎn)物于60目篩網(wǎng)上過(guò)篩。
為驗(yàn)證本發(fā)明方法所得抗嗜水氣單胞菌卵黃免疫球蛋白蛋黃粉包膜劑的有益效果，進(jìn)行以下試驗(yàn)1、ELISA法添加劑中抗體活性檢測(cè) 經(jīng)18h培養(yǎng)后的嗜水氣單胞菌菌液用滅菌PBS(0.01mol·L-1，pH7.2)洗滌3次，調(diào)整細(xì)菌濃度為109CFU·mL-1，用碳酸鹽緩沖液(CBS0.05mol·L-1，pH 9.5)作10×稀釋，包被96孔酶標(biāo)板(NUNC)(每孔100μL)，4℃過(guò)夜；PBST(PBS+0.05％Tween-20(v/v))洗3次，每孔加入1％牛血清白蛋白200μL，37℃封閉2h；PBST洗3次，加不同稀釋倍數(shù)待檢含IgY的添加劑(每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù))，每孔100μL，37℃濕盒中反應(yīng)1h，PBST洗3次，按每孔100μL加入500×稀釋的兔抗雞IgY(HRP標(biāo)記)二抗(珠海百奧生物工程公司提供)，37℃濕盒中作用1h；PBST洗3次，按每孔100μL加入顯色液(20mL磷酸鹽-檸檬酸緩沖液+8mg鄰苯二銨+100μL過(guò)氧化二氫)，37℃避光反應(yīng)20min；2mol·L-1硫酸每孔50μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(美國(guó)，Bio-Tek，Elx800)檢測(cè)492nm處吸光值。以免疫雞IgY適當(dāng)稀釋度的OD492值(P)與經(jīng)適當(dāng)稀釋的陰性IgY的OD492值(＜0.20)(N)之比大于2.1作為抗體陽(yáng)性閾值，由此計(jì)算出免疫雞IgY的抗體效價(jià)。
2、抗體溶出度測(cè)定 稱取10g添加劑微囊置于智能溶出儀轉(zhuǎn)籃中，在37℃90ml 0.01MPBS中100rpm速度攪拌。取樣時(shí)間設(shè)定0m、10m、20m、30和40m。
3、試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)飼糧 杭州中德養(yǎng)殖有限公司提供的中華商品鱉。飼料配方和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。
表1 試驗(yàn)飼料配方和營(yíng)養(yǎng)水平

注*復(fù)合預(yù)混料由浙江大學(xué)飼料研究所提供4、飼養(yǎng)試驗(yàn)和樣品采集 選擇900只120日齡健康中華鱉，按養(yǎng)殖試驗(yàn)要求分成3組，每組300只(含3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100只，雌雄各半)，飼養(yǎng)于9個(gè)徹底消毒的水泥池中，每池面積為12m2，池底鋪30cm細(xì)砂，設(shè)水泥板為食臺(tái)。3組分別飼以添加0、2‰自制抗嗜水氣單胞菌IgY添加劑和2‰自制無(wú)特異性IgY抗體的添加劑的相同飼料。飼料加水制成團(tuán)狀，每天上午(8:30)和下午(16:00)定量投食各喂一次。殘余餌料回收，烘干稱重。試驗(yàn)用水為發(fā)電廠余熱水，入池前用本場(chǎng)供水池中的水調(diào)溫至30℃左右，在水溫和水質(zhì)監(jiān)控條件下，進(jìn)行65d(120～185日齡)的養(yǎng)殖試驗(yàn)，每日記錄料耗和攝食時(shí)間。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，稱重并計(jì)算中華鱉的日平均采食量、日增重和餌料系數(shù)。
5、攻毒試驗(yàn) 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取30只(每個(gè)重復(fù)10只)用109CFU·mL-1嗜水氣單胞菌(HZD111株)腹腔注射每只0.25mL進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，在上述養(yǎng)殖條件下，飼養(yǎng)14d，計(jì)算各組的死亡率。
6、細(xì)菌分離和計(jì)數(shù) 無(wú)菌采集攻毒試驗(yàn)過(guò)程中死亡的中華鱉腎臟0.5g，置于無(wú)菌的碾鈸中磨碎后，用無(wú)菌PBS作10×連續(xù)稀釋，取10-4稀釋的組織搗碎液100μL均勻于涂布于含有氨芐青霉素(20μg·mL-1)的LB平板上，35℃培養(yǎng)24h，計(jì)算細(xì)菌數(shù)。
7、數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)均以X□s表示，數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用SAS 6.03版的t檢驗(yàn)法。試驗(yàn)結(jié)果分析
1、添加劑中抗體效價(jià)圖1顯示，抗嗜水氣單胞菌IgY添加劑和無(wú)特異性IgY抗體添加劑經(jīng)20×蒸餾水稀釋后，OD值分別為1.095和0.147。進(jìn)一步對(duì)抗嗜水氣單胞菌IgY添加劑的效價(jià)檢測(cè)(圖2)，抗體滴度達(dá)到1∶640(640×稀釋時(shí)其P/N值為2.21)。
2、抗體溶出度測(cè)定隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，添加劑中卵黃抗體的逐漸溶出，至30分鐘左右，抗體達(dá)到完全釋放(圖3)，表明該添加劑具有良好的緩釋效果。
3、添加劑對(duì)中華鱉攝食時(shí)間、死亡率和生長(zhǎng)性能的影響由表2可見(jiàn)，添加2‰抗嗜水氣單胞菌IgY添加劑組平均日增重比對(duì)照組和2‰無(wú)特異性IgY抗體添加劑組提高0.148g(P＜0.01)和0.1g(P＜0.05)，而平均死亡率降低了66.7％、45.5％。添加2‰抗嗜水氣單胞菌IgY添加劑組平均攝食時(shí)間比對(duì)照組縮短了24.15％(P＜0.01)，與2‰無(wú)特異性IgY抗體添加劑組基本一致。各組的日采食量無(wú)顯著差異。
表2 添加劑對(duì)中華鱉生長(zhǎng)性能的影響

注同一行數(shù)據(jù)后字母不同者差異顯著(小寫(xiě)字母)(P＜0.05)或極顯著(大寫(xiě)字母)(P＜0.01)4、攻毒各組的死亡率和腎臟中細(xì)菌總數(shù)攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示(表3)，添加2‰抗嗜水氣單胞菌IgY添加劑組死亡率比對(duì)照組和2‰無(wú)特異性IgY抗體添加劑組分別降低了80.8％和79.2％，腎臟中的細(xì)菌數(shù)也明顯減少。
表3 試驗(yàn)各組的死亡率和腎臟中細(xì)菌總數(shù)

討論雞蛋作為一種食品營(yíng)養(yǎng)的來(lái)源已廣為人所知，蛋黃中不僅含有包括蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸等在內(nèi)的多種氨基酸，而且還含有卵黃免疫球蛋白、卵黃高磷蛋白、脂蛋白、唾液酸、唾液酸低聚糖等可以抵抗細(xì)菌和病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能生物活性物質(zhì)。試驗(yàn)表明，在水產(chǎn)飼料中添加多種氨基酸復(fù)合物有助于改善飼料的適口性和增加誘食效果。在進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)過(guò)程中，在中華鱉飼料中添加含有特異性IgY抗體、非特異性IgY抗體的蛋黃粉組與對(duì)照組相比，其平均日增重分別提高21.73％(P＜0.01)和7.24％(P＜0.05)，平均攝食時(shí)間分別縮短24.15％(P＜0.01)和26.06％(P＜0.01)，平均餌料系數(shù)分別下降了13.55％(P＜0.01)和5.6％(P＜0.05)，這可能與蛋黃粉中含有多種氨基酸和生物活性物質(zhì)有關(guān)。
但是，在利用雞卵黃研制添加劑的過(guò)程中，去除蛋黃中的水分(約48％)的同時(shí)，應(yīng)考慮溫度、pH等因素對(duì)卵黃免疫球蛋白等生物活性物質(zhì)活性的影響，而且還須注意生產(chǎn)成本和工藝的便捷程度。本發(fā)明顯示，通過(guò)向卵黃中添加一定比例的賦形劑后在臥式沸騰干燥機(jī)中的干燥方法，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便、成本低廉等特點(diǎn)，制備的添加劑保留較高的生物活性(抗體滴度1∶640)和較好的適口性。
在人工養(yǎng)殖的鱉場(chǎng)流行所謂“甲魚(yú)紅脖子病”在我國(guó)有所報(bào)道，嗜水氣單胞菌為其主要病原之一，該菌亦可引起軟體動(dòng)物、魚(yú)類、兩棲類、鳥(niǎo)類及哺乳類等多種動(dòng)物的全身性敗血癥或局部感染，常致動(dòng)物大量死亡，尤其是人工密集養(yǎng)殖和水溫較高的條件下最為常發(fā)，該病的安全防治現(xiàn)已成為規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖場(chǎng)的主要目標(biāo)之一。結(jié)果顯示，飼喂含有特異性IgY抗體的蛋黃粉組與對(duì)照組和添加非特異性IgY抗體的蛋黃粉組相比，其成活率分別提高了66.67％和45.45％。由于特異性IgY抗體具有中和嗜水氣單胞菌及其毒素的作用，至飼養(yǎng)飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，飼喂特異性IgY抗體組的中華鱉體表光潔，癤瘡明顯減少。攻毒試驗(yàn)亦表明，特異性IgY抗體的飼料添加劑對(duì)該病具有較好的預(yù)防作用，與對(duì)照組和飼喂非特異性IgY抗體組相比，死亡率可降低80.8％和79.2％，腎臟中細(xì)菌總數(shù)也明顯減少。但是IgY在中華鱉機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)理和代謝有待進(jìn)一步研究。
本發(fā)明表明，通過(guò)向含有特異性抗體的卵黃中添加一定比例的賦形劑后在臥式沸騰干燥機(jī)中的干燥方法，不僅生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便、成本低廉，而且所制備的添加劑具有較高的生物活性和較好的適口性，可用于嗜水氣單胞菌感染引起的中華鱉疾病預(yù)防和控制。
權(quán)利要求
1.抗嗜水氣單胞菌卵黃免疫球蛋白蛋黃粉包膜劑的制備方法，其特征在于下述步驟(1)將含有滴度為1∶640及以上的抗嗜水氣單胞菌卵黃抗體的雞蛋收集；(2)將收集的雞蛋用常規(guī)的方法去殼、殼膜和蛋清，收集蛋黃液；(3)以重量比將β-環(huán)糊精、水按1∶1～2比例混合，調(diào)節(jié)pH至6.5，用轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘的手提攪拌機(jī)攪拌30分鐘，獲β-環(huán)糊精水溶液；(4)按體積比為2.8～5.6∶1取蛋黃液與β-環(huán)糊精水溶液，將蛋黃液緩慢加入至β-環(huán)糊精水溶液中，用轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘的手提攪拌機(jī)攪拌30-60分鐘，獲β-環(huán)糊精蛋黃液；(5)將含水率小于＜8％的淀粉與β-環(huán)糊精蛋黃液混合，淀粉與β-環(huán)糊精蛋黃液的重量比為16～32∶1，在轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌機(jī)上攪拌25-40分鐘，獲混合物料；(6)將上述混合物料于60目篩網(wǎng)的搖擺制粒機(jī)上制粒；(7)將制粒后的混合物料在45℃條件下于臥式沸騰干燥機(jī)上干燥2小時(shí)；(8)干燥后的產(chǎn)物于80目篩網(wǎng)上過(guò)篩。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗嗜水氣單胞菌卵黃免疫球蛋白蛋黃粉包膜劑的制備方法。收集含有滴度為1∶640及以上的抗嗜水氣單胞菌卵黃抗體雞蛋的蛋黃液，將β－環(huán)糊精和水混合、攪拌成β－環(huán)糊精水溶液；按體積比為2.8～5.6∶1將蛋黃液緩慢加入至β－環(huán)糊精水溶液中，在轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘的條件下攪拌，將含水率小于＜8％的淀粉與β－環(huán)糊精蛋黃液混合、攪拌，所獲混合物料于60目篩網(wǎng)制粒，于臥式沸騰干燥機(jī)上干燥，80目篩網(wǎng)上過(guò)篩。所獲產(chǎn)品在保留卵黃免疫球蛋白等生物活性物質(zhì)活性的同時(shí)，具有緩釋特性，減少了胃蛋白酶對(duì)其活性的影響，試驗(yàn)表明本發(fā)明制備的蛋黃粉包膜劑添加劑有較高的生物活性和較好的適口性。
文檔編號(hào)A23K1/16GK1864520SQ20061005205
公開(kāi)日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2006年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月20日
發(fā)明者李肖梁, 方維煥 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)