一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，包括以下步驟：S01，富集：采用孔徑小于單細胞微囊藻直徑的浮游植物網(wǎng)過濾定量水體，得總藻液；S02，總微囊藻樣品的制備：取定量的所述總藻液，超聲；S03，單細胞微囊藻樣品的制備：另取定量的所述總藻液，過孔徑大于所述單細胞微囊藻直徑且小于10μm濾網(wǎng)；S04，檢測：分別取所述總微囊藻樣品和單細胞微囊藻樣品，通過流式細胞儀；S05，群體微囊藻生物量C3的計算。本發(fā)明提供的一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，能夠富集水體中單細胞和群體形態(tài)的微囊藻，通過流式細胞儀快速鑒別微囊藻，能夠反應水體微囊藻生物量的動態(tài)變化及其存在的形態(tài)。
【專利說明】
一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明涉及一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，屬于資源環(huán)境技術(shù)領域?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]在湖泊水庫中，藍藻水華主要以微囊藻水華為主。微囊藻單細胞會在生長過程中形成群體。夏秋季生物量達到足夠濃度，并且微囊藻群體克服擾動上升至水面，就會形成肉眼可見的水華現(xiàn)象。冬季微囊藻群體分散成單細胞和小群體形態(tài)，存活的單細胞和小群體形態(tài)的藻類則作為來年微囊藻水華的種源。為預測、了解和防治微囊藻水華現(xiàn)象，必須對全年微囊藻的生物量及在水體賦存形態(tài)進行監(jiān)測。
[0003]通常，生物量的富集多采用64WI1浮游植物網(wǎng)富集水體中的藻類，這樣會漏去單細胞及小群體形態(tài)的微囊藻。而通過過濾湖水富集藻細胞提取色素表征生物量的方法，會因不同環(huán)境下藻色素相對濃度不同，測量結(jié)果存在差異。因此，現(xiàn)有的檢索結(jié)果中不含單細胞及小群體形態(tài)的微囊藻的生物量，故檢測結(jié)果偏低，不能真實反應水體中的微囊藻的生物量及其在水體中的賦存形態(tài)。所以目前缺少富集單細胞微囊藻的方法，而且目前在富集浮游藻類時會帶入泥沙顆粒，造成顯微鏡下計數(shù)和識別單細胞藻類比較困難。因而研發(fā)相應的浮游植物網(wǎng)富集微囊藻細胞并建立測定其單細胞和群體生物量方法就顯得迫切需要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種能夠富集單細胞微囊藻，并且可快速獲得單細胞微囊藻生物量和群體微囊藻生物量的方法，該法步驟簡單，操作簡便，檢測成本低，檢測結(jié)果準確;進一步地，本發(fā)明提供一種單細胞微囊藻分散效果好的富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]—種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]S01，富集:采用孔徑小于單細胞微囊藻直徑的浮游植物網(wǎng)過濾定量水體，得總藻液；
[0008]S02,總微囊藻樣品的制備:取定量的所述總藻液，超聲，得總微囊藻樣品；
[0009]S03,單細胞微囊藻樣品的制備:另取定量的所述總藻液，過孔徑大于所述單細胞微囊藻直徑且小于10M1濾網(wǎng)，濾液即為單細胞微囊藻樣品；
[0010]S04,檢測:分別取所述總微囊藻樣品和單細胞微囊藻樣品，通過流式細胞儀，檢測，得總微囊藻生物量&和單細胞微囊藻生物量C2 ;[0011 ]S05，群體微囊藻生物量C3的計算:C3 = CrC2。
[0012]所述浮游植物網(wǎng)的孔徑為3mi;所述浮游植物網(wǎng)的材質(zhì)為尼龍濾布。
[0013]所述浮游植物網(wǎng)的制作方法為:將正方形的所述尼龍濾布相鄰兩邊折疊至少2次后縫合制成漏斗狀，頂端用鋼圈固定，下部裝配收集器。
[0014]富集過程中，需反復沖洗所述浮游植物網(wǎng)的網(wǎng)衣外側(cè)，所述網(wǎng)衣內(nèi)部為所述總藻液。
[0015]富集得到的所述總藻液，儲存在-4°C黑暗下，在24h內(nèi)通過所述流式細胞儀測定Ci 和C2〇
[0016] 超聲條件為:在35HZ，45W條件下超聲0 ? 5?1 ? 5min。
[0017]所述超聲條件為:在35HZ，45W條件下超聲lmin。
[0018]所述濾網(wǎng)的孔徑為10M1;所述濾網(wǎng)的材質(zhì)為紗絹。
[0019]收集器為一個收集管，浮游植物網(wǎng)的底端設置有出液孔，出液孔與收集管的內(nèi)壁緊密相連，收集管是來收集藻液的，收集管上設置有開關，打開收集管的開關，藻液會流出來，然后裝到樣品管里。鋼圈是起支撐作用，支撐網(wǎng)衣不會發(fā)生變形。
[0020]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明能夠富集水體中單細胞和群體形態(tài)的微囊藻，獲得足夠藻濃度，并且經(jīng)過簡單的預處理，通過流式細胞儀快速鑒別微囊藻，對單細胞微囊藻和群體微囊藻生物量準確計數(shù)，能夠反應水體微囊藻生物量的動態(tài)變化及其存在的形態(tài)?！靖綀D說明】
[0021]圖1為本發(fā)明的富集及檢測流程圖；
[0022]圖2為本發(fā)明超聲條件的優(yōu)化圖；[〇〇23]圖3為本發(fā)明的檢測結(jié)果圖?！揪唧w實施方式】[〇〇24]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。[〇〇25] 實施例1:
[0026]如圖1?圖3所示，一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，包括下列步驟:[〇〇27] 1.浮游植物網(wǎng)的制作及采樣:
[0028]由于單細胞微囊藻粒徑在3?5mi，因此本實施例采用3mi的尼龍濾布，考慮到尼龍濾布網(wǎng)孔較細，盡量少剪裁，因此將濾布裁剪成正方形，將正方形相鄰兩邊折疊至少2次后用細布包裹縫制成漏斗狀，頂端用鋼圈固定，下部配收集器。制好的浮游植物網(wǎng)應注意縫隙處不出現(xiàn)漏藻。[〇〇29] 2.浮游藻類的富集、轉(zhuǎn)移和保存:[〇〇3〇]在水體中應用浮游植物網(wǎng)富集藻類時，應根據(jù)水體藻類豐度水平，用有機玻璃采水器定量采取水樣富集藻液，本實施例于2016年2月25日在太湖梅梁灣區(qū)域采集5L湖水進行富集，初始富集時，在水壓的作用下，湖水快速透過浮游植物網(wǎng)。隨著壓力的減小和顆粒濃度增加，過濾狀態(tài)達到飽和，之后對浮游植物網(wǎng)外側(cè)進行沖洗，當過濾狀態(tài)再次達到飽和時，收集富集的藻液。樣品應儲存在_4°C，黑暗下，生物量和生理特征的分析應在24h內(nèi)完成測定。[0031 ] 3.樣品的預處理及微囊藻單細胞和群體生物量的測定:[〇〇32]采用35Hz，45W超聲功率，配置三組不同濃度的太湖微囊藻群體做超聲時間梯度試驗l、2、3min，以確定水體微囊藻群體的最佳超聲時間。如圖2所示，Omin是用水浴振蕩器在100°C下以120rad/min震蕩5min處理后鏡檢計數(shù)，l、2、3min是經(jīng)超聲處理后的樣品進行鏡檢計數(shù)。結(jié)果顯示，在35Hz，45W，超聲lmin，不同濃度的藻群體分散成單細胞效果最佳。 [〇〇33]流式細胞儀只能通過小于10M的顆粒。需要將富集的藻樣取10mL經(jīng)超聲處理，將群體微囊藻分散成單細胞形態(tài)，獲得總微囊藻生物量。另取10mL藻樣過lOwii紗絹，獲得單細胞藻類。由總微囊藻生物量減去單細胞微囊藻生物量可以得到群體微囊藻生物量。[0〇34]流式細胞儀分析:采用美國貝克曼公司的cytoflex型號的流式細胞儀。依據(jù)葉綠素FL3(690/50nm)和藻藍素FL4(660/20nm)熒光通道鑒別微囊藻。樣品檢測時間范圍3-7min〇
[0035]如圖3所示，流式細胞儀根據(jù)藻藍素和葉綠素的熒光差異區(qū)分不同藻類并計數(shù)，而微囊藻的藻藍素熒光信號要高于其他細胞群，易于識別。[〇〇36] 實施例2:
[0037]如圖1?圖3所示，一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，包括下列步驟:[〇〇38]1.浮游植物網(wǎng)的制作及采樣:
[0039]由于單細胞微囊藻粒徑在3?5mi，因此本實施例采用2.5wii的尼龍濾布，考慮到尼龍濾布網(wǎng)孔較細，盡量少剪裁，因此將濾布裁剪成正方形，將正方形相鄰兩邊折疊2次后用細布包裹縫制成漏斗狀，頂端用鋼圈固定，下部配收集器。制好的浮游植物網(wǎng)應注意縫隙處不出現(xiàn)漏藻。
[0040]2.浮游藻類的富集、轉(zhuǎn)移和保存:
[0041]在水體中應用浮游植物網(wǎng)富集藻類時，應根據(jù)水體藻類豐度水平，用有機玻璃采水器定量采取水樣富集藻液，本實施例于2016年2月25日在太湖梅梁灣區(qū)域采集5L湖水進行富集，初始富集時，在水壓的作用下，湖水快速透過浮游植物網(wǎng)。隨著壓力的減小和顆粒濃度增加，過濾狀態(tài)達到飽和，之后對浮游植物網(wǎng)外側(cè)進行沖洗，當過濾狀態(tài)再次達到飽和時，再次對浮游植物網(wǎng)外側(cè)進行沖洗，當濾狀態(tài)第三次達到飽和時，收集富集的藻液，得總藻液?？傇逡簶悠窇獌Υ嬖赺4°C，黑暗下，生物量和生理特征的分析應在24h內(nèi)完成測定。 [〇〇42]3.樣品的預處理及微囊藻單細胞和群體生物量的測定:[〇〇43] 流式細胞儀只能通過小于10M1的顆粒。需要將富集的總藻液取10mL經(jīng)超聲處理， 超聲條件為采用35Hz，45W超聲功率，超聲0.5min，將群體微囊藻分散成單細胞形態(tài)，獲得總微囊藻生物量。另取10mL總藻液過lOym紗絹，獲得單細胞微囊藻類。由總微囊藻生物量減去單細胞微囊藻生物量可以得到群體微囊藻生物量。
[0044]流式細胞儀分析:采用美國貝克曼公司的cytoflex型號的流式細胞儀。依據(jù)葉綠素FL3(690/50nm)和藻藍素FL4(660/20nm)熒光通道鑒別微囊藻。樣品檢測時間范圍3-7min〇
[0045]如圖3所示，流式細胞儀根據(jù)藻藍素和葉綠素的熒光差異區(qū)分不同藻類并計數(shù)，而微囊藻的藻藍素熒光信號要高于其他細胞群，易于識別。[〇〇46] 實施例3:
[0047]如圖1?圖3所示，一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，包括下列步驟:[〇〇48]1.浮游植物網(wǎng)的制作及采樣:
[0049]由于單細胞微囊藻粒徑在3?5μπι，因此本實施例采用2.Ομπι的尼龍濾布，考慮到尼龍濾布網(wǎng)孔較細，盡量少剪裁，因此將濾布裁剪成正方形，將正方形相鄰兩邊折疊2次后用細布包裹縫制成漏斗狀，頂端用鋼圈固定，下部配收集器。制好的浮游植物網(wǎng)應注意縫隙處不出現(xiàn)漏藻。
[0050]2.浮游藻類的富集、轉(zhuǎn)移和保存:
[0051]在水體中應用浮游植物網(wǎng)富集藻類時，應根據(jù)水體藻類豐度水平，用有機玻璃采水器定量采取水樣富集藻液，本實施例于2016年2月25日在太湖梅梁灣區(qū)域采集5L湖水進行富集，初始富集時，在水壓的作用下，湖水快速透過浮游植物網(wǎng)。隨著壓力的減小和顆粒濃度增加，過濾狀態(tài)達到飽和，之后對浮游植物網(wǎng)外側(cè)進行沖洗，當過濾狀態(tài)再次達到飽和時，收集富集的藻液，得總藻液?？傇逡簶悠窇獌Υ嬖?4°C，黑暗下，生物量和生理特征的分析應在24h內(nèi)完成測定。
[0052]3.樣品的預處理及微囊藻單細胞和群體生物量的測定:
[0053]流式細胞儀只能通過小于ΙΟμπι的顆粒。需要將富集的總藻液取1mL經(jīng)超聲處理，超聲條件為采用35Hz，45W超聲功率，超聲1.5min，將群體微囊藻分散成單細胞形態(tài)，獲得總微囊藻生物量。另取1mL總藻液過1ym紗絹，獲得單細胞微囊藻類。由總微囊藻生物量減去單細胞微囊藻生物量可以得到群體微囊藻生物量。
[0054]流式細胞儀分析:采用美國貝克曼公司的cytoflex型號的流式細胞儀。依據(jù)葉綠素FL3(690/50nm)和藻藍素FL4(660/20nm)熒光通道鑒別微囊藻。樣品檢測時間范圍3-7min0
[0055]如圖3所示，流式細胞儀根據(jù)藻藍素和葉綠素的熒光差異區(qū)分不同藻類并計數(shù)，而微囊藻的藻藍素熒光信號要高于其他細胞群，易于識別。
[0056]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出:對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，其特征在于，包括以下步驟:so 1，富集:采用孔徑小于單細胞微囊藻直徑的浮游植物網(wǎng)過濾定量水體，得總藻液；S02，總微囊藻樣品的制備:取定量的所述總藻液，超聲，得總微囊藻樣品；S03,單細胞微囊藻樣品的制備:另取定量的所述總藻液，過孔徑大于所述單細胞微囊 藻直徑且小于10M1濾網(wǎng)，濾液即為單細胞微囊藻樣品；S04，檢測:分別取所述總微囊藻樣品和單細胞微囊藻樣品，通過流式細胞儀，檢測，得 總微囊藻生物量Ci和單細胞微囊藻生物量C2;S05，群體微囊藻生物量C3的計算:C3 = &-C2。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，其特征 在于:所述浮游植物網(wǎng)的孔徑為3mi ;所述浮游植物網(wǎng)的材質(zhì)為尼龍濾布。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，其特征 在于:所述浮游植物網(wǎng)的制作方法為:將正方形的所述尼龍濾布相鄰兩邊折疊至少2次后縫 合制成漏斗狀，頂端用鋼圈固定，下部裝配收集器。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，其特征 在于:富集過程中，需反復沖洗所述浮游植物網(wǎng)的網(wǎng)衣外側(cè)，所述網(wǎng)衣內(nèi)部為所述總藻液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，其特征 在于:富集得到的所述總藻液，儲存在-4°C黑暗下，在24h內(nèi)通過所述流式細胞儀測定(^和 C2〇6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，其特征 在于:超聲條件為:在35HZ，45W條件下超聲0.5?1.5min。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，其特征 在于:所述超聲條件為:在35HZ，45W條件下超聲lmin。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富集及檢測微囊藻單細胞和群體生物量的方法，其特征 在于:所述濾網(wǎng)的孔徑為10M1;所述濾網(wǎng)的材質(zhì)為紗絹。
【文檔編號】G01N15/14GK106018245SQ201610338453
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】朱偉, 周小華, 陳懷民, 吳思麟, 趙鴻茹, 徐鋒, 陳程, 譚嘯
【申請人】河海大學