專利名稱：：提高植物非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法以及因此產(chǎn)生的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：和背景本發(fā)明涉及提高植物中非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法，更特別地，涉及表達(dá)外源非生物脅迫耐受性基因的植物。非生物脅迫(也稱為"環(huán)境脅迫")條件，如鹽度，干旱，洪水，次佳溫度和有毒化學(xué)物質(zhì)污染，對(duì)農(nóng)業(yè)植物引起實(shí)質(zhì)性的損害。大部分植物已經(jīng)進(jìn)化出策略來(lái)保護(hù)它們自身以對(duì)抗這些條件。然而，如果脅迫條件的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間太大，對(duì)大多數(shù)作物的植物發(fā)育，生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響是意味深長(zhǎng)的。此外，大部分植物對(duì)非生物脅迫(ABS)非常敏感，并因此需要用于商業(yè)作物產(chǎn)量的最佳生長(zhǎng)條件。連續(xù)暴露于脅迫引起植物代謝的主要改變，其最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并且隨后產(chǎn)量損失。因此，盡管大范圍的研究以及使用復(fù)雜而深入的作物-保護(hù)方以下和無(wú)述了示例性非生物脅迫條件的含S。、與干旱相關(guān)的問(wèn)題。干旱是一段時(shí)間的異常干燥天氣，持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間以致產(chǎn)生了嚴(yán)重的水文不平衡(例如，作物損害，給水短缺等)。而我們經(jīng)歷的大部分天氣是短暫的，干旱是更漸進(jìn)的現(xiàn)象，緩慢占有區(qū)域和拉緊對(duì)時(shí)間的控制。在嚴(yán)重的情況中，干旱可以持續(xù)很多年并對(duì)農(nóng)業(yè)和水供給具有毀滅性的影響。隨著發(fā)展中的人口和可用新鮮水的慢性短缺，干旱不僅是農(nóng)業(yè)中天氣相關(guān)問(wèn)題的數(shù)字，而且還列為全部時(shí)間的主要自然災(zāi)難之一，不僅引起經(jīng)濟(jì)損失，而且引起人類生命的失去。例如，由1988年的US干旱引起的損失超過(guò)S400億元，超過(guò)1992年颶風(fēng)安德魯，1993年的密西西比河洪水和1989年的舊金山地震引起的損失。在世界的一些區(qū)域，干旱的情況更嚴(yán)重。在非洲的Horn,1984-1985年的干旱導(dǎo)致饑荒，使750,000人死亡。對(duì)于植物由低的水可用性引起的問(wèn)題包括由細(xì)胞水分離引起的機(jī)械應(yīng)力。干旱還使植物變得更易患上各種疾病(Simpson(1981)"TheValueofPhysiologicalKnowledgeofWaterStressinPlants"(植物中7Jc應(yīng)力的生理知識(shí)的價(jià)值)(Simpson,G.M.編輯)，Praeger,N.Ypp.235-265)。除了對(duì)大部分否則全部作物太干旱的世界許多陸地區(qū)域，可用水的過(guò)度使用和過(guò)度利用導(dǎo)致農(nóng)業(yè)可用陸地的日益減少，該過(guò)程達(dá)到極端將導(dǎo)致沙漠化。土壤中日益增加的鹽累積進(jìn)一步使問(wèn)題復(fù)雜化，如上所述，這增加了土壤中可用水的損失。與高鹽水平相關(guān)的問(wèn)題。五分之一公項(xiàng)的灌溉地受到鹽的損害，古代耕地社會(huì)群落下降的一個(gè)重要?dú)v史因素。預(yù)期這種情況只會(huì)惡化，進(jìn)一步降低可耕地的可用性和作物生產(chǎn)，因?yàn)樽畛Ｒ?jiàn)的五種糧食作物(小麥，玉米，水稻，土豆和大豆)中沒(méi)有一種可以耐受過(guò)度的鹽。鹽對(duì)植物的有害影響是導(dǎo)致滲透應(yīng)力(與干旱脅迫相似)的缺水的結(jié)果和過(guò)量鈉離子對(duì)關(guān)鍵生化過(guò)程的影響。與水凍和干旱相同，高鹽導(dǎo)致缺水；高鹽的存在使植物根部難以從其環(huán)境吸取水(Buchanan等(2000)在BiochemistryandMolecularBiologyofPlants中,AmericanSocietyofPlantPhysiologists,Rockville,Md.)。因此土i裏鹽度是決定哪里植物可以茁壯成長(zhǎng)的多個(gè)重要變量之一。在世界的許多部分，由于天然的高土壤鹽度，相當(dāng)大的土地區(qū)域是無(wú)法耕作的。為了使該問(wèn)題更復(fù)雜，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的土壤的鹽化是主要依賴于農(nóng)業(yè)的區(qū)域中的重要且日益增加的問(wèn)題。過(guò)度利用，過(guò)度施肥和水短缺使后者復(fù)雜化，通常由氣候改變和遞增人口的需求引起。鹽耐受性在植物生命周期的早期特別重要，因?yàn)閺耐寥辣砻娴恼舭l(fā)引起向上的水移動(dòng)，并且鹽累積在放置種子的上層土壤中。因此，發(fā)芽通常發(fā)生在比整個(gè)土壤分布中平均鹽水平高得多的鹽濃度。與過(guò)度熱相關(guān)的問(wèn)題。許多作物的發(fā)芽對(duì)溫度非常敏感。提高熱條件中發(fā)芽的基因?qū)τ诜N植于季節(jié)后期或熱氣候中的作物是有用的。當(dāng)蒸騰作用不足以克服熱應(yīng)力時(shí)，暴露于過(guò)度熱的秧苗和成熟植物可能經(jīng)歷熱休克，其發(fā)生于各種器官中，包括葉子，特別是果實(shí)。熱還損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞器和細(xì)胞骨架，并損害膜功能[Buchanan等，(2000)在BiochemistryandMolecularBiologyofPlants中,AmericanSocietyofPlantPhysiologists,Rockville,Md.]。熱休克可以產(chǎn)生全部蛋白合成的降低，伴隨熱休克蛋白的表達(dá)。熱休克蛋白作為伴侶蛋白并涉及熱變性的重折疊蛋白。熱應(yīng)力通常伴隨低的水可用性的條件。將熱自身看作相關(guān)的應(yīng)力并增加由缺水條件引起的有害影響。蒸發(fā)的需求隨著白天溫度的提高呈現(xiàn)出接近指數(shù)增加，并可以導(dǎo)致高的蒸騰速度和低的植物水勢(shì)[Hall等(2000)PlantPhysiol.123:1449-1458]。對(duì)花粉的高溫?fù)p害幾乎通常結(jié)合干旱脅迫發(fā)生，很少在充分灌水的條件下發(fā)生。因此，分離熱和干旱脅迫對(duì)授粉的影響是困難的。結(jié)合的應(yīng)力可以以新的方式改變植物代謝；因此理解不同應(yīng)力之間的相互作用對(duì)于通過(guò)遺傳操作提高應(yīng)力耐受性的策略研發(fā)是重要的。與過(guò)度激冷條件相關(guān)的問(wèn)題。術(shù)語(yǔ)"激冷敏感性，，用來(lái)描述在低溫但是高于冷凍溫度產(chǎn)生的許多類型的生理?yè)p害。大部分熱帶來(lái)源的作物，如大豆，水稻，玉米和棉花，容易受到激冷的損害。典型的致冷損害包括萎蔫，壞死，萎黃或從細(xì)胞膜滲出離子。還沒(méi)有完全理解激冷敏感性的基礎(chǔ)機(jī)理，但是可能涉及膜飽和度的水平和其他生理缺陷。例如，光合作用的光抑制(由于高的光強(qiáng)度引起的光合作用的破壞)通常發(fā)生在晚夏/秋夜冷之后的晴朗天氣條件下。例如，激冷可以通過(guò)玉米延遲的成熟導(dǎo)致產(chǎn)量損失和降低產(chǎn)品質(zhì)量。生長(zhǎng)差的另一個(gè)后果是春天玉米地相當(dāng)差的植被，通常導(dǎo)致水土流失，提高的雜草叢生和降低的營(yíng)養(yǎng)吸收。礦物質(zhì)氮延遲的吸收還可能導(dǎo)致提高的硝酸鹽流失至地下水中。通過(guò)一些估算，激冷占美國(guó)(US)的金錢(qián)損失只在干旱和洪水之后。缺水是許多植物脅迫的常見(jiàn)組成部分。當(dāng)整個(gè)植物的蒸騰作用速度超過(guò)水吸收時(shí)，植物細(xì)胞中發(fā)生缺水。除了干旱，其他脅迫，如鹽度和低溫，產(chǎn)生細(xì)胞脫水(McCue和Hanson(1990)TrendsBiotechnol.8:358-362)。鹽和干旱脅迫信號(hào)傳導(dǎo)由離子和滲透體內(nèi)平衡信號(hào)途徑構(gòu)成。鹽應(yīng)力的離子方面通過(guò)SOS途徑來(lái)發(fā)出信號(hào)，在該途徑中鈣-應(yīng)答性SOS3-SOS2蛋白激酶復(fù)合物控制離子轉(zhuǎn)運(yùn)者SOS1的表達(dá)和活性。Xiong和Zhu(2002)PlantCellEnviron.25:131-139最近綜述了調(diào)節(jié)應(yīng)答鹽脅迫的離子體內(nèi)平衡的途徑。鹽脅迫的滲透組成部分涉及與干旱和/或冷應(yīng)力應(yīng)答重疊的復(fù)雜植物反應(yīng)。Xiong和Zhu(2002)上文最近綜述了干旱、冷和鹽脅迫應(yīng)答的常見(jiàn)特征。這些包括(a)在信號(hào)情況非常早的時(shí)候細(xì)胞質(zhì)鈣水平的瞬時(shí)改變(Knight,(2000)Int.Rev.Cytol.195:269-324;Sanders等(1999)PlantCell11:691-706);(b)通過(guò)促細(xì)胞分裂劑激活的和/或釣依賴性蛋白激酶(CDPK;參見(jiàn)Xiong等，2002)和蛋白磷酸酶(Merlot等(2001)PlantJ.25:295-303;Tahtiharju和Palva(2001)PlantJ.26:461-470)的信號(hào)傳導(dǎo);(c)應(yīng)答應(yīng)力的脫落酸水平的提高，該應(yīng)力引發(fā)應(yīng)答的子集(Xiong等(2002)上文，并在此參考)；(d)作為信號(hào)分子的肌醇磷酸酶(至少對(duì)于應(yīng)力應(yīng)答性轉(zhuǎn)錄改變的子集(Xiong等(2001)GenesDev.15:1971-1984);(e)磷酸脂酶的激活，其隨后產(chǎn)生不同陣列的第二信使分子，其中一些可能調(diào)節(jié)應(yīng)力應(yīng)答性激酶的活性(ABA獨(dú)立性途徑中的磷酸脂酶D功能，F(xiàn)rank等(2000)PlantCell12:111-124;(f)胚胎發(fā)育后期豐富(LEA)型基因的誘導(dǎo)，包括CRT/DRE應(yīng)答性COR/RD基因(Xiong和Zhu(2002)上文)；(g)提高的抗氧化劑和相容性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸和可溶性糖的水平(Hasegawa等(2000)A畫(huà).Rev.Plant.Mol.Plant.Physiol.51:463-499);和(h)活性氧物質(zhì)如過(guò)氧化物，過(guò)氧化氫和羥基自由基的累積(Hasegawa等(2000)上文)。脫落酸生物合成在多個(gè)步驟受到滲透脅迫的調(diào)節(jié)。ABA-依賴性和-獨(dú)立性滲透脅迫信號(hào)首先在組成上修飾表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致早期應(yīng)答轉(zhuǎn)錄激活劑的表達(dá)，其然后激活下游脅迫耐受性效應(yīng)基因?；诶洌珊岛望}脅迫應(yīng)答的許多特征的共同性，可以推斷提高對(duì)冷或鹽脅迫耐受性的基因也可以提高干旱脅迫保護(hù)。實(shí)際上，對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子(在AtCBF/DRBl的情況中)和其他基因如OsCDPK7(Saijo等(2000)PlantJ.23:319-327)或AVP1(液泡焦磷酸酶-質(zhì)子-泵，Gaxiola等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:11444-11449)已經(jīng)證明了這種情況。產(chǎn)生耐脅迫植物是一種策略，其具有解決或調(diào)節(jié)這些問(wèn)題中至少一些的潛能。然而，用來(lái)產(chǎn)生呈現(xiàn)出耐ABS的新植物系的傳統(tǒng)植物育種策略相對(duì)無(wú)效，因?yàn)樗鼈兪侨唛L(zhǎng)而費(fèi)時(shí)的，且結(jié)果是不可預(yù)測(cè)的。此外，用于耐脅迫的有限種質(zhì)來(lái)源和關(guān)系遠(yuǎn)的植物物種之間的雜交不相容性代表了常規(guī)育種中遇到的顯著問(wèn)題。此外，導(dǎo)致ABS耐受性的細(xì)胞過(guò)程在性質(zhì)上是復(fù)雜的并涉及細(xì)胞適應(yīng)的多個(gè)機(jī)理和各種代謝途徑(4-7)。現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了針對(duì)給予轉(zhuǎn)基因作物非生物脅迫耐受性的遺4專工牙呈嘗試。Apse和Blumwald(CurrOpinBiotechnol.13:146-150,2002),Quesada等(PlantPhysiol.130:951-963,2002),Holmstrom等(Nature379:683-684,1996)，Xu等(PlantPhysiol110:249-257,1996),Pilon-Smits和Ebskamp(PlantPhysiol107:125-130,1995)和Tarczynski等(Science259:508-510，1993)的研究都嘗試了產(chǎn)生耐脅迫植物。此外，幾個(gè)U.S.專利和專利申請(qǐng)還描述了與耐脅迫相關(guān)的多核苷酸及其在產(chǎn)生耐脅迫植物中的用途。U.S.專利No.5,296,462和5,356，816描述了用編碼擬南芥(/4raZ)Wo;^^)冷適應(yīng)中涉及的蛋白質(zhì)的多核苦酸轉(zhuǎn)化植物，因此促進(jìn)轉(zhuǎn)化植物中的耐冷性。U.S.專利No.6,670,528描述了用編碼結(jié)合脅迫應(yīng)答性序列的多肽的多核普酸轉(zhuǎn)化植物，因此促進(jìn)轉(zhuǎn)化的植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。U.S.專利No.6,720,477描述了用編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫相關(guān)蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物，能夠提高轉(zhuǎn)化的植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。U.S.申請(qǐng)系列No.09/938842和10/342224描述了非生物脅迫相關(guān)的基因及其給予植物對(duì)非生物脅迫耐受性的用途。U.S.申請(qǐng)系列No.10/231035描述了植物中鉬輔因子硫化酶的超表達(dá)，因此提高它們對(duì)非生物脅迫的耐受性。盡管上述研究在產(chǎn)生耐脅迫植物中至少部分是成功的，但仍然需要可以用來(lái)產(chǎn)生耐各種非生物脅迫條件的植物的耐脅迫基因。同時(shí)簡(jiǎn)化本發(fā)明來(lái)實(shí)踐，本發(fā)明人已經(jīng)通過(guò)生物信息和實(shí)驗(yàn)室研究鑒定了幾個(gè)新的非生物脅迫耐受性基因，其可以用來(lái)提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/或生物量，活力和產(chǎn)量。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性的方法，所述方法包括在植物內(nèi)表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，該多肽具有與SEQIDNO:2，4,6,8,10,12,13-56，58-63,66-121，141-156或157至少90%同源的氨基酸序列，因此提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，非生物脅迫選自鹽度，缺水，低溫，高溫，重金屬毒性，缺氧，營(yíng)養(yǎng)不足，營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，大氣污染和UV照射。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了提高植物生物量，活力和/或產(chǎn)量的方法，所述方法包括在植物內(nèi)表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，該多肽具有與SEQIDNO:2,4,6,8,10,12,13-56,58-63,66-121,141-156或157至少90%同源的氨基酸序列，因此提高植物的生物量，活力和/或產(chǎn)量。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)表達(dá)(a)用外源多核苷酸轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞；(b)從細(xì)胞產(chǎn)生成熟植物；和(c)在適于在成熟植物內(nèi)表達(dá)外源多核普酸的條件下栽培成熟植物。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，通過(guò)將核酸構(gòu)建體引入植物細(xì)胞中來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，核酸構(gòu)建體包括外源多核普酸和至少一個(gè)能夠指導(dǎo)外源多核苷酸在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了核酸構(gòu)建體，其包括與選自SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,158，159,160，161，162-204,206-211，214-287的核苷酸序列至少90%相同的核酸序列和能夠指導(dǎo)核酸序列在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，組成型啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，組成型啟動(dòng)子是At6669啟動(dòng)子。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是非生物脅迫可i秀導(dǎo)啟動(dòng)子。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，植物細(xì)胞形成雙子葉植物細(xì)月包的一部分。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一特征，植物細(xì)胞形成單子葉植物細(xì)月包的一部分。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了分離的多肽，其包括與由選自SEQIDNO:1，3,5,7，9,11,158,159，160,161，162-204,206-211，214-287的多核苷酸編碼的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的再一特征，氨基酸序列與SEQIDNO:2,4,6,8,10,12,13-56，58-63,66-121，141-156或157至少90%同源。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了包括編碼多肽的外源多核苷酸的植物細(xì)胞，該多肽具有與SEQIDNO:2,4，6,8,10,12，13-56,58-63,66-121，141-156或157至少90%同源的氨基酸序列，因此提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的再一特征，植物細(xì)胞形成植物的一部分。通過(guò)提供利用新的耐非生物脅迫基因來(lái)提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/或生物量的方法，本發(fā)明成功地解決了目前已知構(gòu)造的缺點(diǎn)。除非另外限定，在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意思。盡管與在此所述的那些相似或等價(jià)的方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中，但以下描述了合適的方法和材料。在沖突的情況中，以專利說(shuō)明書(shū)，包括定義為準(zhǔn)。此外，材料，方法和實(shí)施例只是說(shuō)明性的并不是用來(lái)限制。附圖簡(jiǎn)述在此參照了本發(fā)明，但只是舉例來(lái)說(shuō)?，F(xiàn)在詳細(xì)地參照附圖，其強(qiáng)調(diào)了所示的特定內(nèi)容是舉例說(shuō)明并只是用于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明性討論的目的，并且是為了提供認(rèn)為是本發(fā)明的原理和概念方面的最有用和容易理解的描述而呈現(xiàn)的。在這點(diǎn)上，沒(méi)有進(jìn)行嘗試來(lái)顯示比本發(fā)明基礎(chǔ)性理解更詳細(xì)的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，對(duì)附圖進(jìn)行的描述使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚本發(fā)明的幾個(gè)形式在實(shí)踐中怎樣具體進(jìn)行。圖1是用來(lái)測(cè)量植物大小的方法簡(jiǎn)圖。使用均勻的光照度和設(shè)定恒定距離的三腳架來(lái)拍取數(shù)碼照片。使用"基于綠色的"濾器處理獲得的數(shù)碼照片，該濾器除去照片的"非綠色部分，，，只留下用于定量的植物玫瑰花結(jié)區(qū)域。玫瑰花結(jié)區(qū)域定量后，將結(jié)果輸出至表格處理軟件并使用統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)分析。圖2A-B是給予非生物脅迫耐受性基因(SEQID158)的代表性結(jié)果，該耐受性是根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)未揭示的。圖2A-將在非脅迫條件下生長(zhǎng)7-10天的植物轉(zhuǎn)移至高滲壓劑條件并使用數(shù)碼成像追蹤它們的生長(zhǎng)12天。顯示了在第0天，第5天和第12天拍取的照片的處理過(guò)的圖像。注意每個(gè)平板上部中心中的對(duì)照植物和對(duì)照植物周圍的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因情況。圖2B是描述了隨時(shí)間函數(shù)的植物生長(zhǎng)面積的圖，使用圖A物顯著生長(zhǎng)得快。結(jié)果的統(tǒng);十學(xué)分析顯示于以:下的表5中l(wèi)-5行。優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明是通過(guò)利用新的非生物脅迫耐受性基因提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/或生物量的方法以及呈現(xiàn)出提高的耐脅迫條件和/或提高的累積生物量能力的植物。參照附圖和附帶的描述可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)地解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，理解本發(fā)明不限于對(duì)以下描述中列出的或附圖中說(shuō)明的構(gòu)建體和成分排列的詳細(xì)內(nèi)容的應(yīng)用。本發(fā)明能夠是其他實(shí)施方案或以各種方式實(shí)施或進(jìn)行。此外，理解在此所用的措辭和術(shù)語(yǔ)是用于描述的目的并且不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是限制。同時(shí)簡(jiǎn)化本發(fā)明來(lái)實(shí)踐，本發(fā)明人同時(shí)使用生物信息技術(shù)，鑒定了編碼推定的非生物脅迫耐受性(ABST)蛋白的多核苷酸序列(實(shí)施例1)。分離選定的序列(實(shí)施例2)，克隆至表達(dá)載體中(實(shí)施例3-4)并引入擬南芥植物中(實(shí)施例5-6)。將這些植物生長(zhǎng)于鹽度脅迫條件下，或正常條件下，并檢測(cè)與沒(méi)有攜帶外源ABST基因的相似對(duì)照植物相比較提高的生物量。如從實(shí)施例8中所示的結(jié)果可明顯看出的，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)選擇的核酸序列顯示出與對(duì)照植物相比較能提高用其轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/或植物生物量的方法。該方法包括在植物內(nèi)表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，該多肽具有與SEQIDNO:2,4,6,8，10,12,13-56,58-63,66-121,141-156或157至少90%同源的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明這方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所示的分離多核苷酸是SEQIDNO:1，3,5,7,9,11,158,159,160,161，162-204,206-211,214-287?；蛘?，本發(fā)明的外源多核苷酸編碼具有如下進(jìn)一步所述的氨基酸序列的多肽。與選自SEQIDNO:2,4，6,8,10,12,13-56，58-63,66-121,141-156或157的氨基酸序列至少約70%,至少約75%,約80%,至少約81%,至少約82%,至少約83%,至少約84%,約85%,至少約86%,至少約87%，至少約88%,至少約89%,約90%,至少約91%,至少約92%,至少約93%，至少約93%,約94%,至少約95%,至少約96%,至少約97%,至少約98%,約99%,或更高即100%同源。在此所用的短語(yǔ)"非生物脅迫"指的是對(duì)植物的代謝，生長(zhǎng)，再生和/或生活力的任何不利影響。因此，可以通過(guò)次佳環(huán)境生長(zhǎng)條件，例如，鹽度，缺水，洪水，冷凍，低或高溫，重金屬毒性，缺氧，營(yíng)養(yǎng)不足，大氣污染或UV照射，來(lái)誘導(dǎo)非生物脅迫。在背景部分中討論了非生物脅迫的意義。如在此所用的短語(yǔ)"非生物脅迫耐受性，，指的是植物承受非生物脅迫而代謝，生長(zhǎng)，生產(chǎn)力和/或生活力沒(méi)有遭受實(shí)質(zhì)性改變的能力。優(yōu)選，本發(fā)明的遺傳工程化植物呈現(xiàn)出比非轉(zhuǎn)基因植物至少高約2%,高5%,高10%,高20%,高30%，高40%,高50%，高60%，高70%,高80%,高90%或甚至更高的耐受性。如在此所用的，術(shù)語(yǔ)"外源多核普酸"指的是不是在植物內(nèi)天然表達(dá)的但以穩(wěn)定或瞬時(shí)的方式引入植物中時(shí)產(chǎn)生至少一個(gè)多肽產(chǎn)物的核酸序列?？梢允褂萌魏瓮葱员容^軟件測(cè)定同源性(例如，百分比同源性),軟件包括例如國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BlastP軟件，如使用缺省參數(shù)?？梢允褂萌魏瓮葱员?交軟件測(cè)定同一性(例如，百分比同源性),軟件包括例如國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BlastP軟件，如使用少少少少缺省參數(shù)。本發(fā)明的多核苷酸指的是分離的單鏈或雙鏈核酸序列，并以RNA序列，互補(bǔ)多核苷酸序列(cDNA),基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合的多核苷酸序列(例如，以上的組合)的形式提供。如在此所用的，短語(yǔ)"互補(bǔ)多核苦酸序列"指的是使用逆轉(zhuǎn)錄酶或任何其他RNA依賴性DNA聚合酶從信使RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的序列。隨后可以使用DNA依賴性DNA聚合酶在體內(nèi)或在體外擴(kuò)增這樣序列。如在此所用的，短語(yǔ)"基因組多核苷酸序列"指的是源自(分離自)染色體的序列，并因此表示染色體的鄰接部分。如在此所用的，短語(yǔ)"復(fù)合的多核苦酸序列"指的是至少部分互補(bǔ)和至少部分基因組的序列。復(fù)合序列可以包括編碼本發(fā)明的多肽需要的一些外顯子序列，以及插入其中的一些內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列可以是任何來(lái)源的，包括其他基因，通常將包括保守的剪接信號(hào)序列。這樣的內(nèi)含子序列可以進(jìn)一步包括順式作用的表達(dá)調(diào)控序列。可以將本發(fā)明多核苷酸的核酸序列最佳化來(lái)用于表達(dá)。在SEQIDNO:158,159,160和161中提供了這樣的最佳化序列。這樣序列修飾的實(shí)例包括，但不限于，改變G/C含量至更接近目標(biāo)植物物種中通常發(fā)現(xiàn)的，和除去通常在植物物種中發(fā)現(xiàn)的密碼子，通常稱為密碼子最佳化。短語(yǔ)"密碼子最佳化"指的是選擇合適的DNA核苷酸用于接近目標(biāo)植物內(nèi)密碼子使用的結(jié)構(gòu)基因或其片段內(nèi)。因此，最佳化的基因或核酸序列指的是為了利用植物內(nèi)統(tǒng)計(jì)學(xué)上優(yōu)選或統(tǒng)計(jì)學(xué)上偏好的密碼子已經(jīng)將其中天然或天然產(chǎn)生的基因的核苷酸序列進(jìn)行了修飾的基因。通常在DNA水平檢測(cè)核苦酸序列并使用合適的方法測(cè)定植物物種中為了表達(dá)最佳化的編碼片段，這些方法如Sardana等(1996,PlantCellReports":677-681)中所述的。在該方法中，可以計(jì)算密碼子使用的標(biāo)準(zhǔn)偏差，密碼子偏好的一種測(cè)量，首先發(fā)現(xiàn)天然基因每個(gè)密碼子的使用相對(duì)于高表達(dá)的植物基因的比例方差，接著計(jì)算均方差。所用的公式是1SDCU=n=lN[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn指的是高表達(dá)植物基因中的密碼子使用頻率n,其中Yn指的是目標(biāo)基因中的密碼子使用頻率n,N指的是目標(biāo)基因中的密碼子總數(shù)。使用Murray等的數(shù)據(jù)(1989,NucAcidRes.17:477-498)編輯了雙子葉植物的高表達(dá)基因的密碼子使用表。根據(jù)特定植物細(xì)胞類型的優(yōu)選密碼子使用最佳化核酸序列的一種方法是基于密碼子最佳化表的直接使用，沒(méi)有進(jìn)行任何額外的統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，密碼子最佳化表如通過(guò)日本的NIAS(農(nóng)業(yè)生物科學(xué)研究所)DNA庫(kù)在密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)在線提供的那些(http:〃www.kazusa.or.jp/condon/)。密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)含有用于各種不同物種的密碼子使用表，已經(jīng)基于Genbank中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上測(cè)定了每個(gè)密碼子使用表。使用以上的表來(lái)測(cè)定特定物種(例如，水稻)中每個(gè)氨基酸的最優(yōu)選或最偏好的密碼子，編碼目標(biāo)蛋白的天然產(chǎn)生的核苷酸序列對(duì)于該特定植物物種是密碼子最佳化的。用關(guān)于氨基酸在統(tǒng)計(jì)學(xué)上更偏好的相應(yīng)密碼子替代特定物種基因組中具有低統(tǒng)計(jì)學(xué)發(fā)生率的密碼子來(lái)實(shí)現(xiàn)這。然而，可以選擇一個(gè)或多個(gè)不太偏好的密碼子來(lái)刪除現(xiàn)有的限制位點(diǎn)，以在潛在有用的連接處形成新的限制位點(diǎn)(5，和3'端至添加信號(hào)肽或終止盒，可以用來(lái)切割或剪接片段來(lái)產(chǎn)生正確的全長(zhǎng)序列的內(nèi)部位點(diǎn))，或消除負(fù)面影響mRNA穩(wěn)定性或表達(dá)的核苷酸序列。在任何修飾之前，天然產(chǎn)生的編碼核苷酸序列可能已經(jīng)含有多個(gè)對(duì)應(yīng)于特定植物物種中統(tǒng)計(jì)學(xué)上偏好的密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子最佳化可以包括測(cè)定天然核苷酸序列內(nèi)哪個(gè)密碼子對(duì)于特定的植物不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上偏好的，并根據(jù)特定植物的密碼子使用表改變這些密碼子來(lái)產(chǎn)生密碼子最佳化的衍生物。改變的核苷酸序列對(duì)于植物密碼子使用可以是全部或部分最佳化的，只要以高于相應(yīng)天然產(chǎn)生的或天然的基因編碼的蛋白質(zhì)的水平產(chǎn)生由改變的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。通過(guò)改變密碼子使用構(gòu)建合成基因描述于例如PCT專利申請(qǐng)93/07278中。因此，本發(fā)明包括以上所述的核酸序列；其片段，與其雜交的序列，與其同源的序列，編碼具有不同密碼子使用的相似多肽的序列，特征在于突變的改變序列，突變?nèi)缫粋€(gè)或多個(gè)核苷酸的刪除，插入或置換，天然產(chǎn)生的或人工誘導(dǎo)的，隨機(jī)或以有目標(biāo)的方式。上述的多核普酸還編碼之前未表征過(guò)的多肽。因此，本發(fā)明提供了具有如下進(jìn)一步所述的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與選自SEQIDNO:2,4，6，8,10,12,13-56,58-63,66-121,141-156或157的氨基酸序列至少約70%,至少約75%,至少約80%，至少約81%,至少約82%,至少約83%,至少約84%,至少約85%,至少約86%,至少約87%，至少約88%,至少約89%,至少約90%,至少約91%,至少約92%,至少約93%,至少約93%,至少約94%,至少約95%,至少約96%,至少約97%,至少約98%,至少約99%,或更高即100%同源。本發(fā)明還包括上述多肽和具有突變的多肽的片段，突變?nèi)缫粋€(gè)或多個(gè)氨基酸的刪除，插入或置換，天然產(chǎn)生的或人工誘導(dǎo)的，隨機(jī)或以有目標(biāo)的方式。使用本發(fā)明方法的合適植物可以是任何單子葉或雙子葉植物，包括但不限于，玉米，小麥，大麥，黑麥，燕麥，水稻，大豆，花生，豌豆，扁豆和苜蓿，棉花，油菜，雙低油菜(canola),胡椒，向日葵，土豆，煙草，番茄，茄子，桉樹(shù)，喬木，觀賞植物，多年生禾草和飼料作物。可以通過(guò)用外源多核苷酸轉(zhuǎn)化一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞，接著從轉(zhuǎn)化優(yōu)選，通過(guò)將核酸構(gòu)建體引入植物細(xì)胞中來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，該構(gòu)建體包括本發(fā)明的外源多核苷酸和至少一個(gè)能夠指導(dǎo)外源多核苷酸在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。下文中提供了合適的轉(zhuǎn)化方法的更詳細(xì)內(nèi)容。如在此所用的，術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"指的是位于基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)上游的DNA片I殳，RNA聚合酶結(jié)合該轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)來(lái)啟動(dòng)RNA的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子控制在哪里(例如，植物的哪個(gè)部分，動(dòng)物內(nèi)的哪個(gè)器官等)和/或在什么時(shí)候(例如，生物體生命周期中的哪個(gè)階段或條件)來(lái)表達(dá)基因?？梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體來(lái)使用任何合適的啟動(dòng)子序列。優(yōu)選，啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，組織特異性的，或非生物脅迫-可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。合適的組成型啟動(dòng)子包括，例如，CaMV35S啟動(dòng)子(SEQIDNO:122;Odell等，Nature313:810-812,1985);擬南芥At6669啟動(dòng)子(SEQIDNO:123;專利NoWO2004/104162);玉米Ubi1(Christensen等，PlantSol.Biol.18:675-689，1992);水稻月幾動(dòng)蛋白(McElroy等,PlantCell2:163-171,1990);pRMU(Last等，Theor.Appl.Genet81:581-588,1991);和SyntheticSuperMAS(Ni等，ThePlantJournal7:661-76,1995)。其它組成型啟動(dòng)子包括U.S.專利No.5,659,026,5,608,149;5,608,144;5,604,121;5,569,597;5,466,785;5,399,680;5,268,463;和5,608,142。合適的組織特異性啟動(dòng)子包括，但不限于，葉子特異性啟動(dòng)子，如例如以下所述的，Yamamoto等，PlantJ.12:255-265,1997;Kwon等，PlantPhysiol.105:357-67，1994;Yamamoto等，PlantCellPhysiol.35:773-778,1994;Gotor等,PlantJ.3:509-18,1993;Orozco等，PlantMol.Biol.23:1129-1138,1993;和Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:9586-9590,1993。合適的非生物脅迫可誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括，但不限于，鹽可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如RD29A(Yamaguchi-Shi謹(jǐn)alei等，Mol.Gen.Genet.236:331-340，1993);干旱可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如玉米rabl7基因啟動(dòng)子(Pla等，PlantMol.Biol.21:259-266,1993),玉米rab28基因啟動(dòng)子(Busk等，PlantJ.11:1285-1295,1999);和玉米Ivr2基因啟動(dòng)子(Pelleschi等，PlantMol.Biol.39:373-380，1999);和熱可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如來(lái)自番茄的熱番茄hsp80-啟動(dòng)子(U.S.專利No.5,187,267)。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體優(yōu)選進(jìn)一步包括合適的選擇標(biāo)記和/或復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選，所用的核酸構(gòu)建體是穿梭載體，其可以在大腸桿菌(五.co/0(其中構(gòu)建體包括合適的選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn))中繁殖，并與細(xì)胞中的繁殖相容。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可以是，例如，質(zhì)粒，bacmid,噬粒，粘粒，嗟菌體，病毒或人造染色體?？梢允褂帽景l(fā)明的核酸構(gòu)建體來(lái)穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中，將本發(fā)明的外源多核苷酸整合至植物基因組中，因此表示穩(wěn)定且遺傳的特征。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化中，通過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)外源多核苷酸，但是沒(méi)有整合至基因組中，因此表示瞬時(shí)的特征。存在多種將外源基因引入單子葉和雙子葉植物中的方法(Potrykus,I.,A腿.Rev.Plant.Physiol.,Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225;Shimamoto等，Nature(1989)338:274-276)。使外源DNA穩(wěn)定整合至植物基因組DNA中的原理方法包括兩個(gè)主要的手段(i)農(nóng)桿菌"—aC謂)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移Klee等(1987)A畫(huà).Rev.Plant.Physiol.38:467-486;Klee和Rogers,在CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlant(植物的細(xì)胞培養(yǎng)和體細(xì)胞遺傳學(xué))，Vol.6,MolecularBiologyofPlantNuclearGenes(才直物核基因的分子生物學(xué))，編輯Schell，J.，和Vasil,LK.，AcademicPublishers,SanDiego，Calif.(1989)p.2曙25;Gatenby,在PlantBiotechnology(植物生物技術(shù)),編輯Kung,S.和Arntzen，C.J.,ButterworthPublishers,Boston,Mass(1989)p.93-112。(ii)直接DNA吸收Paszkowski等，在CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants(植物的細(xì)胞培養(yǎng)和體細(xì)胞遺傳學(xué))，Vol.6,MolecularBiologyofPlantNuclearGenes(植物核基因的分子生物學(xué))，編輯Schell,J.,和Vasil,L.K.,AcademicPublishers,SanDiego，Calif.(1989)p.52-68;包括DNA直接吸收至原生質(zhì)體中的方法，Toriyama,K.等(1988)Bio/Technology6:1072-1074。通過(guò)植物細(xì)胞的簡(jiǎn)短電轟擊誘導(dǎo)的DNA吸收Z(yǔ)hang等，PlantCellRep.(1988)7:739-384。Fromm等，Nature(1986)319:791-793。通過(guò)顆粒轟擊將DNA注射至植物細(xì)胞或組織中，Klein等，Bio/Technology(1988)6:559-563;McCade等，Bio/Technology(1988)6:923-926;Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209;使用微量吸移管泉統(tǒng)Neuhaus等,Theor.Appl.Gene"1987)75:30-36;Neuhaus和Spangenberg,Physiol.Plant.(1990)79:213-217;細(xì)胞培養(yǎng)物，胚胎或愈傷組織的玻璃纖維或碳化硅晶須轉(zhuǎn)化，U.S.專利No.5464765或用發(fā)芽的花粉直接孵育DNA,DeWet等，在ExperimentalManipulationofOvuleTissue(胚珠組織的實(shí)驗(yàn)操作)，編輯Chapman,G.P.和Mantell,S.H.和Daniels,W.Longman,London(1985)p.197-209;和Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。農(nóng)桿菌系統(tǒng)包括使用質(zhì)粒載體，該載體含有整合至植物基因組DNA中的限定DNA片段。接種植物組織的方法根據(jù)植物物種和農(nóng)桿菌傳送系統(tǒng)而不同。廣泛使用的方法是葉圓盤(pán)方法，可以使用提供啟動(dòng)整個(gè)植物分化良好來(lái)源的任何組織外植體來(lái)進(jìn)行該方法。Horsch等，在PlantMolecularBiologyManualA5(植物分子生物學(xué)手冊(cè)A5),KluwerAcademicPublishers,Dordrecht(1988)p.1-9。補(bǔ)充方法使用農(nóng)桿菌傳送系統(tǒng)結(jié)合真空侵入。農(nóng)桿菌系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的形成中特別可行。存在多種將DNA直接轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中的方法。在電穿孔中，將原生質(zhì)體簡(jiǎn)短暴露于強(qiáng)烈的電場(chǎng)。在微注射中，使用非常小的微量吸移管將DNA直接機(jī)械注射至細(xì)胞中。在微粒轟擊中，將DNA吸收在微粒上，如硫酸鎂晶體或鴒顆粒，并將微粒在物理上加速至細(xì)胞或植物組織中。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，實(shí)施植物繁殖。植物繁殖的最常見(jiàn)方法是通過(guò)播種。然而，通過(guò)種子繁殖的再生具有由于雜合性引起的缺陷，作物缺少均一性，因?yàn)榉N子是由根據(jù)孟德?tīng)栆?guī)律控制的遺傳方差的植物產(chǎn)生的。基本上，每個(gè)種子在遺傳上是不同的，并且每個(gè)將具有其自身特定的性狀而生長(zhǎng)。因此，優(yōu)選可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物，使得再生的植物具有相同的性狀和親本轉(zhuǎn)基因植物的特征。因此，優(yōu)選可以通過(guò)提供轉(zhuǎn)化植物快速，一致再生的微繁殖來(lái)再生轉(zhuǎn)化的植物。微繁殖是從已經(jīng)從選定的親本植物或栽培植物切除的單片組織生長(zhǎng)新一代植物的過(guò)程。該過(guò)程允許具有表達(dá)融合蛋白的優(yōu)選組織的植物大量繁殖。產(chǎn)生的新一代植物在遺傳上與最初的植物相同，并具有最初植物的全部特征。微繁殖允許優(yōu)質(zhì)植物材料在短期內(nèi)大量產(chǎn)生并使選定的栽培植物快速繁殖并保持最初轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化植物的特征?？寺≈参锏膬?yōu)勢(shì)是植物繁殖的速度以及所產(chǎn)生的植物的質(zhì)量和均一性。微繁殖是需要在階段中間改變培養(yǎng)基或生長(zhǎng)條件的多步驟方法。因此，微繁殖方法涉及四個(gè)基本的階段階段一，最初的組織培養(yǎng)；階l殳二，組織培養(yǎng)繁殖；階段三，分化和植物形成；和階段四，溫室培養(yǎng)和加固。在階段一的過(guò)程中，最初的組織培養(yǎng)，建立組織培養(yǎng)并證實(shí)是無(wú)污染的。在階段二的過(guò)程中，繁殖最初的組織培養(yǎng)直至產(chǎn)生足量的組織樣品來(lái)滿足生產(chǎn)目的。在階段三的過(guò)程中，分裂在階段二中生長(zhǎng)的組織樣品并生長(zhǎng)成單個(gè)的植物幼苗。在階段四，將轉(zhuǎn)化的植物幼苗轉(zhuǎn)移至用于固化的溫室，在那里逐漸提高植物對(duì)光的耐受性，使得可以將其生長(zhǎng)于自然環(huán)境中。優(yōu)選，進(jìn)一步選擇如上所述產(chǎn)生的成熟轉(zhuǎn)化植物的非生物脅迫耐受性。因此，將轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化的(野生型)植物暴露于非生物脅迫條件，如缺水，次佳溫度，營(yíng)養(yǎng)不足，或優(yōu)選鹽脅迫條件?？梢砸愿鞣N方式來(lái)實(shí)現(xiàn)鹽脅迫，如例如，用高滲溶液灌溉植物，在高滲生長(zhǎng)溶液(例如，Hoagland溶液)中通過(guò)水栽來(lái)栽培植物，或在高滲生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，MS培養(yǎng)基)中培養(yǎng)植物。因?yàn)椴煌闹参飳?duì)鹽度的耐受性非常不同，因此優(yōu)選根據(jù)特定植物栽培品種或變種的特定特征來(lái)調(diào)節(jié)灌溉水，生長(zhǎng)溶液或生常培養(yǎng)基中的鹽濃度，使得對(duì)植物的生理和/或形態(tài)產(chǎn)生溫和或適度的影響(關(guān)于合適濃度的指導(dǎo)請(qǐng)參見(jiàn)，Bernstein和Kafkafi,RootGrowthUnderSalinityStress(鹽度脅迫下的才艮部生長(zhǎng))，在PlantsRoots,TheHiddenHalf(植物根部，隱藏的一半)，第3版，WaiselY,EshelA和KafkafiU(編輯)，MarcelDekkerInc.,NewYork,2002,和其中的參考文獻(xiàn))。暴露于脅迫條件后，經(jīng)常監(jiān)控植物直至野生型植物中出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性的生理和/或形態(tài)影響。隨后，將沒(méi)有呈現(xiàn)出實(shí)質(zhì)性生理和/或形態(tài)影響的轉(zhuǎn)化植物或呈現(xiàn)出生物量高于野生型植物的轉(zhuǎn)化植物鑒定為非生物脅迫耐受性植物。盡管目前優(yōu)選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化，但本發(fā)明也設(shè)想了葉細(xì)胞，分生細(xì)胞或完整植物的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化?？梢酝ㄟ^(guò)上述的任一種直接DNA轉(zhuǎn)移方法或使用修飾的植物病毒的病毒感染來(lái)實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。已經(jīng)顯示出對(duì)植物宿主的轉(zhuǎn)化有用的病毒包括CaMV,TMV和BV。使用植物病毒的植物轉(zhuǎn)化描述于U.S.專利No.4,855,237(BGV)，EP-A67,553(TMV),日本公開(kāi)申請(qǐng)No.63-14693(TMV),EPA194,809(BV),EPA278,667(BV);和Gluzman,Y.等，CommunicationinMolecularBiology:ViralVectors(分子生物學(xué)中的信息傳遞病毒載體)，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,pp.172-189(1988)。用于在許多宿主包括植物中表達(dá)外源DNA的假病毒描述于WO87/06261中。優(yōu)選，本發(fā)明的病毒是無(wú)毒力的，因此不會(huì)引起嚴(yán)重的癥狀，如降低的生長(zhǎng)率，花葉病，環(huán)斑病，巻葉病，黃化病，條紋病，形成痘，形成胂瘤和斑點(diǎn)狀腐蝕。合適的無(wú)毒力病毒可以是天然產(chǎn)生的無(wú)毒力病毒或人造的減毒病毒?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)病毒減毒，包括^旦不限于，亞致死的熱處理，化學(xué)處理或定向"i秀變纟支術(shù)，如所述的，例如，Kurihara和Watanabe(MolecularPlantPathology4:259-269,2003),Gal-on等(1992),Atreya等(1992)和Huet等(1994)。可以從可用的來(lái)源如例如美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)或從感染的植物分離來(lái)獲得合適的病毒抹。可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)從感染的植物組織分離病毒，如所述的，例如Foster和Tatlor編輯，"PlantVirologyProtocols:FromVirusIsolationtoTransgenicResistance(植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)方案從病毒分離至轉(zhuǎn)基因抗性)(MethodsinMolecularBiology(HumanaPr),Vol81)",HumanaPress,1998。簡(jiǎn)而言之，認(rèn)為受感染植物的組織含有高濃度的合適病毒，優(yōu)選幼葉和花瓣，在緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖溶液)中研磨來(lái)產(chǎn)生病毒感染的漿液，其可以用于隨后的接種中。通過(guò)上述參考文獻(xiàn)以及Dawson,W.O.等，Virology(1989)172:285-292;Takamatsu等,EMBOJ.(1987)6:307-311;French等,Science(1986)231:1294-1297;和Takamatsu等，F(xiàn)EBSLetters(1990)269:73-76證明了用于植物中引入和表達(dá)非病毒外源多核苷酸序列的植物RNA病毒的構(gòu)建。當(dāng)病毒是DNA病毒時(shí)，可以對(duì)病毒自身進(jìn)行合適的修飾?；蛘撸紫葘⒉《究寺≈良?xì)菌質(zhì)粒中，為了易于使用外源DNA構(gòu)建所需的病毒載體。然后從質(zhì)粒切除病毒。如果病毒是DNA病毒，可以將細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)連接病毒DNA,然后通過(guò)細(xì)菌來(lái)復(fù)制。該DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯將產(chǎn)生外殼蛋白，其將包裹病毒DNA。如果病毒是RNA病毒，通常將病毒克隆為cDNA并插入質(zhì)粒中。然后使用質(zhì)粒來(lái)制備所有的構(gòu)建。然后通過(guò)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的病毒序列來(lái)產(chǎn)生RNA病毒，并且病毒基因的翻譯產(chǎn)生包裹病毒RNA的外殼蛋白。通過(guò)以上的參考文獻(xiàn)以及U.S.專利No.5,316,931證明了用于植物中引入和表達(dá)非病毒外源多核苷酸序列如本發(fā)明構(gòu)建體中包括的那些的植物RNA病毒的構(gòu)建。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了植物病毒多核苷酸，其中已經(jīng)從病毒多核苷酸刪除了天然外殼蛋白編碼序列，插入了非天然植物病毒外殼序列和非天然啟動(dòng)子，優(yōu)選非天然外殼蛋白編碼序列的亞基因啟動(dòng)子，能夠在植物宿主中表達(dá)，包裝重組植物病毒多核普酸，并確保通過(guò)重組植物病毒多核苷酸的宿主系統(tǒng)感染。或者，可以通過(guò)在其內(nèi)插入非天然多核香酸序列使外殼蛋白基因失活，使得產(chǎn)生蛋白。重組植物病毒多核苷酸可以含有一個(gè)或多個(gè)其他的非天然亞基因啟動(dòng)子。每個(gè)非天然亞基因啟動(dòng)子能夠在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)鄰接的基因或多核苷酸序列，并且不能相互重組或與天然亞基因啟動(dòng)子重組。如果包括多于一個(gè)的多核普酸序列，可以鄰接天然植物病毒亞基因啟動(dòng)子或天然和非天然植物病毒亞基因啟動(dòng)子插入非天然(外源)多核苷酸序列。非天然多核苷酸序列在亞基因啟動(dòng)子的控制下可以在宿主植物中得到轉(zhuǎn)錄或表達(dá)以產(chǎn)生所需的產(chǎn)物。在第二個(gè)實(shí)施方案中，和第一個(gè)實(shí)施方案一樣提供了重組植物病毒多核苷酸，除了鄰接非天然外殼蛋白亞基因啟動(dòng)子放置天然外殼蛋白編碼序列，替代了非天然外殼蛋白編碼序列。在第三個(gè)實(shí)施方案中，提供了重組植物病毒多核香酸，其中天然外殼蛋白基因鄰接其亞基因啟動(dòng)子，并且已經(jīng)將一個(gè)或多個(gè)非天然亞基因啟動(dòng)子插入病毒多核苦酸中。插入的非天然亞基因啟動(dòng)子能夠在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)鄰接的基因，并且不能相互重組或與天然亞基因啟動(dòng)子重組。可以鄰接非天然亞基因植物病毒啟動(dòng)子插入非天然多核普酸序列，使得序列在亞基因啟動(dòng)子的控制下在宿主植物中得到轉(zhuǎn)錄或表達(dá)來(lái)產(chǎn)生所需的產(chǎn)物。在第四個(gè)實(shí)施方案中，和第三個(gè)實(shí)施方案一樣提供了重組植物病毒多核苦酸，除了由非天然外殼蛋白編碼序列替代天然的外殼蛋白編碼序列。通過(guò)由重組植物病毒多核香酸編碼的外殼蛋白包裹病毒載體，來(lái)產(chǎn)生重組植物病毒。使用重組植物病毒多核苦酸或重組植物病毒來(lái)感染合適的訴諸植物。重組植物病毒多核普酸能夠在宿主中復(fù)制，在宿主中全身傳播，并在宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)外源基因(外源多核苷酸)，來(lái)產(chǎn)生所需的蛋白。將病毒接種于植物的技術(shù)可以在以下找到，F(xiàn)oster和Tatlor編輯，"PlantVirologyProtocols:FromVirusIsolationtoTransgenicResistance(植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)方案從病毒分離至轉(zhuǎn)基因抗性)(MethodsinMolecularBiology(HumanaPr),Vol81)",HumanaPress,1998;Maramorosh和Koprowski編輯，"MethodsinVirology"(病毒學(xué)中的方法)，7vol,AcademicPress,NewYork1967-1984;Hill,S.A"MethodsinPlantVirology"(植物病毒學(xué)中的方法),Blackwell,Oxford,1984;Walkey，D.G.A."AppliedPlantVirology"(應(yīng)用植物病毒學(xué))，Wiley,NewYork,1985;以及Kado和Agrawa編輯，"PrinciplesandTechniquesinPlantVirology"(植物病毒學(xué)中的原理和技術(shù))，VanNostrand-Reinhold,NewYork。除了以上的，也可以將本發(fā)明的多核苷酸引入葉綠體基因組中，因此能夠葉綠體表達(dá)。將外源多核苷酸序列引入葉綠體的基因組的技術(shù)是已知的。該技術(shù)涉及以下的程序。首先，將植物細(xì)胞化學(xué)處理，使得將每個(gè)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目降低至約一個(gè)。然后，通過(guò)顆粒轟擊將外源多核苷酸引入細(xì)胞中，目的在于將至少一個(gè)外源多核苷酸分子引入葉綠體中。選擇外源多核普酸使其通過(guò)同源重組可整合至葉綠體的基因組中，這可以通過(guò)葉綠體內(nèi)在的酶容易地實(shí)現(xiàn)。為此，除了目標(biāo)基因，外源多核苷酸包括至少一個(gè)源自葉綠體基因組的多核苷酸片段。此外，外源多核普酸包括選擇標(biāo)記，其通過(guò)連續(xù)的選擇程序來(lái)起作用，以確定所有或基本上所有的葉綠體基因組拷貝在這樣的選擇后將包括外源多核苷酸。關(guān)于該技術(shù)的更多詳細(xì)內(nèi)容在U.S.專利No.4,945,050;和5,693,507中找到，在此將其引入作為參考。因此，可以通過(guò)葉綠體的蛋白表達(dá)系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生多肽，并變得整合至葉綠體內(nèi)膜中。因?yàn)橹参镏械姆巧锩{迫耐受性可以涉及多個(gè)累積或協(xié)同作用的基因(參見(jiàn)，例如，在Quesda等，PlantPhysiol.130:951-063,2002),本發(fā)明還設(shè)想在單個(gè)宿主植物中表達(dá)多個(gè)外源多核苷酸，因此獲得優(yōu)良的非生物脅迫耐受性?？梢酝ㄟ^(guò)將多個(gè)核酸構(gòu)建體共同引入單個(gè)植物細(xì)胞中來(lái)實(shí)現(xiàn)在單個(gè)宿主植物中表達(dá)多個(gè)外源多核苷酸，每個(gè)構(gòu)建體包括不同的外源多物。、口。、"、'、、、或者，可以將包括多個(gè)不同外源多核苷酸的單個(gè)核酸構(gòu)建體共同引入單個(gè)植物細(xì)胞中來(lái)實(shí)現(xiàn)在單個(gè)宿主植物中表達(dá)多個(gè)外源多核苷酸。可以用單個(gè)啟動(dòng)子序列來(lái)設(shè)計(jì)這樣的構(gòu)建體，該啟動(dòng)子序列可以轉(zhuǎn)錄多順?lè)醋有畔?，包括所有不同的外源多核苷酸序列。為了使由多順?lè)醋有畔⒕幋a的不同多肽能夠共同翻譯，可以通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列內(nèi)部連接多核苷酸序列，該內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)促進(jìn)置于IRES序列下游的多核苦酸序列的翻譯。在這種情況中，上述編碼不同多肽的轉(zhuǎn)錄的多順?lè)醋覴NA分子將從多順?lè)醋覴NA分子的加帽5'端和兩個(gè)內(nèi)部IRES序列開(kāi)始翻譯，因此在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生所有不同的多肽?；蛘?，構(gòu)建體可以包括幾個(gè)啟動(dòng)子序列，每個(gè)連接不同的外源多核苷酸序列。用包括多個(gè)不同外源多核苷酸的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以再生成成熟植物，使用上文中所述的方法?；蛘?，可以通過(guò)將包括不同外源多核苷酸的不同核酸構(gòu)建體引入多個(gè)植物中來(lái)實(shí)現(xiàn)在單個(gè)宿主植物中表達(dá)多個(gè)外源多核苷酸。然后使用常規(guī)植物育種技術(shù)，將再生的轉(zhuǎn)化植物雜交，并選擇所得到后代的優(yōu)良非生物脅迫耐受性和/或生物量性狀。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘园踩页杀拘实姆绞绞褂眯碌姆巧锩{迫耐受性基因來(lái)提高各種經(jīng)濟(jì)植物對(duì)非生物脅迫耐受性和/或生物量的方法。使植物接受各種環(huán)境挑戰(zhàn)。這些中的幾種，包括鹽脅迫，一般的滲透脅迫，千旱脅迫和冷凍脅迫，具有影響整個(gè)植物和細(xì)胞水可用性的能力。因而沒(méi)有出人意料，植物對(duì)這組脅迫的應(yīng)答是相關(guān)的。在最近的綜述中，Zhu注意到"對(duì)水脅迫信號(hào)的大部分研究聚焦于鹽脅迫，主要是因?yàn)橹参飳?duì)鹽和干旱的應(yīng)答是密切相關(guān)的并且是機(jī)制重疊的"(Zhu(2002)Ann.Rev.PlantBiol.53:247-273)。已經(jīng)證明了對(duì)該組脅迫的相似應(yīng)答和途徑的許多實(shí)例。例如，已經(jīng)表明CBF轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)節(jié)對(duì)鹽，冷凍和干旱的抵抗力(Kasuga等(1999)NatureBiotech.17:287-291)。應(yīng)答鹽和脫水脅迫誘導(dǎo)了擬南芥rd29B基因，這是很大程度上通過(guò)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程介導(dǎo)的過(guò)程(Uno等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:11632-11637),導(dǎo)致結(jié)合rd29B啟動(dòng)子內(nèi)上游序列的轉(zhuǎn)錄因子的活性改變。在水葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)(水花)中，Patharker和Cushman已經(jīng)表明通過(guò)暴露于干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)了鈣依賴性蛋白激酶(McCDPKl)(Patharker和Cushman(2000)PlantJ.24:679-691)。脅迫誘導(dǎo)的激酶還顯示出磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，大概改變了其活性，盡管目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答鹽或干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有改變。相似地，Saijo等證明了水稻鹽/干旱誘導(dǎo)的鉤調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(OsCDPK7)在超表達(dá)時(shí)給予了水稻提高的鹽和干旱耐受性(Saijo等(2000)PlantJ.23:319-327)。暴露于脫水在植物中引起了相似的存活策略，冷凍脅迫也是如此(參見(jiàn)，例如，Yelenosky(1989)PlantPhysiol89:444-451),并且干旱脅迫誘導(dǎo)了冷凍耐受性(參見(jiàn)，例如，Siminovitch等(1982)PlantPhysiol69:250-255;和Guy等(1992)Planta188:265-270)。除了冷適應(yīng)性蛋白的誘導(dǎo)，允許植物在低水條件下存活的策略包括，例如，降低的表面積，或表面油或蠟產(chǎn)生。將認(rèn)識(shí)到對(duì)一種脅迫的抵抗力中涉及的一些途徑(如上所述)，也將涉及對(duì)其他脅迫的抵抗力，受到相同或同源基因的調(diào)控。當(dāng)然，全部的抵抗途徑是相關(guān)的，不是相同的，因此不是所有控制對(duì)一種脅迫的抵抗力的基因?qū)⒖刂茖?duì)其他脅迫的抵抗力。盡管如此，如果基因調(diào)節(jié)對(duì)這些脅迫之一的抵抗力，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚測(cè)試對(duì)這些相關(guān)脅迫的抵抗力。以下的實(shí)施例部分進(jìn)一步提供了測(cè)定脅迫抵抗力的方法。本發(fā)明的多核苷酸序列能夠提高植物的生物量。將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的多肽提高植物產(chǎn)量/生物量/活力的能力是它們促進(jìn)植物細(xì)胞大小提高的能力固有的(如實(shí)施例8和圖2中所示的)。因此，本發(fā)明還設(shè)想提高植物生物量/活力/產(chǎn)量的方法(松柏類植物，莒蘚，藻類，單子葉植物或雙子葉植物，以及http:〃www.nationmaster.com/encyclopedia/Plantae中所歹'J的其4也才直物)。如在此所用的，短語(yǔ)"植物生物量"指的是從生長(zhǎng)季節(jié)中植物產(chǎn)生的組織量或質(zhì)量，其還可以決定或影響植物產(chǎn)量或每生長(zhǎng)面積的產(chǎn)量。如在此所用的，短語(yǔ)"植物活力"指的是從給定時(shí)間的植物產(chǎn)生的組織量或質(zhì)量。因此，提高活力將決定或影響植物產(chǎn)量或每生長(zhǎng)時(shí)間或生長(zhǎng)面積的產(chǎn)量。如在此所用的，短語(yǔ)"植物產(chǎn)量，，指的是作為植物產(chǎn)生的產(chǎn)物產(chǎn)生和收集的組織量或質(zhì)量。因此，提高產(chǎn)量將影響從特定生長(zhǎng)區(qū)域和/或特定生長(zhǎng)時(shí)間的植物獲得的經(jīng)濟(jì)效益。優(yōu)選，本發(fā)明的遺傳工程植物呈現(xiàn)出比非轉(zhuǎn)基因植物至少約高2%,高5%,高10%,高20%,高30%,高40%,高50%,高60%,高70%,高80%,高90%或甚至更高的生物量，活力和/或產(chǎn)量。測(cè)定植物活力，產(chǎn)量和生物量的方法是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)實(shí)施例10)。因此，本發(fā)明對(duì)于促進(jìn)商業(yè)所需作物的產(chǎn)量是高農(nóng)業(yè)價(jià)值的(例如，營(yíng)養(yǎng)體器官如白楊木質(zhì)部的生物量，或生殖器官的生物量，如種子的數(shù)量或種子生物量)。如在此所用的，術(shù)語(yǔ)"約"指的是±10%。其他目的，優(yōu)勢(shì)和新的特征。此外，如上所述以及如以下權(quán)利要求部分中所要求的本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施方案和方面在以下的實(shí)施例中找到了實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例現(xiàn)在參考以下的實(shí)施例，這些實(shí)施例和以上的描述一起以非限制性的方式說(shuō)明了本發(fā)明。通常，在此所用的術(shù)語(yǔ)和本發(fā)明中所用的實(shí)驗(yàn)方法包括分子，生化，微生物和重組DNA技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中得到了徹底的解釋。參見(jiàn)，例如，"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(分子克隆實(shí),瞼室手冊(cè))Sambrook等(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(分子生物學(xué)中的通用實(shí)驗(yàn)方案)，JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal，"APracticalGuidetoMolecularCloning"(分子克隆實(shí)踐指南)JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等"RecombinantDNA，，(重組DNA),ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等(編輯)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries"(基因組分析:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)系列)Vol.1-4,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);U.S.專利No.4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中所列的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"(細(xì)胞生物學(xué):實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，I畫(huà)III巻,Cellis,J.E.編輯(1994);"CurrentProtocolsinImmunology"(免疫學(xué)中的通用實(shí)驗(yàn)方案)I-III巻ColiganJ.E.編輯(1994);Stites等(編輯),"BasicandClinicalImmunology"(基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué))(第8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(編輯)，"SelectedMethodsinCellularImmunology"(細(xì)胞免疫學(xué)中選擇的方法)，W.H.Freeman和Co.,NewYork(1980);可用的免疫測(cè)試在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中有大量描述，參見(jiàn)，例如，U.S.專利No.3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996，345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011,771和5,281,521;"OligonucleotideSynthesis"(寡核苦酸合成)Gait，M.J.編輯，(1984);"NucleicAcidHybridization"(核酸雜交)H畫(huà)s,B.D.和HigginsS.J.編輯(1984);"AnimalCellCulture"(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))Freshney,R.L編輯(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes"(固定細(xì)胞和酶)IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning"(分子克隆實(shí)踐指南)Perbal,B.(1984)和"MethodsinEnzymology"(酶學(xué)中的方法)Vol.1-317,AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications"(PCR實(shí)驗(yàn)方案方法和應(yīng)用指南)，AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak等,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization—ALaboratoryCourseManual"(蛋白純化和表征的策略-實(shí)驗(yàn)室過(guò)程手冊(cè))CSHLPress(1996);將所有的引入作為參考，如同在此全部列出一樣。在該文件中提供了其他常規(guī)的參考文獻(xiàn)。認(rèn)為其中的方法是本領(lǐng)域公知的并給閱讀者提供了方便。除非另外指出，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意思。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可以使用與在此所述的那些相似或等價(jià)的方法和材料，但以下描述了合適的方法和材料。峑定^豸卓子^潛參的^定車i參身遠(yuǎn)耐f#差^按照屬于本發(fā)明專利受讓人的之前所述的WO2004/104162,在體內(nèi)鑒定并證實(shí)非脅迫耐受性(ABST)基因。從雙子葉植物鑒定各種ABS基因和由此編碼的多肽(各自為SEQIDNO.124-128和129-133)。在單子葉植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，玉米，高粱，水稻和大麥的NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)和TIGR(http:〃www.tigr.org)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)4亍直系同源(orthologous)序歹'j的歸選。使用LEADS軟件(Compugen)將表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)和cDNA序列成蔟和裝配，并與上述單子葉植物的TIGR(http:www.tigr.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較?？偟?，372,000個(gè)玉米EST的成簇形成41,990個(gè)簇，其中19,870個(gè)是單個(gè)的。在高粱中，約190,000個(gè)EST成簇成39,000個(gè)簇，而在大麥中，370,500個(gè)EST產(chǎn)生50,000個(gè)不同的簇，每個(gè)表示不同的基因。在水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)相似數(shù)量的序列和成簇的基因。根據(jù)包括簇的序列記錄中的所有關(guān)鍵部分編輯每個(gè)簇的數(shù)字表達(dá)特征概述。數(shù)字表達(dá)，也稱為電子RNA印跡，是基于形成基因簇的EST序列呈現(xiàn)出實(shí)際表達(dá)特征的工具。就植物解剖學(xué)(基因在哪個(gè)組織/器官中得到表達(dá))，發(fā)育階段(可以在哪個(gè)發(fā)育階段找到基因)和處理特征(提供在哪個(gè)生理?xiàng)l件下基因得到表達(dá)，如干旱，冷，病原體感染等)而言，該工具可以提供簇的表達(dá)特征。假定不同簇中EST的隨機(jī)分布，數(shù)據(jù)表達(dá)提供了概率值，該概率值描述了具有總NEST至含有來(lái)自特定文庫(kù)集合的XEST的簇的概率。對(duì)于概率計(jì)算，將考慮a)簇中的EST數(shù)量，b)涉及的和相關(guān)文庫(kù)的EST數(shù)量，c)表示物種的可獲得EST的全部數(shù)量。因此用來(lái)自表示特定表達(dá)的目標(biāo)文庫(kù)組的EST高度富集具有低概率值的簇。已經(jīng)將直系同源(orthology)和旁系同源(paralogy)的概念應(yīng)用于整個(gè)基因組比較規(guī)模上的功能表征和分類。直系同源物和旁系同源物構(gòu)成兩個(gè)主要類型的同源物第一個(gè)通過(guò)特化從共同的祖先演化而來(lái)，后者通過(guò)復(fù)制情況而相關(guān)。假定由老式的復(fù)制情況產(chǎn)生的旁系同源物很可能在功能上已經(jīng)分叉了，而真實(shí)的直系同源物隨著進(jìn)化的時(shí)間很可能保持相同的功能。為了進(jìn)一步研究和鑒定來(lái)自單子葉植物物種的ABST假定直系同源基因，結(jié)合了兩個(gè)計(jì)算方法(i)直系同源序列比對(duì)的方法-通過(guò)構(gòu)建覆蓋多個(gè)真核分類群的直系同源組，使用改進(jìn)的Markov簇算法將推定的直系同源物和旁系同源物分組。將這些推定的直系同源物依據(jù)系統(tǒng)演化樹(shù)來(lái)進(jìn)一步組織，系統(tǒng)演化樹(shù)是假定為基因系統(tǒng)發(fā)育估算的分支圖(樹(shù))。(ii)產(chǎn)生基因表達(dá)特征"數(shù)字表達(dá)"的方法-本發(fā)明人已經(jīng)針對(duì)annotating序列相當(dāng)多的工作。分析表達(dá)數(shù)據(jù)并使用俗語(yǔ)的固定詞匯如實(shí)驗(yàn)處理將EST文庫(kù)分類。通過(guò)比較它們?cè)诖刂械念l率與數(shù)據(jù)庫(kù)中的豐度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上分析來(lái)自所有成簇的EST對(duì)基因的注釋，允許構(gòu)建該基因的數(shù)字和圖像表達(dá)特征，將這稱為"數(shù)字表達(dá)"。使用這兩種互補(bǔ)方法的基本原理是基于真實(shí)的直系同源物很可能隨著進(jìn)化的時(shí)間保持相同功能的假設(shè)。這兩種方法(序列和表達(dá)沖莫式)對(duì)兩個(gè)同源基因之間的功能相似性提供了兩組不同的指示，序列水平的相似性-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中相同的氨基酸和表達(dá)特征的相似性。同時(shí)比較了來(lái)自單子葉植物的序列與番茄ABST基因，番茄基因及其來(lái)自單子葉植物的最佳直系同源基因之間的同源性水平顯著不同，為45%至88%。此外，單子葉植物基因的insilico表達(dá)特征通常與ABS耐受性中涉及的基因不匹配。因此，對(duì)每個(gè)番茄基因(SEQIDNO:124-133)的單子葉植物功能直系同源物進(jìn)行了廣泛的研究。嘗試鑒定番茄ABST基因的最佳直系同源物，進(jìn)行了兩組分析。首先，將5個(gè)番茄ABST基因的序列(SEQIDNO:124-128)及其推導(dǎo)出的多肽序列(SEQIDNO:129-133)與上述基因簇的DNA序列編碼的所有單子葉植物的推定蛋白相比較。在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行比較，沿著整個(gè)蛋白質(zhì)序列尋找高于45%的同一性。以下的表1顯示了最佳的同源基因及其與番茄ABST蛋白的同一性水平。接著，基于它們?cè)趲追N單子葉植物物種的發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式篩選源自不同單子葉植物物種(大麥，高粱和玉米)的這些單子葉植物蛋白。該篩選是基于基因的數(shù)字表達(dá)，如上所述。數(shù)字表達(dá)表示包括每個(gè)w7,co基因的EST的分布以及實(shí)際分布與隨才幾分布的偏差。基于三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)選擇了基因在根部具有較高表達(dá)的基因，根部和葉子和/或由表示土壤脅迫條件(干旱，鹽度，土壤貧瘠)的處理誘導(dǎo)的基因。只在高于2倍的情況中認(rèn)為是表達(dá)提高的(相對(duì)于隨機(jī)EST分布)，具有低于0.05顯著性概率時(shí)提高是明顯的。以下的表2概括了不同器官或組織中的基因表達(dá)特征，以及引起表達(dá)水平顯著升高的處理。表1:蕃茄ABST基因及其來(lái)自單子葉植物的同源基因之間的同源性水平<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>_42,爿55T^源/ww7/oi^的4迷掙在，如遞《五sr為、有的鍵#夢(mèng)為、浙摩4^的<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>無(wú)*-沒(méi)有一種具有數(shù)字表達(dá)顯著升高的處理可以認(rèn)為是土壤脅迫處理。如以上表1和表2中所述篩選的結(jié)合揭示了最后列出的五個(gè)單子葉植物基因被預(yù)測(cè)為與番茄ABST基因最相關(guān)(SEQIDNO.l，3,5,7,9)。使用載體NTI組(Info她x,U.K.)版本6(HastingSoftware,Inc:www.generunner.com/)分析選定的多核苷酸序列(以下的表3)的ORF存在。將這些多核苷酸序列每一個(gè)中鑒定的ORF與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)序列相比較，使用Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST);為了鑒定ATG起始密碼子，將呈現(xiàn)出與GenBank序列最高同源性的ORF作圖。然后將該ORF的ATG起始密碼子的位置與鑒定的多核苷酸序列的相比較，以便證實(shí)在此所述五個(gè)序列中的每一個(gè)都包括全長(zhǎng)ORF和ATG起始密碼子(因此獲得"推定的單子葉植物ABST基因，，的資格)。力<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*-在以下實(shí)施例2中進(jìn)一步描述。已經(jīng)使用BLAST軟件從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定具有與單子葉植物ABST基因顯著同源性的多肽(表4)。ABS同源物<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>一,定的卓f#趁參爿^sr差^通過(guò)GeneArt(http:〃www.geneart.com)合成單子葉植物ABST基因的DNA序列?；诰幋a的單子葉植物ABST基因的氨基酸序列(SEQIDN02,4,6,12)并使用從植物轉(zhuǎn)錄組計(jì)算的密碼子使用表(這樣的表實(shí)例可以在http:〃www.kazusa.orjp/condon/在線可獲得的密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)中找到)，insilico設(shè)計(jì)合成的DNA。以沒(méi)有將改變引入編碼的氨基酸序列的方式來(lái)設(shè)計(jì)最佳化的編碼序列，同時(shí)使用對(duì)于在雙子葉植物(主要是番茄和擬南芥)和單子葉植物如玉米中的表達(dá)是優(yōu)選的密碼子。與直系同源單子葉植物序列相比較，在序列中每20個(gè)核苷酸石咸基對(duì)引入至少一個(gè)沉默突變，以避免在單子葉植物物種如玉米中超表達(dá)基因時(shí)可能的沉默。將以下的限制酶位點(diǎn)加入最佳化的序列-5，端SalI，Xbal,BamHI，Smal，3，端Sacl。將供應(yīng)商(GeneArt,Gmbh)合成的序列在pCR-Script質(zhì)粒中克隆。所得到的序列是SEQIDNo.158，159,160，161;各自表示最初的單子葉植物ABSTSEQIDNo.1，3,5,11,如以上的表3中所述。^發(fā)推定的^忍^r差^用限制性核酸內(nèi)切酶Xbal和Sacl(Roche)消化帶有合成的，基于單子葉植物的ABST基因的PCRScript質(zhì)粒。使用凝膠提取試劑盒(Qiagen,Germany)純化所得到的片段，并使用T4DNA連接酶(Roche)連接成植物表達(dá)載體pKG(NOSter),(SEQIDNO138)，用相同的酶切除。pKG基因是基于PCRScript骨架，在多連接物位點(diǎn)具有幾個(gè)改變來(lái)促進(jìn)適于在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子下游和終止子上游的目標(biāo)基因的克隆。結(jié)果，插入的基因，可以與啟動(dòng)子和終止子一起容易地轉(zhuǎn)移至二元載體。將所得到的帶有推定單子葉植物ABST基因的pKG(NOSter)通過(guò)電穿孔引入大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中，使用MicroPulser電穿孔儀(Biorad),0.2cm比色皿(Biorad)和EC-2電穿孔程序(Biorad)。將處理過(guò)的細(xì)胞在LB液體培養(yǎng)基中37口培養(yǎng)lh,然后涂布于補(bǔ)充氨千青霉素(100mg/L)的LB瓊脂上并在37。C孵育16h。通過(guò)PCR分析在選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌落，使用SEQIDNO134和SEQIDNO135的引物，將其設(shè)計(jì)來(lái)橫跨pKG質(zhì)粒中插入的序列。將所得到的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上分離，將"PCR-陽(yáng)性"的菌落標(biāo)記并進(jìn)一步生長(zhǎng)。使用(Qiagen)分離來(lái)自陽(yáng)性菌落的DNA并使用ABI377測(cè)序儀(AmershamBiosciencesInc)測(cè)序來(lái)證實(shí)最后序列中突變的缺失。使用限制酶HindIII和Sail(Roche)在所有帶有推定單子葉植物ABST基因的pKG(NOSter)質(zhì)粒中插入At6669啟動(dòng)子序列(SEQIDNO:123所示)。通過(guò)PCR使用引物SEQIDNO:140和SEQIDNO:135分析克隆。如上所述鑒定，分離并測(cè)序陽(yáng)性質(zhì)粒。y32^6森推定的卓子^控參y^5T差厲和^于,動(dòng)岸襲迷的控參j動(dòng)f^二^4'傳y^i6括/^6669^^子的二元4'體為了切除表達(dá)盒，表達(dá)盒連接用相同的核酸內(nèi)切酶消化的pGI質(zhì)粒，用JIII和(Roche)消化四個(gè)pKG(At6669十NOSter)構(gòu)建體，這些構(gòu)建體帶有At6669啟動(dòng)子序列(SEQIDNO:123所示)下游和Nopaline合酶(NOS)終止子上游的推定單子葉植物ABST基因。總而言之，產(chǎn)生四個(gè)pGI構(gòu)建體，每個(gè)包括置于推定的單子葉植物ABST基因上游的At6669啟動(dòng)子，ABST基因具有SEQIDNO:1,3,5,ll中所示的序列。通過(guò)將源自pGL3基礎(chǔ)質(zhì)粒載體(Promega,AccNoU47295;bp4658-4811)的合成poly-(A)信號(hào)序列插入二元載體pB1101.3(Clontech,Acc.No.U12640)的限制位點(diǎn)中來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒pPI。在一些情況中，所用的骨架二元質(zhì)粒是pGI,其于pPI相似，但由GUS-內(nèi)含子基因體改GUS基因(Vancanneyt.G等，MGG220,245-50,1990)。通過(guò)PCR擴(kuò)增使用SEQIDNO:136和135中所示的引物從擬南芥varCol0基因組DNA分離At6669啟動(dòng)子。純化(Qiagen,Germany)并用限制性核酸內(nèi)切酶//mt/III和(Roche)消化PCR產(chǎn)物。將所得到的啟動(dòng)子序列引入用相同的酶消化的開(kāi)放二元pPI載體中，來(lái)產(chǎn)生pPI+At6669質(zhì)粒。^夢(mèng)^V^t^卓子^控浙爿B5T差^^二^4'^脊必?cái)M/^不勿^將以上實(shí)施例4中所述的每個(gè)二元載體用來(lái)轉(zhuǎn)染擬南芥細(xì)胞。將兩個(gè)其他的二元構(gòu)建體用作陰性對(duì)照，這兩個(gè)構(gòu)建體具有替代單子葉植物ABST基因(置于35S或At6669啟動(dòng)子的下游)的熒光素酶報(bào)告基因。通過(guò)電穿孑L將二元載體引入根癌農(nóng)桿菌(v4gra6""enwmmme/a"ew)GV301,或LB4404感受態(tài)細(xì)胞中(約l()9細(xì)胞/mL)。使用MicroPulser電穿孔儀(Biorad),0.2cm比色皿(Biorad)和EC-2電穿孔程序(Biorad)實(shí)現(xiàn)電穿孔。將處理過(guò)的細(xì)胞在LB液體培養(yǎng)基中28。C培養(yǎng)3h，然后涂布在補(bǔ)充慶大霉素(50mg/L;用于農(nóng)桿菌菌林GV301)或鏈霉素(300mg/L;用于農(nóng)桿菌菌林LB4404)的LB瓊脂上，在28。C48h。通過(guò)PCR4吏用SEQIDNO:134和135所示的引物分析在選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生的農(nóng)桿菌菌落，將引物設(shè)計(jì)來(lái)橫跨pPI質(zhì)粒中插入的序列。如以上實(shí)施例4中所述的將所得到的PCR產(chǎn)物分離并測(cè)序，來(lái)證實(shí)將正確的ABST序列適當(dāng)?shù)匾肓宿r(nóng)桿菌細(xì)胞中。^推定的卓f#控參Jfi5T差^脊必?cái)M/^^使用Clough和Bent(10)以及Desfeux等(11)所述的FloralDip方法轉(zhuǎn)化擬南芥哥倫比亞植物(To)植物，使用了較少的改進(jìn)。簡(jiǎn)而言之，將T。植物播種于250ml裝滿濕泥炭基生長(zhǎng)混合物的罐中。將罐覆蓋鋁箔和塑料圓頂，保持在4。C3-4天，然后取掉覆蓋物并在生長(zhǎng)室中在16/8h光/暗循環(huán)下18-24。C培養(yǎng)。在開(kāi)花前六天將To植物準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化。如以上實(shí)施例5中所述的產(chǎn)生攜帶二元構(gòu)建體的農(nóng)桿菌的單個(gè)菌落。將菌落在補(bǔ)充卡那霉素(50mg/L)和慶大霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在強(qiáng)烈振蕩下在28T:培養(yǎng)48h，然后在4000rpm離心5分鐘。將包括農(nóng)桿菌細(xì)胞的沉淀物重懸浮于在重蒸水中含有半強(qiáng)度(2.15g/L)Murashige-Skoog(Duchefa);0.44|liM千基氨基嘌呤(Sigma);112|tig/LB5Gambourg維生素(Sigma);5%蔗糖；和0.2ml/LSilwetL-77(OSISpecialists,CT)的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,pH為5.7。通過(guò)將每個(gè)植物顛倒至農(nóng)桿菌懸浮液中來(lái)實(shí)現(xiàn)To植物的轉(zhuǎn)化，使得將超出地面的植物組織浸漬3-5秒。將每個(gè)接過(guò)種的To植物立即放入塑料盤(pán)中，然后覆蓋干凈的塑料圓頂來(lái)維持濕度，并在室溫下保持黑暗18小時(shí)，來(lái)促進(jìn)感染和轉(zhuǎn)化。然后將轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)基因)植物取掉覆蓋物并轉(zhuǎn)移至溫室，用于恢復(fù)和成熟。將轉(zhuǎn)基因To植物在溫室中生長(zhǎng)3-5周直至長(zhǎng)角果變成褐色并干燥。從植物收集種子并保存在室溫直至播種。為了產(chǎn)生帶有基因的T!和丁2轉(zhuǎn)基因植物，通過(guò)浸泡在70%乙醇中1分鐘，接著浸泡在5%次氯酸鈉和0.05%曲通中5分鐘，將從轉(zhuǎn)基因T0植物收集的種子表面滅菌。將表面滅過(guò)菌的種子在無(wú)菌蒸餾水中徹底洗滌，然后置于含有半強(qiáng)度Murashige-Skoog(Duchefa);2%蔗糖；0.8%植物瓊脂；50mM卡那霉素和200mMcarbenicylin(Duchefa)的培養(yǎng)平板上。將培養(yǎng)平板在4。C培養(yǎng)48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至25。C的生長(zhǎng)室，持續(xù)再一周的培養(yǎng)。將活的T!擬南芥植物轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)平板中，持續(xù)另一周的培養(yǎng)。培養(yǎng)后，從培養(yǎng)平板移出T!植物并種植于250ml罐中含有的生長(zhǎng)混合物中。使轉(zhuǎn)基因植物在溫室中生長(zhǎng)至成熟。將從Tj植物收集的種子在用于培養(yǎng)和生長(zhǎng)T,植物的相同條件下培養(yǎng)并生長(zhǎng)至成熟，作為丁2植物。#蘭參^^務(wù)斧T^'潛W掙差^控參^發(fā)f對(duì)鹽度或滲透脅迫的耐受性的目的在于鑒定在高鹽，干旱或這些或其他環(huán)境脅迫的組合中給予更好的發(fā)芽，秧苗活力或生長(zhǎng)的基因。根據(jù)它們的發(fā)育階段，植物對(duì)鹽(NaCl)的耐受性是不同的，因此評(píng)價(jià)了種子發(fā)芽，秧苗活力和植物生長(zhǎng)應(yīng)答。通過(guò)取不同發(fā)育階段的植物并用遞增濃度的NaCl(例如，50mM,100mM,200mM,400mM)灌溉來(lái)進(jìn)行典型的鹽度耐受性測(cè)試。比較轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照植物在對(duì)照植物抑制濃度的外部表型外觀，萎蔫的程度，以及達(dá)到成熟和產(chǎn)生后代的整體成功。就之前情況而言，所測(cè)量的耐受性的定量參數(shù)是每個(gè)植物的平均濕重和干重，和所產(chǎn)生的種子重量，平均種子大小和所產(chǎn)生的種子數(shù)量。進(jìn)行滲透脅迫測(cè)試(包括NaCl和甘露醇測(cè)試)來(lái)測(cè)定滲透脅迫耐受性表型是否是NaCl特異性的或是否是一般的滲透脅迫相關(guān)的表型。植物對(duì)滲透脅迫的耐受性通常比對(duì)干旱，鹽度和冷凍條件的耐受性更高，因此就農(nóng)藝學(xué)性狀而言具有高度價(jià)值。用來(lái)測(cè)試植物提高的非生物脅迫耐受性的方法包括不利條件如高鹽度和高滲壓劑下的發(fā)芽和秧苗生長(zhǎng)的測(cè)試。發(fā)#^試-發(fā)芽測(cè)試比較來(lái)自能完成發(fā)芽過(guò)程(從種皮的胚根伸出和子葉的完全展開(kāi))的轉(zhuǎn)基因植物的種子百分比與來(lái)自以相似的方式處理的對(duì)照植物的種子百分比。在種植后對(duì)發(fā)芽和秧苗活力的評(píng)價(jià)進(jìn)行三周。為了測(cè)量發(fā)芽和秧苗生長(zhǎng)，將來(lái)自T2植物的種子表面滅菌并單個(gè)播種于正方的瓊脂平板上，該平板含有例如補(bǔ)充高鹽度(例如，50mM,100mM,200mM,400mM)或高滲壓劑(例如，50mM,100mM，200mM,400mM甘露醇)的固化基礎(chǔ)培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基是補(bǔ)充0.8%植物瓊脂作為固化劑的50。/。Mumshige-Skoog培養(yǎng)基(MS)+維生素。播種后，將平板在4。C轉(zhuǎn)移2-3天，用于層形成，然后生長(zhǎng)三周。為了跟蹤不利條件下的發(fā)芽和生長(zhǎng)，人工或自動(dòng)篩選平板，并測(cè)定植物大小。從每個(gè)構(gòu)建體分析五至十個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化情況。將表達(dá)來(lái)自本發(fā)明的基因的植物與相同條件下播種在相同平板上的對(duì)照植物相比較，或與所有構(gòu)建體，種子和播種情況的平均測(cè)量相比較。^#蘭7的脊差^趁參i《才法身遠(yuǎn)耐f#和為\^-使用秧苗進(jìn)行的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)按照植物對(duì)不利條件的耐受性。在卡那霉素的存在下(用于轉(zhuǎn)基因植物)或不存在下(用于野生型對(duì)照植物)，將表面滅過(guò)菌的種子播種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中[補(bǔ)充0.8%植物瓊脂作為固化劑的50%Murashige-Skoog培養(yǎng)基(MS)+維生素]。播種后，將平板在4。C轉(zhuǎn)移2-3天，用于層形成，然后在每日23-小時(shí)亮1-小時(shí)暗循環(huán)下在25。C生長(zhǎng)7至10天。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將隨機(jī)選擇的秧苗小心地轉(zhuǎn)移至含有高鹽度條件(150mM)或表示干旱過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的高滲透壓條件(210mM甘露醇)的平板。植物生長(zhǎng)按照時(shí)間的函數(shù)，使用數(shù)字成像。為了跟蹤不利條件下的植物生長(zhǎng)，在轉(zhuǎn)移至脅迫條件的那天(第0天)將植物拍照。隨后在植物轉(zhuǎn)移至脅迫條件后每隔幾天拍照并直至轉(zhuǎn)移后12天。從拍取的數(shù)碼照片測(cè)定植物大小。圖像J軟件用于定量來(lái)自數(shù)碼照片的植物大小(http:〃rsb.info.nih.gov/ij/)。i殳計(jì)了專利方案(proprietaryscript)來(lái)分析單個(gè)植物隨時(shí)間函數(shù)的大小。圖1顯示了用于反映面積定量的方法。分析每個(gè)構(gòu)建體五至十個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化情況并在每個(gè)脅迫實(shí)驗(yàn)中分析每個(gè)情況至少6個(gè)隨機(jī)選擇的植物。將表達(dá)來(lái)自本發(fā)明的基因的植物與播種于相同脅迫誘導(dǎo)平板上的對(duì)照植物(內(nèi)部對(duì)照)相比較或與相同實(shí)驗(yàn)中所用的全部對(duì)照植物的平均測(cè)量(全部對(duì)照)相比較。鍵^^為、s^一為了鑒定給予植物顯示出顯著差異的耐受性的基因，使用JMP統(tǒng)計(jì)程序(版本5.2.1,SASInstituteInc.,Cary,NC，USA)分析植物面積數(shù)據(jù)。為了檢測(cè)不同基因(單獨(dú)情況的群體)和對(duì)照植物之間的變化并鑒定顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的顯著性能的構(gòu)建體和情況，使用one-wayANOVA(方差分析)。對(duì)于基因?qū)?duì)照的分析，使用了Studentst-檢驗(yàn)，使用p<0.05的顯著性。為了發(fā)現(xiàn)具有提高的植物面積的顯著不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化情況，使用了Tukey，sHSD(HonestlySignificantlyDifferent)測(cè)試，使用p<0.05的顯著性。使用Two-wayANOVA來(lái)鑒定在特定時(shí)間點(diǎn)與在相同平板或相同實(shí)驗(yàn)的所有平板中生長(zhǎng)的對(duì)照植物的平均面積相比較顯示出植物面積顯著差異的情況。使用Student'st-檢驗(yàn)來(lái)比較獨(dú)立轉(zhuǎn)化情況與對(duì)照植物。潛l-為了鑒定提供鹽度或滲壓劑耐受性的基因，從每個(gè)構(gòu)建體的5至IO個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因情況產(chǎn)生T2植物。從T2植物收集種子并分析從其產(chǎn)生的植物。如以上詳述的，將植物播種于選擇培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因植物在其中能夠斗爭(zhēng)(卡那霉素)，并在7-10后(4-6葉階段)將植物轉(zhuǎn)移至產(chǎn)生脅迫的培養(yǎng)基高鹽度(150mM)或高滲壓劑(210mM甘露醇)。從轉(zhuǎn)移那天直至之后的12天分析植物大小。使用Student，tt-檢驗(yàn)和TukeyHSD測(cè)試來(lái)鑒定與野生型植物相比較顯示出顯著性能的情況。顯示了表達(dá)SEQIDNo158，159，160,161的轉(zhuǎn)基因植物在At6669啟動(dòng)子(SeqlD123)下的結(jié)果；這四個(gè)序列各自表示最初的單子葉植物ABSTSEQIDNo1,3，5，11,如以上的表4中所述的。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物在高鹽度脅迫和/或高滲壓劑脅迫存在下生長(zhǎng)能力的顯著差異。以下的表5概括了與對(duì)照植物相比較給予滲透脅迫耐受性的顯著情況的發(fā)現(xiàn)。本申請(qǐng)中包括的各種構(gòu)建體提供了具有提高的抗非生物脅迫能力的轉(zhuǎn)基因植物。如所示的，表達(dá)SEQID158的5個(gè)轉(zhuǎn)化情況中的4個(gè)顯示出顯著提高的滲壓劑耐受性，如通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物在高滲壓劑濃度下還持續(xù)發(fā)育的能力所判斷的(參見(jiàn)表5,l-5行)。圖2中也顯示了對(duì)SEQID158獲得的結(jié)果。在A圖中顯示了在第O,5和12天從含有轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植物的平板拍取的處理過(guò)的圖像。圖B顯示了不同時(shí)間點(diǎn)的不同情況的平均植物面積。情況1,2,3和4對(duì)滲壓劑的耐受性顯著更高(p<0.05)。本申請(qǐng)的其他構(gòu)建體也保護(hù)了植物免受高滲壓劑的影響。再者，表達(dá)SEQID161的五個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化情況中的四個(gè)顯示出在高滲壓劑下顯著提高的生長(zhǎng)能力(以下的表5，6-10行)。此外，表達(dá)SEQID160的情況之一對(duì)高滲壓劑顯示出比其相應(yīng)的對(duì)照植物顯著高的耐受性。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>以下的表6中概括了鹽度耐受性測(cè)試的結(jié)果。如表6中詳述的(1-4行)，使用含有SEQID158的構(gòu)建體的三個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因情況呈現(xiàn)出比實(shí)驗(yàn)中對(duì)照植物顯著更高的鹽度脅迫耐受性(p<0.05)。使用表達(dá)SEQID161的植物獲得相似的結(jié)果。以及在這種情況中，三個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因情況顯示出比它們相對(duì)的對(duì)照植物相比較顯著提高的鹽度脅迫耐受性(參見(jiàn)表6，5-9行)。,6<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>作為本研究的一部分進(jìn)行了測(cè)定構(gòu)建體提供鹽度和高滲壓劑耐受性的能力的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)了保護(hù)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)抗兩種脅迫的有害影響的基因。作為一個(gè)整體來(lái)看，該結(jié)果清楚地證明了本申請(qǐng)中包括的基因和構(gòu)建體提供非生物脅迫耐受性的能力。^,々卓fp戶控務(wù)y4BSr差茵的《這々趟的旅命溝造的^:f許多現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的關(guān)鍵性狀可以通過(guò)根部構(gòu)造的改變來(lái)解釋。根部大小和深度與干旱耐受性和肥料利用率相關(guān)。越深的根部系統(tǒng)可以接近存儲(chǔ)在更深土壤層中的水。相似地，高度分支的根部系統(tǒng)提供了更好的土壤覆蓋，并因此可以有效地吸收所有可用的大量營(yíng)養(yǎng)素和微量營(yíng)養(yǎng)素，導(dǎo)致提高的肥料利用率。為了測(cè)試是否轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生了不同的根部結(jié)構(gòu)，將植物生長(zhǎng)于垂直放置的瓊脂平板中。每隔幾天將平板拍照，并測(cè)定植物根部覆蓋的大小，長(zhǎng)度和面積。從每個(gè)形成的構(gòu)建體，檢查幾個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)化情況。為了測(cè)定根部特征之間的顯著差異，可以使用單因素和雙因素ANOVA，使用Studentst-檢驗(yàn)或TukeyHSD測(cè)試來(lái)鑒定顯示出顯著根部特征的情況以及給發(fā)現(xiàn)提供統(tǒng)計(jì)學(xué)分?jǐn)?shù)(參見(jiàn)以上的實(shí)施例8)。,，本發(fā)努#差^控務(wù)炎豸的jt樹(shù)#將如上所述產(chǎn)生的T!或T2轉(zhuǎn)基因植物單獨(dú)移植至含有泥炭和蛭石(各自體積比3:2)的生長(zhǎng)混合物的罐中。將罐覆蓋24hr用于固化，然后以完全隨機(jī)的次序置于溫室中，并用自來(lái)水澆灌七天(每3-5天從罐底部提供)。此后，用鹽溶液(100mMNaCl和5mMCaCl2)澆灌一半植物來(lái)誘導(dǎo)鹽度脅迫(脅迫條件)。將另一半植物繼續(xù)用自來(lái)水灌溉(正常條件)。將所有植物生長(zhǎng)于100%RH下28天，然后收割(地上組織)并稱重(立即或在50。C烘箱中干燥24小時(shí)后)。認(rèn)識(shí)到為了清楚在分開(kāi)的實(shí)施方案的內(nèi)容中描述的本發(fā)明的特定特征也可以在單個(gè)實(shí)施方案的組合中提供。相反，為了簡(jiǎn)潔在單個(gè)實(shí)中提供。、、口。、、-'。、、盡管已經(jīng)結(jié)合特定的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，清楚的是許多替換，改變和變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。因此，確定包括落入所附權(quán)利要求的精神和寬范圍內(nèi)的所有這樣的替換，改變和變化。本說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物，專利，專利申請(qǐng)以及由其登錄號(hào)識(shí)別的序列在此以其整體引入說(shuō)明書(shū)中作為參考，至如同每個(gè)單個(gè)出版物，專利或?qū)＠暾?qǐng)或由其登錄號(hào)識(shí)別的序列特意并單獨(dú)引入作為參考一樣的樣"參考文獻(xiàn)用作本發(fā)明的^有技術(shù)。、^、；'」"、參考文獻(xiàn)(上文中引用的其他參考文獻(xiàn))1.www.fao.org/ag/agl/agll/spush/degrad.htm.2.www.fao.org/ag/agl/aglw/watermanagement/introduc.stm3.McCueKF，HansonAD(1990).Droughtandsalttolerance:towardsunderstandingandapplication.(干旱和鹽耐受性朝向理解和應(yīng)用)TrendsBioteclinol8:358-362.4.FlowersTJ,YeoAr(1995).Breedingforsalinityresistanceincropplants:wherenext(作物中抗鹽性的育種下一個(gè)在哪里？)AustJPlantPhysiol22:875-884.5.NguyenBD,BrarDS,BuiBC，NguyenTV,PhamLN,NguyenHT(2003).IdentificationandmappingoftheQTLforaluminumtoleranceintrogressedfromthenewsource,ORYZARUFIPOGONGriff.,intoindicarice(OryzasativaL.).(來(lái)自新來(lái)源，ORYZARUFIPOGONGriff.，基因滲入秈稻(OryzasativaL.)的鋁耐受性的QTL的鑒定和作圖)TheorApplGenet.106:583-93.6.SanchezAC,SubudhiPK,RosenowDT,NguyenHT(2002).MappingQTLsassociatedwithdroughtresistanceinsorghum(SorghumbicolorL.Moench).(與高粱(SorghumbicolorL.Moench)中抗旱性相關(guān)的QTL作圖)PlantMolBiol.48:713-26.7.QuesadaV,Garcia-MartinezS,PiquerasP，PonceMR,MicolJL(2002).GeneticarchitectureofNaCltoleranceinArabidopsis.(擬南芥中NaCl耐受性的遺傳結(jié)構(gòu))PlantPhysiol.130:951-963.8.ApseMP,BlumwaldE(2002).Engineeringsalttoleranceinplants.(在植物中工程化耐鹽性)CurrOpinBiotechnol.13:146-150.9.RonteinD,BassetG,HansonAD(2002).Metabolicengineeringofosmoprotectantaccumulationinplants.(才直物中滲透寸呆護(hù)劑累積的4戈"i射工程化)MetabEng4:49-5610.CloughSJ,BentAF(1998).Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.(Floraldip:擬南芥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的簡(jiǎn)化方法)PlantJ16:735-43.11.DesfeuxC，CloughSJ,BentAF(2000).FemalereproductivetissuesaretheprimarytargetofAgrobacterium-mediatedtransformationbytheArabidopsisfloral-dipmethod.(雌性生殖組織是通過(guò)擬南芥floral-dip方法的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的主要目標(biāo))PlantPhysiol123:895-904.權(quán)利要求1.提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性的方法，所述方法包括在植物內(nèi)表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，該多肽具有與SEQIDNO2，4，6，8，10，12，13-56，58-63，66-121，141-156或157至少90％同源的氨基酸序列，因此提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。2.權(quán)利要求l的方法，其中通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)所述表達(dá)(a)用所述外源多核苷酸轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞；(b)從所述細(xì)胞產(chǎn)生成熟植物；和(c)在適于在所述成熟植物內(nèi)表達(dá)所述外源多核苷酸的條件下栽培所述成熟一直物。3.權(quán)利要求2的方法，其中通過(guò)將核酸構(gòu)建體中引入所述植物細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)化，所述核酸構(gòu)建體包括所述外源多核苷酸和至少一個(gè)能夠指導(dǎo)所述外源多核苷酸在所述植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述至少一個(gè)啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子。6.權(quán)利要求3的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子是At6669啟動(dòng)子。7.權(quán)利要求3的方法，其中所述至少一個(gè)啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是非生物脅迫可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。9.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)用包括所述外源多核苷酸的病毒感染所述植物來(lái)實(shí)現(xiàn)所述表達(dá)。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒是無(wú)毒病毒。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述非生物脅迫選自鹽度，缺水，低溫，高溫，重金屬毒性，缺氧，營(yíng)養(yǎng)不足，營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，大氣污染和UV照射。12.權(quán)利要求l的方法，其中所述植物是雙子葉植物。13.權(quán)利要求l的方法，其中所述植物是單子葉植物。14.^l利要求1的方法，其中所述多核苷酸選自SEQIDNO:1，3,5,7,9,11,158,159,160，161,162-204,206-211,214-287。15.提高植物的生物量、活力和/或產(chǎn)量的方法，所述方法包括在植物內(nèi)表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，該多肽具有與SEQIDNO:2,4,6,8,10,12，13-56,58-63，66-121，141-156或157至少90%同源的氨基酸序列，因此提高植物的生物量、活力和/或產(chǎn)量。16.權(quán)利要求l的方法，其中通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)所述表達(dá)(a)用所述外源多核苷酸轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞；(b)從所述細(xì)胞產(chǎn)生成熟植物；和(c)在適于在所述成熟植物內(nèi)表達(dá)所述外源多核苷酸的條件下栽培所述成熟#_物。17.權(quán)利要求16的方法，其中通過(guò)將核酸構(gòu)建體中引入所述植物細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)化，所述核酸構(gòu)建體包括所述外源多核苦酸和至少一個(gè)能夠指導(dǎo)所述外源多核苷酸在所述植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述至少一個(gè)啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子是At6669啟動(dòng)子。21.權(quán)利要求17的方法，其中所述至少一個(gè)啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。22.權(quán)利要求15的方法，其中通過(guò)用包括所述外源多核苷酸的病毒感染所述植物來(lái)實(shí)現(xiàn)所述表達(dá)。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述病毒是無(wú)毒病毒。24.權(quán)利要求15的方法，其中所述植物是雙子葉植物。25.權(quán)利要求15的方法，其中所述植物是單子葉植物。26.權(quán)利要求15的方法，其中所述多核苷酸選自SEQIDNO:1,3，5,7，9,11,158，159，160,161,162-204,206-211,214-287。27.核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括與選自SEQIDNO:1，3,5,7,9,11,158,159,160,161,162-204,206-211,214-287的核苷酸序列至少90%相同的核酸序列和能夠指導(dǎo)所述核酸序列在宿主細(xì)月包中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。28.權(quán)利要求27的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。29.權(quán)利要求28的核酸構(gòu)建體，其中所述組成型啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子。30.權(quán)利要求28的核酸構(gòu)建體，其中所述組成型啟動(dòng)子是At6669啟動(dòng)子。31.權(quán)利要求27的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。32.權(quán)利要求31的核酸構(gòu)建體，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是非生物脅迫可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。33.權(quán)利要求27的核酸構(gòu)建體，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。34.權(quán)利要求33的核酸構(gòu)建體，其中所述植物細(xì)胞形成雙子葉植物細(xì)力包的一部分。35.權(quán)利要求33的核酸構(gòu)建體，其中所述植物細(xì)胞形成單子葉植物細(xì)力包的一部分。36.分離的多肽，其包括與由選自以下的多核苷酸編碼的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列SEQIDNO:1，3，5，7，9,11，158，159，160,161,162-204,206-211,214-287。37.權(quán)利要求36的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:2,4,6,8,10，12,13-56，58-63,66-121,141-156或157至少90%同源。38.植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包括編碼多肽的外源核苷酸，該多肽具有與SEQIDNO:2,4，6，8,10,12,13-56,58-63,66-121,141-156或157至少90%同源的氨基酸序列，因此提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。39.權(quán)利要求38的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞形成植物的一部全文摘要提供了多核苷酸序列和使用其提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/或提高植物生物量，活力和/或產(chǎn)量的方法。文檔編號(hào)A01H5/00GK101437947SQ200680038391公開(kāi)日2009年5月20日申請(qǐng)日期2006年8月15日優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日發(fā)明者G·羅南,H·卡奇,L·拉比諾維克,R·耶林申請(qǐng)人:伊沃基因有限公司