專利名稱：：玉米轉(zhuǎn)化性狀的標(biāo)記輔助選擇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子標(biāo)記和轉(zhuǎn)化的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：作物植物的可栽培性(culturability)據(jù)證實(shí)隨所用種質(zhì)的不同而不同。一些品種或抹系比其他的品種或抹系更容易栽培和再生。在許多情況下，具有最佳農(nóng)藝性狀的植抹往往顯示差的栽培和再生特性，而更容易栽培和再生的植抹卻常常顯示差的農(nóng)藝性狀。Armstrong等人的研究(D.D.Songstad,W.L.Petersen,C.L.Armstrong,^wer/ca"/owma/Vol.79，pp.761-764,1992)證實(shí)，有可能將可栽培性較好而農(nóng)藝性較差的玉米抹系(A188)與農(nóng)藝性合意而可栽培性較差的株系(B73)進(jìn)行雜種繁殖，以產(chǎn)生出可栽培性和再生性提高的新型抹系(Hi-II)。對該林系進(jìn)行了標(biāo)記分析，鑒定出了幾個似乎給可栽培性較差的遺傳背景賦予提高的可栽培性的染色體區(qū)域。發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明提供培育可轉(zhuǎn)化性(transformability)提高的玉米植林的方法以及用來追蹤提高的可轉(zhuǎn)化性的標(biāo)記。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明才是供產(chǎn)生農(nóng)藝上優(yōu)異(elite)和可轉(zhuǎn)化的玉米柏4朱的方法，所述方法包括通過將定位于(m叩to)染色體1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的染色體基因座從可轉(zhuǎn)化性較好的玉米基因型漸滲(introgress)到可轉(zhuǎn)化性較差的玉米基因型中來產(chǎn)生一群植林的步驟。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生農(nóng)藝上優(yōu)異和可轉(zhuǎn)化的玉米植抹的方法還包括將至少一個定位于染色體bin1.01、1.02、1.03、2.01、2.02、2.03、2.04、3.01、3.02、3.03、3.043.05、4.07、4.08、4.09、5.03、5.05、5.07、5.086.01、6.02、6.03、6.04、6.05、6.06、6.07、6.08、6.09、7.04、7,05、8.01、8.03、8.04、8.05、8.06、8.07、10.01、10.02、10.03或10.04的染色體基因座從可轉(zhuǎn)化的品種漸滲到農(nóng)藝上優(yōu)異的品種中。發(fā)明詳述培育是將一種植物的性狀轉(zhuǎn)移到另一種植物的傳統(tǒng)且有效的方法。標(biāo)記輔助培育是一種提高傳統(tǒng)培育和在培育過程中可以選擇生化性狀、產(chǎn)量性狀或其他可見性較差的性狀的方法。雖然進(jìn)行了培育工作以改進(jìn)植物培養(yǎng)和再生，但鑒定和培育與提高的轉(zhuǎn)化特性有關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域的研究卻進(jìn)行得甚少。各種玉米抹系常常在可轉(zhuǎn)化性哈哈可培育性方面有差異。從任何給定玉米基因型產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植抹的效率是不定的。能有效產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植林的抹系往往農(nóng)藝上較差(例如Hi-II)，而具有優(yōu)越(superior)或期望的農(nóng)藝性狀的林系其產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植林的效率較差。如果要將期望的基因引入到農(nóng)藝上較差的株系，則通常將它漸滲到優(yōu)異或優(yōu)越的林系中，以測定諸如所引入基因的效力(efficacy)的參數(shù)以及測定該基因?qū)χT如產(chǎn)量、仁品質(zhì)和植抹表型的性狀的作用。因此，為能夠在早期各代中進(jìn)行有意義的性能測定，要是能夠?qū)⒏鬟z傳成分引入到具有提高的可轉(zhuǎn)化性連同優(yōu)越的農(nóng)藝性狀的玉米近交系(inbred)中，那將是有利的。本發(fā)明通過提供培育具有提高的轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生能力的玉米品種的方法，克服了本領(lǐng)域的這一不足。優(yōu)異玉米近交系的轉(zhuǎn)化是開發(fā)具有改進(jìn)的農(nóng)藝性狀的近交系和雜交系(hybrid)的重要技術(shù)。Hi-II玉米由于其可轉(zhuǎn)化性高和可栽培性好，多年來已被用于進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)化。Hi-II是一種雜交系。非純合植林用于開發(fā)轉(zhuǎn)基因性狀是有問題的。若將均勻、純合的背景用于轉(zhuǎn)基因開發(fā)，則更容易確定轉(zhuǎn)基因的作用。在轉(zhuǎn)化中使用Hi-II的另一個缺點(diǎn)是，它不具有在當(dāng)前的優(yōu)異玉米近交系中所存在的品質(zhì)遺傳現(xiàn)象。6當(dāng)開發(fā)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品時，轉(zhuǎn)基因是通過異花傳粉移動到優(yōu)異背景中。在初始的雜交(cross)后，采用回交(brackcrossing)盡可能多地除去Hi-ll有害基因組。這是一個費(fèi)力費(fèi)時的過程。因此若有具備優(yōu)異基因型同時又保持高可轉(zhuǎn)化性的純合玉米品種，將是有利的。若了解能導(dǎo)致可轉(zhuǎn)化性提高的標(biāo)記、染色體區(qū)域和基因，對于獲得具有提高的可轉(zhuǎn)化性的優(yōu)異玉米近交系將是有利的。某植物林系如玉米近交系或雜交系，若它在基本上相同的轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化效率大于親本系，則說它顯示"提高的可轉(zhuǎn)化性"。轉(zhuǎn)化效率是再生的轉(zhuǎn)基因植林的數(shù)目與暴露于外源DNA的起始材料(例如不成熟胚、愈傷組織塊等等)的單位數(shù)目之比，不管起始材料的類型、轉(zhuǎn)化的方法或者選擇和再生的手段如何。在本文所述的培育和轉(zhuǎn)化條件下，如果親本系經(jīng)歷了培育過程，結(jié)果獲得轉(zhuǎn)化效率高于原始親本系的玉米抹系，則認(rèn)為該株系顯示提高的可轉(zhuǎn)化性。對于具有可測量的可轉(zhuǎn)化性的^^朱系，例如0.001%-0.01%或更高的可轉(zhuǎn)化性，提高的可轉(zhuǎn)化性可通過增加倍數(shù)來測量。培育后子代種質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率可比親本系的轉(zhuǎn)化效率提高約2倍至約3倍?；蛘?，培育后子代種質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率可比親本系的轉(zhuǎn)化效率提高約3倍至約5倍。預(yù)期到，培育后子代種質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率可比親本系的轉(zhuǎn)化效率提高約5倍至約10倍，約5倍至約20倍，約5倍至約50倍，甚至約5倍至約100倍。某林系若進(jìn)行本發(fā)明所述的標(biāo)記輔助培育和轉(zhuǎn)化測定后，顯示出轉(zhuǎn)化效率比親本系提高至少2倍，則認(rèn)為它顯示提高的可轉(zhuǎn)化性。本發(fā)明通過提供用以提高可轉(zhuǎn)化性的培育方法，克服了玉米轉(zhuǎn)化的現(xiàn)有技術(shù)的局限。有利的是，顯示差的轉(zhuǎn)化能力的玉米林系可按照本文公開的方法進(jìn)行培育，以產(chǎn)生出顯示提高的可轉(zhuǎn)化性的林系。特別有利的是，所述方法可應(yīng)用到優(yōu)異抹系，來在農(nóng)藝上合意的種質(zhì)中賦予提高的可轉(zhuǎn)化性。本發(fā)明還確定出對T-DNA遞送、可栽培性、再生和轉(zhuǎn)化重要的特定染色體位置。本發(fā)明確定出可用來追蹤特定染色體位置，使得可以以有效方式實(shí)現(xiàn)高度可轉(zhuǎn)化的優(yōu)異林系的培育的標(biāo)記。本發(fā)明的方法用獲自Hi-II玉米林系的雙單倍體系來說明。由于Hi-n是雜交系，從其子代形成的雙單倍體的群體在可與高可轉(zhuǎn)化性有關(guān)聯(lián)的基因上會發(fā)生分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道，任何可高度轉(zhuǎn)化的基因型也可使用。對各個代的后代測定T-DNA遞送效率、可培育性、可再生性和總可轉(zhuǎn)化性。標(biāo)記分析表明，與染色體l、2、3、4、5、6、7、8、9和IO有關(guān)聯(lián)的區(qū)域與提高的可轉(zhuǎn)化性表型有關(guān)聯(lián)?？梢韵蛉魏纹谕挠衩走z傳背景中引入^^是高的可轉(zhuǎn)化性性狀，例如在適合產(chǎn)生雜交系的近交系、任何其他近交系、具有需要的農(nóng)藝性狀的玉米抹系或任何具有提高的可轉(zhuǎn)化性性狀的玉米林系的生產(chǎn)中。使用常規(guī)的植物培育技術(shù)，可以培育提高的可轉(zhuǎn)化性并通過自花傳粉或近緣授粉在近交系中保持該性狀。本發(fā)明的一個實(shí)施方案是位于bin1.01、1.02、1.03、2.01、2.02、2.03、2.04、3.01、3.02、3.03、3.043.05、4.07、4.08、4.09、5.03、5,05、5.07、5.086.01、6.02、6.03、6.04、6.05、6.06、6.07、6.08、6.09、7.04、7.05、8.01、8.03、8.04、8.05、8.06、8.07、10.01、10.02、10.03或10.04的任何數(shù)目的分子標(biāo)記或其組合(anynumberorcombinationofmolecularmarker)用于培育提高的可轉(zhuǎn)化性的用途。另一個實(shí)施方案是使用位于以下標(biāo)記任一側(cè)20厘摩(centimorgan)處的任"f可H目的分子才示i己或其"f壬"f可纟且合(anynumberoranycombinationofmolecularmarker)來培育改進(jìn)的轉(zhuǎn)換效率MARKERD、BNLG1014、UMC1254、UMC2013、UMC1792、MARKERJ、UMC2133、UMC1708、UMC2087、UMC1774、UMC1797、UMC1265、PHI453121、MARKERE、UMC2041、MARKERG、UMC1365、MARKERF、UMC2035、UMC2294、UMC1339、UMC1433、UMC1287、UMC1607、BNLG1828、UMC1701、固C1254、UMC1119、BNLG1720、BNLG1520、UMC1458、UMC1174、UMC1167、MARKERB、UMC1662、UMC1895、UMC1142、8UMC2036、UMC1792、麗C1225、BNLG386、麗C1153、UMC1229;UMC1195、函C1114、UMC2059、MARKERH、麗C1910、UMC1170、UMC2341、UMC2346、BNGL619、UMC2131、PHI041、MarkerA、畫C醒、UMC2245、UMC1934、PHI427434、UMC2305、而C1642、UMC1125、UMC1858、MARKERC、MarkerL、PHB14704、PHI333597、MarkerM、MarkerN、PHI445613、MarkerO、MarkerQ、MarkerR、BNLG1160、BNLG1174、BNLG1189、BNLG1647、PHI053、PMG1、UMC1025、UMC1043、UMC1075、UMC1086、UMC1400、UMC1412、UMC1424、UMC1495、UMC1587、UMC1667、UMC1808、UMC1814、UMC1830、UMC1853、UMC1907、UMC1908、UMC1949、UMC1985、UMC2258、UMC2260、UMC2264、UMC2265。所述實(shí)施方案包括位于以上所列標(biāo)記任一側(cè)10、5、3、2或1厘摩處的標(biāo)記的至少一個和任何組合。所述實(shí)施方案還包括至少一個所列標(biāo)記或它們的任何組合。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括位于bin2.02、2.03、2.04、3.01、3.02、3.04、3.05、3.06、4.07、4.08、4.09、6.05、6.06、8.01和8.05的標(biāo)記用于培育改進(jìn)的愈傷組織類型的用途。改進(jìn)的愈傷組織類型可以是愈傷組織的更快生長以及形成n型愈傷組織的胚類型或其他組織類型的百分?jǐn)?shù)的增加。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括J吏用位于以下標(biāo)記任一側(cè)20厘摩處的分子標(biāo)記來培育改進(jìn)的愈傷組織UMC2260、UMC2265、UMC1400、UMC1254、UMC1774、MarkerM、固C1985、BNLG1160、UMC1949、UMC1667、UMC1043、PHB14704、UMC1114、BNLG1174、PMG1、PHI445613、UMC1424、固C1075、BNLG1647、UMC2258、MarkerR、UMC1495、MarkerN、麗C湧8、而C1797、麗C1265、PHI453121、MARKERE、UMC2041、MARKERG、UMC1365、MARKERF、UMC2035、UMC2294、UMC1339、麗C1433、UMC1287、UMC1607和BNLG1828。所述實(shí)施方案包括^吏用位于所列標(biāo)記任一側(cè)10、5、3、2或1厘摩處的標(biāo)記的至少一個和4壬何組合。所述實(shí)施方案還包括使用至少一個所列標(biāo)記或它們的任何組合。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括位于bin1.01、2.01、5.07、5.08、7.04、7.05、8.04、8.05、8.06、8.07、10.3和10.04的標(biāo)記用于培育改進(jìn)的植物再生的用途。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括使用位于以下標(biāo)記任一側(cè)20厘摩處的分子標(biāo)記來培育改進(jìn)的植物再生BNLG1014、UMC1254、UMC2013、UMC1792、MARKERJ、UMC2133、UMC1708、UMC2087、MARKERA、UMC1991、UMC1774、UMC2245-TA、UMC1265、UMC1934、PHI427434、UMC2305、UMC1642、UMC1433、UMC1125、UMC1858、MARKERC、UMC1170、BNGL619和UMC2131。所述實(shí)施方案包括使用位于所列標(biāo)記任一側(cè)10、5、3、2或1厘摩處的標(biāo)記的至少一個和任何組合。所述實(shí)施方案還包括使用至少一個所列標(biāo)記或它們的任何組合。本發(fā)明的實(shí)施方案包括使用位于bin1,01、1.02、2.01、2.02、2.03、2.04、3.01、3.02、3.04、4.08、4.09、5.03、5.07、5.086.01、6.05、6.06、6.07、6.08、6.09、7.04、7.05、8.03、8.04、8.05、8.06、8.07、10.01、10.02或10.03的標(biāo)記或者連同美國專利申請10/455,229(公開號US2004/0016030,January22，2004年1月22日公開)中公開的標(biāo)記，來將能提高可轉(zhuǎn)化性的基因從可轉(zhuǎn)化性較好的玉米林系漸滲到可轉(zhuǎn)化性較差的玉米林系中。所述實(shí)施方案包括使用表2A、3A、5A、6A或7A中所示的任何標(biāo)記來定位(map)與提高的可轉(zhuǎn)化性有關(guān)聯(lián)的性狀，和將它們與美國專利申請10/455,229中公開的標(biāo)記一起使用來培育可轉(zhuǎn)化性提高的玉米抹系。本發(fā)明的實(shí)施方案包括獲得T-DNA遞送效率提高的玉米植抹的方法，所述方法包括a)將第一玉米植株和第二玉米植抹進(jìn)行雜交，其中所述第一植林的T-DNA遞送效率高于所述第二植抹；b)從獲自所述雜交的細(xì)胞或從所述雜交的后期各子代的細(xì)胞獲取DNA，并與一個或多個由位于bin5.02、5.03、5.04的標(biāo)記組成的群組中的標(biāo)記進(jìn)行雜交；c)選出其中所述DNA與一個或多個所述標(biāo)記雜交的植抹，以獲得10與所述第二植株的T-DNA遞送效率相比具有更高的T-DNA遞送效率的植抹。任何這樣的用以提高T-DNA遞送效率的標(biāo)記也是本發(fā)明的實(shí)施方案它位于染色體5上的標(biāo)記umcl587和bnlg653之間且包括umcl587和bnlg653在內(nèi)。任何這樣的用以提高T-DNA遞送效率的標(biāo)記也是本發(fā)明的實(shí)施方案它位于染色體5上的標(biāo)記umcl587和bnlg653之間且包括umcl587和bnlg653在內(nèi)，并與位于染色體3上的umcl908和umc2265之間且包4舌umcl908和umc2265在內(nèi)的標(biāo)記組合使用。本發(fā)明的實(shí)施方案包括通過對與T-DNA向玉米細(xì)胞中的遞送的提高有關(guān)聯(lián)的數(shù)量性狀基因座進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，來選擇至少一個玉米植抹的方法，其中所述數(shù)量性狀基因座定位于(localizedto)由染色體5上的標(biāo)記umcl587和bnlg653界定的染色體區(qū)間，包括umcl587和bnlg653在內(nèi)，所述方法包括對所述染色體區(qū)間上的至少一個標(biāo)記進(jìn)行測定，以尋找所述數(shù)量性狀基因座；和選出所述包含所述數(shù)量性狀基因座的玉米植抹。本發(fā)明的實(shí)施方案包括通過對與T-DNA向玉米細(xì)胞中的遞送的提高有關(guān)聯(lián)的第一數(shù)量性狀基因座和第二數(shù)量性狀基因座進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，來選擇至少一個玉米植抹的方法，其中所述第一數(shù)量性狀基因座定位于由染色體5上的標(biāo)記umcl587和bnlg653界定的染色體區(qū)間，包括umcl587和bnlg653在內(nèi)；所述第二數(shù)量性狀基因座定位于由染色體3上的標(biāo)記umcl908和umc2265界定的染色體區(qū)間，包括umcl908和umc2265在內(nèi)；所述方法包括進(jìn)行測定以尋找所述第一數(shù)量性狀基因座和所述第二數(shù)量性狀基因座；和選出所述包含所述第一和第二數(shù)量性狀基因座的玉米植抹。本發(fā)明的實(shí)施方案包括獲得愈傷組織生長提高的玉米植林的方法，所述方法包括a)將第一玉米植林和第二玉米植林進(jìn)行雜交，其中所述第一植株的愈傷組織生長速度高于所述第二植抹；b)從獲自所述雜交的細(xì)胞或從所述雜交的后期各子代的細(xì)胞獲取DNA,并與一個或多個由位于bin4.07、4.08的標(biāo)記組成的群組中的標(biāo)記進(jìn)行雜交；和c)選出其中所述DNA與一個或多個所述標(biāo)記雜交的植抹，以獲得與所述第二植林的愈傷組織生長速度相比具有更高的愈傷組織生長速度的植林。任何這樣的用以提高愈傷組織生長速度的標(biāo)記也是本發(fā)明的實(shí)施方案它位于染色體4上的標(biāo)記bnlgl189和bnlgl043之間且包括bnlgl189和bnlgl043在內(nèi)。任何這樣的用以提高愈傷組織生長速度的標(biāo)記也是本發(fā)明的實(shí)施方案它位于染色體4上的標(biāo)記bnlgl189和bnlgl043之間且包括bnlgl189和bnlgl043在內(nèi)，并與位于染色體3上的umc1908和umc2265之間且包括umc1908和umc2265在內(nèi)的標(biāo)記組合使用?？赊D(zhuǎn)化性的提高可以是至少2X提高、20%提高、30%提高或50%提高。組織培養(yǎng)響應(yīng)(response)的提高，可以是II型愈傷組織形成與無愈傷組織生長或I型愈傷組織生長相比有至少2X提高、10%提高、20%提高、30%提高或50%提高。再生的提高可以是再生能力相比于不會再生成為植株的愈傷組織有至少2X提高、10%提高、20%提高、30%提高或50%提高。提高可以是因?yàn)樗_的標(biāo)記中的一個或多個或任何組合從可轉(zhuǎn)化性較好的玉米植林向可轉(zhuǎn)化性較差的玉米植抹的漸滲。標(biāo)記輔助漸滲涉及到一個或多個標(biāo)記所界定的染色體區(qū)域從一個基因組向另一個基因組轉(zhuǎn)移。該過程的初始步驟是通過基因作圖對性狀進(jìn)行定位，基因作圖是通過連鎖分析確定某基因相對于其他基因和遺傳標(biāo)記的位置的過程。連鎖作圖的基本原理是，兩個基因在染色體上越接近，它們越有可能一起被遺傳。簡單的說，可在所研究的性狀不同的兩個親本之間產(chǎn)生雜交。然后可用遺傳標(biāo)記來跟蹤所研究的性狀在該雜交的后代(常常是回交(BC1),F2或者重組近交群體)中的分將遺傳標(biāo)記與提高的可轉(zhuǎn)化性相關(guān)聯(lián)。雖然很多重要的農(nóng)藝特性是由染色體上的單一區(qū)域(也稱因座)或?qū)Ρ硇途哂兄卮笥绊懙膯我换蚩刂频?，但許多經(jīng)濟(jì)上重要的性狀如產(chǎn)量和一些形式的疾病抗性在本質(zhì)上是數(shù)量性的，涉及到幾個到許多個基因或基因座。術(shù)語數(shù)量性狀基因座或QTL用來描述基因組中的顯示對表型的定性效應(yīng)或相加效應(yīng)的區(qū)域。本文所用的QTL是指由可遺傳的遺傳標(biāo)記界定的染色體區(qū)域。本發(fā)明涉及遺傳材料在玉米中例如能夠造成植抹更容易被轉(zhuǎn)化的QTL處的漸滲。已在以下植物中鑒定出涉及植物組織培養(yǎng)和再生的QTL:小麥(BenAmer等人，P/朋fB^W/"g，114:84-85，1995;BenAmer等人，77zeorjpp/.Ge"W.，94:1047-1052，1997)、水稻(Taguchi-Shiobara等人772ew.v4p;/.95:828-833，1997;Takeuchi等人，Oop40:245-247，2000;Kwon等人，Mo/ecw/waw/Ce〃、11:64-67,2001;Kwon等人,Mo/ecw/^aw/CW&,12:103-106)、擬南芥(Schiantarelli等人，7%eor.J///.G認(rèn)t，102:335-342,2001)、大麥(Mano等人，IW"g5We臟，46:137-142，1996;Bregitzer和Campbell,Cra/41:173-179,2001)和玉米(Armstrong等人，77zeorjpp/.Ge"".，84:755-762，1992;Murigneux等人，G"e"o附e37:970-976，1994)。一般認(rèn)為，有許多QTL或染色體區(qū)域有助于T-DNA遞送過程、植物可栽培性、形成體細(xì)胞胚的能力和再生成為能育植抹的能力。此外，認(rèn)為不同的QTL參與到植物組織培養(yǎng)和植物再生的不同步驟中。更加有意義的是，鑒定出有助于植林的提高的可轉(zhuǎn)化性的QTL,并因此能夠操縱包括但不限于玉米、小麥、水稻和大麥的作物的性能。Armstrong等人早期的工作研究了使用培育(Armstrong等人，MaizeGen.Coop.Newsletter,March1，65:92-93，1991)和標(biāo)記分析(Armstrong等人，T7zeor々p/.84:755-762，1992)來產(chǎn)生被認(rèn)為比親本玉米林系更具可栽培性和可再生性的玉米林系。Armstrong等人使用了親本抹系B73和A188，B73是難以培育但農(nóng)藝性合意的林系，A188是高度可培育但農(nóng)藝性差的抹系。通過一系列的回交和自交，開發(fā)出了更為高度可培育的林系，命名為"Hi-II"種質(zhì)株系。與親13本抹系B73相比，發(fā)現(xiàn)Hi-II相對容易培育，能再生出健康的植林。對似乎與提高的可培育性有關(guān)聯(lián)的標(biāo)記的RFLP分析表明它們位于染色體l、2、3和9上。標(biāo)記的使用提示A188的染色體區(qū)域保持在B73背景中，這大概是使得子代Hi-II林系的可培育性和可再生性提高的原因。這個工作中特別有意義的是，標(biāo)記c595位于染色體9上；據(jù)認(rèn)為，與標(biāo)記c595有關(guān)聯(lián)的某主效基因或多個基因能促進(jìn)愈傷組織形成和才直4朱再生。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，其他能更精密地定位本文所鑒定的染色體區(qū)域的探針可用來鑒定雜交事件。本發(fā)明的染色體區(qū)域有助于提高的可轉(zhuǎn)化性從容易地可轉(zhuǎn)化的種質(zhì)(如Hi-II)向其他種質(zhì)(優(yōu)選優(yōu)異近交系)的漸滲。在本發(fā)明的范圍當(dāng)中，較大的連鎖塊(linkageblock)同樣可被轉(zhuǎn)移，只要染色體區(qū)域能提高合意的近交系的可轉(zhuǎn)化性。因此要強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明可用任何在遺傳上定位在相似區(qū)域的分子標(biāo)記進(jìn)行實(shí)施。才直斗勿遺4?；ゲ挪?geneticcomplement)可通過遺傳才示〗己"i普(geneticmarkerprofile)來界定，遺傳標(biāo)記鐠被認(rèn)為是基因組的"指紋"。出于本發(fā)明的目的，各標(biāo)記優(yōu)選均勻分布在整個基因組，以提高它們接近數(shù)量性狀基因組(QTL)或目的基因座的可能性?？蓪悠返谝恢材ㄈ后w進(jìn)行遺傳性遺傳標(biāo)記(inheritedgeneticmarker)的基因型分型(genotyped),以形成基因型數(shù)據(jù)庫。本文所用的"遺傳性遺傳標(biāo)記，，是單基因座處的等位基因?；蜃侨旧w上的位置，等位基因指基因的狀況；也就是說在那些基因座處的不同核苷酸序列。每個基因座的標(biāo)記等位基因組成可以是純合的或者雜合的。要通過定量評估一個或多個可用數(shù)字代表的(numericallyrepresentable)表型性狀來形成表型數(shù)據(jù)庫，這可通過如下方式來完成接觀察，或者定量評估樣品植抹的配合力。舉例說，將植林與一個或多個測樣(tester)進(jìn)行雜交。測樣可以是近交系、單雜交雜交系、雙雜交雜交系或復(fù)雜交雜交系或者任何其他通過控制雜交或自由雜交產(chǎn)生或維持的植抹集合，或者它們的任何組合。對于一些自花傳粉植物，優(yōu)選進(jìn)行直接評估而不用進(jìn)行后代測定。確定測交代中的標(biāo)記基因型，并對標(biāo)記基因座進(jìn)行定位。為通過連鎖方法定位特定的性狀，有必要建立特定染色體區(qū)域的遺傳和性狀的遺傳之間的正相關(guān)性。這對于簡單遺傳的性狀來說可能相對直截了當(dāng)。在更為復(fù)雜的遺傳的情況中，例如數(shù)量性狀，要辨別連鎖會困難得多。在這個情況中，必須使用統(tǒng)計(jì)方法來建立表型和基因型之間的相關(guān)性。這會進(jìn)一步要求對來自特定雜交的許多后代進(jìn)行檢查，因?yàn)楦鱾€基因座對總體表型都可能有小的貢獻(xiàn)。特定性狀和標(biāo)記的共遺傳或遺傳連鎖提示，它們在染色體上物理上靠近在一起。連鎖是通過分析基因和標(biāo)記在雜交中的遺傳模式來確定。為了從雜交中的遺傳標(biāo)記獲得信息，標(biāo)記必須是多態(tài)性的；也就是說，它必須以不同的形式存在，使得攜帶突變基因的染色體與具有正?；虻娜旧w可通過它們也攜帶的標(biāo)記的形式進(jìn)行區(qū)分。重組的單位是厘摩(cM)。兩個標(biāo)記如果它們在減數(shù)分裂中每100次重組1次，則它們相隔l厘摩。厘摩是一個遺傳度量而不是一個物理度量，但有用的經(jīng)驗(yàn)法則是1cM大約相當(dāng)于106bp。在減數(shù)分裂過程中，各對同源染色體會合在一起并在稱為重組的過程中交換區(qū)段。遺傳標(biāo)記離基因越遠(yuǎn)，該基因和該標(biāo)記之間發(fā)生重組的機(jī)會越多。在連鎖分析中，對特定雜交中的標(biāo)記和基因或性狀的共遺傳進(jìn)行跟蹤。計(jì)算出它們的觀察到的遺傳模式僅會偶然出現(xiàn)的可能性，即它們完全不連鎖的可能性。然后假定一定程度的連鎖重復(fù)進(jìn)行計(jì)算，確定兩個可能性的比例(無連鎖與特定程度的連鎖的比例)。這個比例表示對于(和反向)該連鎖程度的幾率，由于使用這個比例的對數(shù)，它被稱為幾率的對數(shù)(LOD)，例如LOD分?jǐn)?shù)。等于或大于3的LOD分?jǐn)?shù)例如被認(rèn)為證實(shí)基因和標(biāo)記是連鎖的。這代表兩個基因座連鎖的幾率為1000:1。使用統(tǒng)計(jì)分析(采用程序來進(jìn)行)可大大促進(jìn)連鎖15的計(jì)算。標(biāo)記分子的遺傳連鎖可通過基因定位模型來建立，所述模型例如但不限于Lander和Botstein(Ge"幼'c5,121:185-199,1989)所報(bào)道的側(cè)翼標(biāo)記模型，及基于Lander和Botstein(1989)描述的最大似然法、在(intervalmapping)模型。另外的軟件包括Qgene，第2.23版(1996)，DepartmentofPlantBreedingandBiometry,266EmersonHall,CornellUniversity,Ithaca，N.Y.)。Qgene軟件的使用是特別優(yōu)選的方法。計(jì)算出標(biāo)記的存在的最大似然估計(jì)值(MLE),結(jié)合假定沒有QTL作用的MLE,以避免假陽性。然后如下計(jì)算幾率比的log1()(LOD):LOD=log10(QTL存在時的MLE/假定沒有連鎖的QTL時的MLE)。LOD分?jǐn)?shù)本質(zhì)上表示假定QTL存在下數(shù)據(jù)出現(xiàn)的可能性會比在QTL不存在下大多少。在給定的置信度(比如95%)下避免假陽性的LOD閾值，取決于標(biāo)記的數(shù)量和基因組的長度。表示LOD閾值的圖表，在Lander和Botstein(1989)中纟合出，在Anis和Moreno-GonzAlez，P/a"f丑reed/"g,Hayward,Bosemark,Romagosa(編輯)ChapmanandHall,London,pp.314-331，1993)有進(jìn)一步的描述。也可使用另外的模型。已報(bào)道了區(qū)間定位模型的許多修改方案和替代方案，包括使用非參數(shù)方法(Kruglyak和Lander,Ge"幼'"，121:1421-1428,1995)。也可使用多元回歸方法或模型，其中性狀是在大量的標(biāo)記上進(jìn)行回歸(Jansen等人，TTzeorGe"W.，91:33-37,1995;Weber和Wricke,尸/朋f5ree幽g,Blackwell,1994)。Jansen和Stam,(G匿"a,136:1447-1455，1994)及Zeng，(G認(rèn)to,136:1457-1468,1994)報(bào)道了將區(qū)間定位模型與回歸分析相結(jié)合的方法，按該方法，表型被回歸到給定標(biāo)記區(qū)間處的單一推定QTL上，同時被回歸到多個充當(dāng)"協(xié)同因子(cofactor)"的標(biāo)記上。一般來說，協(xié)同因子的使用能減少估計(jì)的QTL位置的偏好和取樣誤差(Utz和Melchinger,P/awfSreed/wg,iVocee^/"gso/f/eiWwf/z16Netherlands,1994)，從而改進(jìn)QTL定位的精確性和效率(Zeng,1994)?？蓪⑦@些模型延伸到多環(huán)境實(shí)驗(yàn)，以分析基因型與環(huán)境的相互作用(Jansen等人，1995)。有多種不同的標(biāo)記可供用于遺傳定位。這些標(biāo)記包括RLFP限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)、同工酶、簡單序列重復(fù)(SSRs或微衛(wèi)星標(biāo)記)和單核香酸多態(tài)性(SNPs)。這些標(biāo)記是植物培育和分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。的遺傳連鎖圖語。有幾個研究者研究了多個性狀，報(bào)道了基于RFLP標(biāo)記的分子圖譜(Burr等人，C7e""/oy118:519-526,1988;Weber和Helentjaris，Ge"e"cs，121:583-5卯,1989;Stuber等人，Genetics,132:823-839,1992;Coe，Ma/zeCoopera"'o;iVews/e敝,66:127-159，1992;Gardiner等人，Ge"e"cs，134:917-930，1993;Sourdille等人，91:21-30，1996)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，玉米中的遺傳標(biāo)記是本領(lǐng)域才支術(shù)人員乂>知的，并在互聯(lián)網(wǎng)agron.missouri.edu上有定期更新。另一種類型的遺傳標(biāo)記包括擴(kuò)增的簡單序列長度多態(tài)性(SSLPs)(Williams等人，iVwc/.爿"A18:6531-6535，1990)，更常稱為簡單序列重復(fù)(SSRs)或微衛(wèi)星(Taramino和Tingey，Ge"ome,39(2):277-287,1996;Senior和Heun,Gew聽,36(5):884-889,1993)。SSRs是基因組中以眾多二核苷酸或三核苷酸重復(fù)(例如AGAGAGAG)為特征的區(qū)域。和RFLP圖譜一樣，已構(gòu)建出定位了所有IO個玉米染色體上的幾百個SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜。用可公開獲得的SNP標(biāo)記構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜也可供獲得。例如，已用SNPs定位了染色體1上的21個基因座(Tenaillon等人,尸rac.扁.^cadra乂，98(16):9161-9166,2001)，且已通過M017和B73的比較從大約700個表達(dá)的序列標(biāo)簽(tag)或基因鑒定出300多個多態(tài)性SNP標(biāo)記(Bhattramakki等人，MaizeGeneticsCoop.Newsletter74:54，2000)。17本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，有多種類型的分子標(biāo)記可用作工具來監(jiān)測遺傳情況，它們并不限于同工酶、RFLPs、SSRs和SNPs,并且技術(shù)人員還會知道，有多種檢測方法可用來跟蹤各種分子標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會認(rèn)識到，不同類型的標(biāo)記可用于進(jìn)行定位，特別是隨著技術(shù)的發(fā)展以及新型標(biāo)記和鑒定方法的確立。用SSR多態(tài)性進(jìn)行遺傳標(biāo)記作圖的方法是本領(lǐng)域公知的。SSRs是基于重復(fù)核苷酸序列中的多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，如微衛(wèi)星標(biāo)記?；赟SRs的標(biāo)記系統(tǒng)相對于可能存在復(fù)等位基因的其他標(biāo)記系統(tǒng)，在連鎖分析中可提供々艮多信息。這類標(biāo)記的另一個優(yōu)點(diǎn)是，通過使用側(cè)翼引物，SSRs的檢測可例如通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來實(shí)現(xiàn)，從而避免需要使用費(fèi)力的Southern雜交。PCR檢測是通過使用側(cè)接重復(fù)DNA的多態(tài)性區(qū)段的兩個寡核苷酸引物來進(jìn)行。如下過程的反復(fù)循環(huán)構(gòu)成了該方法的主要部分DNA熱變性，然后引物在較低溫度下與其互補(bǔ)序列退火，接著用DNA聚合酶延伸退火的引物。在擴(kuò)增后，標(biāo)記可通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳進(jìn)行評分。標(biāo)記基因型的評分是基于所擴(kuò)增的片段的大小，這個大小可通過該片段的堿基對數(shù)目來測量。雖然所用引物的變化或?qū)嶒?yàn)室程序的變化會影響所報(bào)道的片段大小，但不管所使用的具體片段或?qū)嶒?yàn)室如何，相對值應(yīng)當(dāng)保持恒定。當(dāng)比較各林系時，優(yōu)選的是所有的SSR圖語都在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。本文報(bào)道的SSR分析是在美國先鋒良種公司(PioneerHi-Bred)內(nèi)部進(jìn)行的。力口拿大魁北克省Saint-Jean-sur-Richelieu的DNALandmarks公司以合同方式向社會提供SSR服務(wù)。用于本文所報(bào)道的SSRs的引物是可公開獲得的，在互聯(lián)網(wǎng)maizegdb.org(由USDAAgriculturalResearchService;斧助)上的MaizeGeneticDatabase數(shù)據(jù)庫、Sharopova等人(PlantMol.Biol.，48(5-6):463-481)和Lee等人(PlantMol.Biol"48(5-6);453國461)中可找到，或者可從本文報(bào)道的序列構(gòu)建。引物可從可公開獲得的序列信息構(gòu)建。一些標(biāo)記信息也可從DNALandmarks公司獲得。以下給出之前沒有公開報(bào)道的標(biāo)記的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>如在MaizeGeneticDatabase中對IBM2和/或IBM2Neighborsmaps所報(bào)道，圖譜信息是通過bin編號(number)來提供。bin編號小數(shù)點(diǎn)左邊的數(shù)字表示該標(biāo)記所位于的染色體，小數(shù)點(diǎn)右邊的數(shù)字表示在該染色體上的位置。在MaizeGeneticDatabase上，還可獲得多個不同的作圖群體的圖譜位置。出于本發(fā)明的目的，可將遺傳的標(biāo)記基因型轉(zhuǎn)換成數(shù)字分?jǐn)?shù)，例如，如果在特定的基因座處有2種形式的使用特定酶的RFLP或其他標(biāo)記，分別以A和B表示，則轉(zhuǎn)換成數(shù)字分?jǐn)?shù)的二倍體互補(bǔ)物(diploidcomplements)例如是AA=2、AB=1和BB=0或者AA=1、AB=0和BB=1。分?jǐn)?shù)的絕對值并不重要。重要的是數(shù)字代號的相加特性。以上分?jǐn)?shù)與共顯性標(biāo)記有關(guān)。可給出與顯性標(biāo)記一致的類似評分系統(tǒng)。用于這些目的的具體標(biāo)記并不限于本文所公開的那批標(biāo)記，而是可包括任何類型的能提供培育如下的玉米抹系的方法的標(biāo)記和標(biāo)記諳(markerprofile):轉(zhuǎn)化效率提高的玉米林系、轉(zhuǎn)基因向天然DNA中的插入提高的玉米抹系、組織培養(yǎng)響應(yīng)提高的玉米林系或者再生效率提高的玉米才朱系。本發(fā)明提供通過使用標(biāo)記輔助培育來提高可轉(zhuǎn)化性的方法，其中對一群植抹選擇提高的可轉(zhuǎn)化性性狀。選擇工作包括探測基因組DNA，以確定是否存在遺傳連鎖于與玉米植抹中的提高的可轉(zhuǎn)化性有關(guān)聯(lián)的QTL的等位基因的標(biāo)記分子，其中QTL的各等位基因還位于玉米植抹的染色體l、2、3、4、5、6、7、8、9和10上的連鎖群上。分子標(biāo)記是一種DNA分子，它起到植物基因組的靶標(biāo)DNA分子的探針或引物的作用。F2群體是雜交種子產(chǎn)生后的自交第一代。重組近交系(RIL)(遺傳相關(guān)抹系；通?！礔s,從連續(xù)自交F2抹系向純合性發(fā)展)可用作作圖群20體。從顯性標(biāo)記獲得的信息可用RIL來最大化，因?yàn)樗械幕蜃际羌兒系幕蛘邘缀跏羌兒系?。回交群體(例如從合意的品種(輪回親本)和攜帶前者中不存在的性狀的另一品種(供體親本)之間的雜交產(chǎn)生)也可用作作圖群體?？蓪喕赜H本作出一系列的回交，以恢復(fù)其大部分的合意性狀。因此產(chǎn)生出這樣的群體，它由與輪回親本類似的個體組成，但每個個體攜帶不同數(shù)量的來自供體親本的基因組區(qū)域。如果輪回親本中的所有基因座都是純合的，且供體親本和輪回親本具有差別明顯的多態(tài)性標(biāo)記等位基因，則回交群體可用于定位顯性標(biāo)記(Reiter等人，1992)?？捎糜谧鲌D的另一有用群體是近等基因系(NIL)。NILs是通過多次回交來產(chǎn)生，多次回交產(chǎn)生出一批這樣的個體，它們在遺傳組成上幾乎相同，例外的是所需的性狀或基因組區(qū)域可用作定位群體。在用NILs作圖時，預(yù)期只有一部分的多態(tài)性基因座可定位到選定的區(qū)域。作圖還可在轉(zhuǎn)化的植抹上進(jìn)行。有許多方法可用于檢測是否存在本發(fā)明的提高的可轉(zhuǎn)化性QTLs。具體的說，與本文所界定的QTLs有遺傳連鎖的遺傳標(biāo)記會在本發(fā)明中有用途。這種標(biāo)記可在具有提高的可轉(zhuǎn)化性的玉米植抹的培育中特別有益。這通常會包括使用與本文所界定的QTLs緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，來確定目的植抹在相關(guān)基因座處的基因型。用于本發(fā)明特別有利的遺傳標(biāo)記的實(shí)例將是基于RFLPs和PCR的標(biāo)記，如基于微衛(wèi)星區(qū)域(SSRs)的標(biāo)記或基于單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的標(biāo)記。有多種標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)可用于實(shí)施本發(fā)明。這些工具不僅可用于評估標(biāo)記，子方法包括但不限于模板依賴性擴(kuò)增方法，如PCR或反轉(zhuǎn)錄酶PCR;用于監(jiān)測外源DNA在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的蛋白質(zhì)分析，包括蛋白質(zhì)印跡法和各種蛋白質(zhì)凝膠檢測方法在內(nèi)；檢查DNA特性的方法，包括DNA印跡法在內(nèi)；監(jiān)測基因表達(dá)的方法，如RNA印跡法；和其他方法，如凝膠色語法、高效液相色譜法等。培育技術(shù)利用到植物的傳粉方法。傳粉的一般方法有自花傳粉和異花傳粉兩種，如果一個花朵的花粉被轉(zhuǎn)移到同一植物的同一花朵或另一花朵，則出現(xiàn)自花傳粉，如果花粉來自不同植物上的花朵，則出現(xiàn)異花傳粉。已經(jīng)過多代的自花傳粉和類型選擇(selectedfortype)的植抹，在幾乎所有的基因座處都變得純合，產(chǎn)生出純粹的培育后代即純合才i^朱的均勻群體。在開發(fā)合適的近交系時，可使用譜系培育。特定性狀的語系培育方法涉及到將兩個基因型進(jìn)行雜交。每個基因型可具有另一基因型所缺乏的一個或多個合意的特性，或者每個基因型可對另一基因型進(jìn)行補(bǔ)充。如果兩個原始的親本基因型沒有提供所有的期望的特性，可將其他基因型包括在培育群體中。將作為這些雜交的產(chǎn)物的優(yōu)越植抹進(jìn)行自交，在每個連續(xù)世代中又得到進(jìn)步。每個連續(xù)世代因?yàn)樽曰▊鞣酆瓦x擇而變得更加同質(zhì)。通常，這個培育方法涉及到五代或更多代的自交和選擇S,—S2;S2—S3;S3—S4;S4—Ss等。自交代(S)可被認(rèn)為是子代(F)的一種類型，同樣可命名為F。至少五代后，認(rèn)為近交植抹在遺傳上是純粹的。所公開的分子標(biāo)記可用于至少一個子代或者子代S,、S2、S3、S4、Ss等的組合，以將基因從可轉(zhuǎn)化性較好的抹系漸滲到優(yōu)異但可轉(zhuǎn)化性較差的株系。培育還可涵蓋雙單倍體作物林系的使用。回交將特定的合意性狀，如本發(fā)明的提高的可轉(zhuǎn)化性QTL基因座，從一個近交系或非近交系來源轉(zhuǎn)移到缺乏該性狀的近交系。這可例如這樣來實(shí)現(xiàn)首先將優(yōu)越近交系(A)(輪回親本)與攜帶所關(guān)心的性狀的適當(dāng)基因的供體近交系(非輪回親本)雜交。然后將這個雜交的后代與優(yōu)異的輪回親本(A)回交，接著在所產(chǎn)生的后代中選擇所要從非輪回親本轉(zhuǎn)移的期望性狀。這個選擇可基于如下所述的遺傳測定，或者可基于后代植林的表型。在經(jīng)過五個或更多個回交代并對期望的特性進(jìn)行選擇后，后代對控制所轉(zhuǎn)移的特性的基因座是雜合的，但在大多數(shù)或幾乎所有其他基因方面和優(yōu)異親本一樣。將最后一個回交代自交(selfed)或同胞交配(sibbed),以產(chǎn)生出所轉(zhuǎn)移的基因的純培育后代，所22述基因在本發(fā)明的情況中是給植抹提供提高的可轉(zhuǎn)化性的基因座。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，回交轉(zhuǎn)化的過程可定義為包括以下各步驟的過程(a)將含有一個或多個期望的基因、DNA序列、區(qū)域或元件(如本發(fā)明所確定的QTLs、標(biāo)記或染色體區(qū)域)的第一基因型植林，與缺乏所述期望的基因、DNA序列或元件的第二基因型植林進(jìn)行雜交；(b)選擇出一個或多個含有期望的基因、DNA序列、區(qū)域或元件的后代植林；(c)將該后代植株與第二基因型植林進(jìn)行雜交；和(d)重復(fù)步驟(b)和(c)，目的是將所述期望的基因、DNA序列、區(qū)域或元件從第一基因型植林轉(zhuǎn)移到第二基因型植林。這些步驟可以涉及任何組合的或任何數(shù)目的(anycombinationoranynumberof)基因、DNA序列、區(qū)域或元件，如本發(fā)明所確定的QTLs、標(biāo)記或染色體區(qū)域。特定DNA元件或一組元件向植物基因型中的漸滲定義為回交轉(zhuǎn)化過程的結(jié)果。其中漸滲了DNA序列的植抹基因型可稱為回交轉(zhuǎn)化基因型、抹系、近交系或雜交系。類似地，缺乏所述期望的DNA序列的植林基因型可稱為未轉(zhuǎn)化基因型、林系、近交系或雜交系。在培育過程中，可用與提高的可轉(zhuǎn)化性連鎖的遺傳標(biāo)記來輔助培育，目的是產(chǎn)生具有提高的可轉(zhuǎn)化性的玉米植抹。應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明包括包含一個或任何數(shù)目的本發(fā)明QTLs、染色體區(qū)域或標(biāo)記的轉(zhuǎn)化。因此，當(dāng)"提高的可轉(zhuǎn)化性轉(zhuǎn)化植抹"這個術(shù)語用在本發(fā)明情形中時，這包括該檔^朱應(yīng)用本發(fā)明所確定的標(biāo)記或染色體區(qū)域所進(jìn)行的任何轉(zhuǎn)化。因此可將回交方法用于本發(fā)明，來通過用一個、兩個、三個或任何組合的或任何數(shù)目的提高的可轉(zhuǎn)化性基因座轉(zhuǎn)化任何近交系，將本發(fā)明的提高的可轉(zhuǎn)化性性狀轉(zhuǎn)移到該近交系。合適的輪回親本的選擇是成功的回交程序的一個重要步驟?；亟怀绦虻哪繕?biāo)是改變或替換原始近交系中的性狀或特性。為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可將輪回近交系的一個或多個基因座用來自非輪回親本的期望基因進(jìn)行修飾或替換，同時保持基本上所有的其余的期望遺傳基因，由此保持原始近交系的期望的生理和形態(tài)構(gòu)造。特定非輪回親本的選擇取決于回交的目的，在本發(fā)明的情況中目的將是加入提高的可轉(zhuǎn)化性性狀以改進(jìn)農(nóng)藝上重要的品種。準(zhǔn)確的回交方案要取決于所要改變的特性或性狀，以確定適當(dāng)?shù)臏y定方案。雖然當(dāng)所要轉(zhuǎn)移的特性是顯性等位基因時回交方法可簡化，但隱性等位基因也可能被轉(zhuǎn)移。在這個情況中，可能需要引入對后代的測定，以確定期望的特性是否已被成功轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的情況中，可以測定在回交過程中產(chǎn)生的后代抹系的可轉(zhuǎn)化性，也可使用標(biāo)記輔助培育來基于標(biāo)記而不是可見性狀對抹系進(jìn)行選擇?；亟涣硗饪捎脕韺⒁粋€或多個單基因性狀轉(zhuǎn)化到具有本發(fā)明的提高的可轉(zhuǎn)化性的近交系或雜交系中。已鑒定出許多這樣的單基因性狀，它們沒有在新近交系的開發(fā)中被經(jīng)常進(jìn)行選擇，但可通過回交技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。單基因性狀可以是或可以不是轉(zhuǎn)基因的，這些性狀的實(shí)例包括但不限于雄性不育，蠟質(zhì)淀粉，除草劑抗性，細(xì)菌性、真菌性或病毒性疾病的抗性、昆蟲抗性、雄性生育力、提高的營養(yǎng)品質(zhì)、工業(yè)應(yīng)用、產(chǎn)量穩(wěn)定性和產(chǎn)量提高。這些基因通常通過細(xì)胞核遺傳。這一點(diǎn)的一些已知例外是雄性不育的基因，這些基因中有些通過細(xì)胞質(zhì)遺傳，但仍作為單基因性狀起作用。在單基因作為顯性性狀起作用的情況中，可應(yīng)用直接選擇。一個實(shí)例可能是除草劑抗性性狀。對于這個選擇過程，初次雜交的后代在進(jìn)行回交前先噴上除草劑。噴除草劑能除去任何沒有期望的除草劑抗性特性的植林，只有那些具有除草劑抗性基因的植株被用于后續(xù)的回交中。然后對所有另外的回交代都重復(fù)這個過程。蠟質(zhì)特性是隱性性狀的一個實(shí)例。在這個實(shí)例中，從第一回交代(BC1)產(chǎn)生的后代必須進(jìn)行生長和自交。然后對來自BC1植林的自交種子進(jìn)行測定，以確定哪些BC1植抹攜帶負(fù)責(zé)蠟質(zhì)性狀的隱性基因。在其他的隱性性狀中，可能需要另外的后代測定，例如生長出另外的各代如BC1S1，來確定哪些植林?jǐn)y帶隱性基因。均勻的玉米植抹雜交系的開發(fā)要求純合近交植林的開發(fā)、這些近交植株的雜交和對雜交的評估。譜系培育和輪回選擇是用以從培育群體產(chǎn)生近交植抹的培育方法的實(shí)例。這些培育方法將來自兩個或更多個近交植抹或各種其他廣泛來源(broad-basedsource)的遺傳背景結(jié)合到培育庫(breedingpool)中，從該庫通過自交和期望表型的選擇產(chǎn)生出新的近交植林。將新的近交系與其他近交植抹進(jìn)行雜交，對這些雜交所得的雜交系進(jìn)行評估，以確定它們中哪些具有商業(yè)潛力。單交雜交玉米品種是兩個近交植株的雜交，每個近交植抹都具有能補(bǔ)充對方基因型的基因型。第一代的雜交后代稱為F"優(yōu)選的F!雜交系比它們的近交親本更具活力。這個雜交活力或雜種優(yōu)勢(heterosis)表現(xiàn)在許多的多基因性狀中，包括明顯改進(jìn)的更高產(chǎn)量、更好的莖干、更好的根、更好的均勻性及更好的昆蟲和疾病抗性。在雜交系的開發(fā)中，只尋求Fi雜交植抹。F!單交雜交系是當(dāng)兩個近交植林進(jìn)行雜交時產(chǎn)生的。雙交雜交系是這樣產(chǎn)生的四個近交植抹成對雜交(AxB和CxD)，然后兩個F,雜交系再進(jìn)行雜交(AxB)x(CxD)。作為最后步驟，玉米培育通常將兩個近交系進(jìn)行組合，以產(chǎn)生出具有各性狀的期望混合的雜交系。從雜交系中的兩個近交系獲得各性狀的正確混合可能是困難的，特別是當(dāng)各性狀不與表型特性有關(guān)聯(lián)時。在常規(guī)的培育方案中，譜型培育和^"回選擇培育方法被用來開發(fā)具有期望的性狀的新近交系。玉米培育方案試圖通過對植抹進(jìn)行自花傳粉和從群體中選出合意的植抹來開發(fā)出這些近交系。近交系與雜交系相比往往具有較差的活力和較低的產(chǎn)量；但是近交系雜交的后代常常顯示活力。兩個近交系之間的雜交的后代常稱為Fi雜交系。在傳統(tǒng)的培育中，對F,雜交系進(jìn)行評估以確定它們是否顯示出農(nóng)藝上重要和合意的性狀。合意的農(nóng)藝性狀的鑒定通常是由培育師憑經(jīng)驗(yàn)技巧來進(jìn)行。植物培育師為他要種植植物的地區(qū)鑒定期望的性狀，并選擇出看來能將(一個或多個)合意性狀傳遞到雜交系的近交系。25具有本發(fā)明的提高的可轉(zhuǎn)化性的雜交植抹，可通過將具有提高的可轉(zhuǎn)化性的植抹與缺乏提高的可轉(zhuǎn)化性的第二植抹進(jìn)行雜交來產(chǎn)生。本文所公開的將植抹"雜交"以提供相對于起始植林來說具有提高的可轉(zhuǎn)化性的雜交植抹，定義為這樣的技術(shù)通過將起始近交系與包含提高的可轉(zhuǎn)化性性狀的第二近交植林進(jìn)行雜交，來將提高的可轉(zhuǎn)化性虧1入到雜交系中。為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，通常會進(jìn)行如下步驟(a)種植包含本文所定義的提高的可轉(zhuǎn)化性的第一近交系和第二近交系供體植抹種子；(b)使第一和第二親本檔4朱的種子生長成開花的植;昧；(c)讓植林之間發(fā)生異花傳粉；和(d)收獲帶雌花的親本植抹上產(chǎn)生的種子。轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列引入到植抹中的方案，可根據(jù)要進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型(即是單子葉植物還是雙子葉植物)力口以變動。將核苷^列引入到植物細(xì)胞中并隨后插入到植物基因組中的合適方法，包4舌孩i注射(Crossway等人(1986)5/ofec/m々w&s,4:320-334)、電穿孔(Riggs等人(1986)尸rac.A^/.」cadSc/.t/&4，83:5602-5606)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Townsend等人，U.S.PatNo.5,563,055)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人(1984)五M5(9/，3:2717-2722)和彈道顆粒加速(ballisticparticleacceleration)(參見例如Sanford等人，美國專利4,945,050;Tomes等人(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment(通過微粒轟擊將DNA直接轉(zhuǎn)移到完整植物細(xì)胞中),"載于尸/a^CW/,Hwwe,朋d(>gawCW仏wFw"(i調(diào)e齒/MeAo成Gamborg和Phillips(編輯)(Springer-Verlag,Berlin)和McCabe等人(1988)5/o阮/zwo/ogy，6:923-926)。另參見Weissinger等人(1988)爿朋.Wev.22:421-477;Sanford等人(1987)尸"Wcw/她iSc/ewce朋drec/ww/ogy，5:27-37(洋蔥)；Christou等人(1988)尸/a"f尸/^/o/"87:671-674(大豆)；McCabe等人(1988)5/o/rec/"o/ogy，6:923-926(大豆)；Finer和:175-182(大豆)；Singh等人(1998)772eor^p/.Ge"W.，96:319-324(大豆)；Datta等人(19卯)所ofec/2"o/ogy,8:736-740(水稻)；Klein等人(1988)尸rac.A^/.爿cat/.OSL4，85:4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)所o&c/z"o/ogy'6:559-563(玉米)；Tomes,美國專利5,240,855;Buising等人，美國專利5,322,783和5,324,646;Tomes等人(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment(通過微粒轟擊將DNA直接轉(zhuǎn)移到完整植物細(xì)胞中)，"載于尸/a"/CW/，n^we,"m/6Vg朋Cw/加w尸i/"(i調(diào)e齒/Me/Zzo(is,ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等人(1988)P/a"f尸/^/o/"91:440-444(玉米)；Fromm等人(19卯)S/otec/z"o/(^gy'8:833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren等人(1984)A^wre(Zowfo"」，311:763-764;Bowen等人，美國專利5,736,369(谷類)；Bytebier等人(1987)尸rac.A^/.5W,WS^，84:5345-5349(百合科)；DeWet等人(1985)載于777e五x/e"Vwe"to/M<3"—/加'owo/Ovw/e7Ymw&s，Chapman等人編輯(Longman,NewYork),第197-209頁(花粉)；Kaeppler等人(19卯)P/a"ZCe〃iepo"s，9:415-418和Ka印pler等人(1992)772eor.Ge"".，84:560-566(須(whisker)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D，Halluin等人(1992)尸/a"fCW/，4:1495-1505(電穿孔)；Li等人(1993)尸/a"/Ce〃12:250-255及Christou和Ford(1995)爿""a^。/5otow乂75:407-413(水稻)；Ishida等人(1996)7Vort^e5/ofec/"o/ogv,14:745-750;US5,731,179;US5,591,616;US5，641，664和美國專利5,981,840(玉米,通過農(nóng)桿菌)，這些文獻(xiàn)和專利的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。植物中(inplanta)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化在以下文獻(xiàn)和專利中有公開Bechtold，N.,J.Ellis,G.Pelletier(1993)C.R.，^c"dPaWsh/e5W,316:1194-1199;Bechtold,N.，B.等人(2000)GWWcs，155:1875-1887;Bechtold,N.和G.Pelletier(1998)Me^oAMo/5z'o/.，82:259-266;Chowrira,G.M.,V.Akella和P.F.Lurquin.(1995)Mo/.腺ec/wo/,，3:17-23;Clough,S.J.和A.F.Bent.(1998)PlantJ"16:735-743;Desfeux,C.，S.J.Clough和A.F.Bent.(2000)P/a"fP/^s/o/.,123:895-904;Feldmann,K.A.和M.D.Marks.(1987)Mo/.Ge".G聰"208:1-9;HuC.-Y,和L.Wang.(1999)InVitroCellDev.Biol.-Plant35:417-420;Katavic,V.G.W.Haughn，D.Reed,M.Martin,L.Kunst(1994」Mo/.Ge".Ge"a.,245:363-370;Liu,F.，等人(1998)ActaHort467:187-192;Mysore,K.S.,C.T.Kumar和S.B.Gelvin.(2000)PlantJ.，21:9-16;Touraev,A.，E.Stoger,V.Voronin和E.Heberle-Bors.(1997)PlantJ.,12:949-956;Trieu,A.T.等人(2000)戶/a"f丄22:531-541;Ye,G.N.等人(1999)尸/a"f/,19:249-257;Zhang,JU.等人(2000)C/2em歷o/.，7:611-621。以上文獻(xiàn)和專利的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。各種類型的植物組織可用于轉(zhuǎn)化，如胚細(xì)胞、分生組織細(xì)胞、葉細(xì)胞或者衍自胚細(xì)胞、葉細(xì)胞或分生組織細(xì)胞的愈傷組織細(xì)胞。但是，任何轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或組織都可使用。各種用于提高轉(zhuǎn)化頻率的方法也可使用。這種方法公開于WO99/61619;WO00/17364;WO00/28058;WO00/37645;美國系列號09/496,444;WO00/50614;US01/44038和WO02/04649。以上專利的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。玉米的轉(zhuǎn)化可遵循已經(jīng)確立的用以將DNA引入到不成熟玉米胚的盾片(scutellum)中的轟擊轉(zhuǎn)化方案(參見例如Tomes等人，DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment(通過微粒轟擊將DNA直接轉(zhuǎn)移到完整植物細(xì)胞中)，第197-":3頁，載于PlantCell,TissueandOrganCulture,FundamentalMethods.O.L.Gamborg和G.C.Phillips(編輯).Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork,1995)。細(xì)胞如下進(jìn)行轉(zhuǎn)化將玉米不成熟胚(長度大約l-1.5mm)培養(yǎng)到含有N6鹽、Erikkson維生素、0，69g/l月f氨酸、2mg/12,4-D和3%蔗糖的培養(yǎng)基上。在暗處28。C下溫育4-5天后，將胚從第一培28養(yǎng)基移出并培養(yǎng)到含有12%蔗糖的相似培養(yǎng)基上。讓胚在轉(zhuǎn)化前適應(yīng)這個培養(yǎng)基3小時。采用顆粒轟擊對不成熟胚的盾片表面進(jìn)行轟擊。胚是用Bio-Rad的PDS-1000氦槍進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每個樣品一槍，使用650PSI安全隔膜(rupturedisk)。每槍遞送的DNA平均為0.1667pg。在轟擊后，將所有的胚保持在標(biāo)準(zhǔn)的玉米培養(yǎng)基(N6鹽、Erikkson維生素、0.69g/l脯氨酸、2mg/12,4-D、3°/。蔗糖)上2-3天，然后轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的基于N6的培養(yǎng)基。將平板在暗處28。C下保持，觀察集落恢復(fù)(colonyrecovery)情況，每兩到三星期轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基。恢復(fù)的集落和植抹基于所引入的標(biāo)記基因所賦予的可選擇或可篩選表型(即除草劑抗性、熒光或花青素產(chǎn)生)進(jìn)行評分，或者通過PCR和Southern分析進(jìn)行分子表征來評分。玉米的轉(zhuǎn)化還可用美國專利5,981,840所描述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA遞送方法來進(jìn)行，但作以下改動。將農(nóng)桿菌在含有l(wèi)OOjuM大觀霉素的液體極限A培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期。將胚浸泡在經(jīng)調(diào)整獲得5x108cfWml的有效濃度的對數(shù)期農(nóng)桿菌懸浮液中。將胚感染5分鐘，然后在含有乙酰丁香酮的培養(yǎng)基上暗處20°C下共培養(yǎng)7天。7天后，將胚轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(MS鹽與N6常量營養(yǎng)物、lmg/L2，4-D、lmg/L麥草畏、20g/L蔗糖、0.6g/L葡萄糖、lmg/L硝酸銀和100mg/L羧千西林)中。將平板在暗處28。C下保持，觀察菌落恢復(fù)情況，每兩到三星期轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基?；謴?fù)的集落和植抹基于所引入的標(biāo)記基因所賦予的可選擇或可篩選表型(即除草劑抗性、熒光或花青素產(chǎn)生)進(jìn)行評分，或者通過PCR和Southern分析進(jìn)4于分子表征來評分。本文所用的"再生"是指從植物細(xì)胞(例如植物原生質(zhì)體、愈傷組織或外植體)生長出植抹的過程。認(rèn)為任何從中可再生出能育植林的細(xì)胞都可用作受體細(xì)胞。愈傷組織可從包括但不限于不成熟胚、籽苗頂端分生組織、小孢子等的組織來源產(chǎn)生。那些能夠作為愈傷組織增殖的細(xì)胞也是遺傳轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植林的實(shí)際轉(zhuǎn)化方法和材料，例如各種培養(yǎng)基和受體靶標(biāo)細(xì)胞、不成熟胚的轉(zhuǎn)化和隨后的能育轉(zhuǎn)基因植抹的再生，在美國專利6,194,636中有公開，該專利通過引用結(jié)合到本文中。本文所用的"轉(zhuǎn)基因"生物是這樣的生物，它的基因組已例如通過轉(zhuǎn)化或重組摻入外來遺傳材料或天然遺傳材料的額外拷貝而進(jìn)行了改變。轉(zhuǎn)基因生物可以是植物、哺乳動物、真菌、細(xì)菌或病毒。本文所用的"轉(zhuǎn)基因植抹"是指這樣的植株或從其衍生的任何后續(xù)各代的后代植抹，該植株或后代植抹的DNA含有在同一林系的非轉(zhuǎn)基因植抹中原先不存在的引入的外源DNA。轉(zhuǎn)基因植抹可另外含有被轉(zhuǎn)化的植抹所固有的序列，但其中外源DNA已進(jìn)行了改變以改變基因的表達(dá)水平或模式。本發(fā)明設(shè)想了使用編碼能有效地給植物賦予期望的特性(例如提高的產(chǎn)率)的蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)物的多核苷酸的用途。這種多核苷酸用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員^^知的方法裝配在重組DNA構(gòu)建物中。構(gòu)建轉(zhuǎn)化用的DNA構(gòu)建物和載體的有用技術(shù)是GATEWAY⑧克隆技術(shù)(可獲自InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,美國力口州)，該4支術(shù)^f吏用來自噬菌體X載體構(gòu)建的整合酶/att系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性重組酶LR克隆反應(yīng)，而不是限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶。LR克隆反應(yīng)在美國專利5,888,732和6，277,608及美國專利申請案2001283529、2001282319和20020007051中有公開，所有這些專利和專利申請案通過引用結(jié)合到本文中。GATEWAY⑥克隆技術(shù)操作手冊(同樣由Invitrogen提供)還提供了有關(guān)如何將任何期望的RNA常規(guī)克隆到包含有效的(operable)植物表達(dá)元件的載體中的簡明指導(dǎo)。本文所用的"外源DNA"指這樣的DNA，它并不是天然起源于含有它的特定構(gòu)建物、細(xì)胞或生物。用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的重組DNA構(gòu)建物要包含外源DNA,往往還包含下文所述的其他元件。本文所用的"轉(zhuǎn)基因"是指這樣的外源DNA，它已被摻入到宿主基因組中，或者能夠在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制和能夠引起一個或多個細(xì)胞產(chǎn)物的表30達(dá)。示例性的轉(zhuǎn)基因會給宿主細(xì)胞或從中再生的植林提供相對于相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植抹而言新型的表型。轉(zhuǎn)基因可通過遺傳轉(zhuǎn)化直接51入到植抹中，或者可從已轉(zhuǎn)化有外源DNA的之前任何一代植林遺傳而來。本文所用的"基因"或"編碼序列，，是指從中轉(zhuǎn)錄出RNA分子的DNA序列。RNA可以是編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的mRNA，起到反義分子的作用的RNA,或者結(jié)構(gòu)RNA分子如tRNA、rRNA或snRNA，或者其他RNA。本文所用的"表達(dá)"指由DNA分子進(jìn)行的包括轉(zhuǎn)錄和翻譯在內(nèi)的胞內(nèi)過程的組合，DNA分子例如是產(chǎn)生多肽的結(jié)構(gòu)基因或者產(chǎn)生RNA分子的非結(jié)構(gòu)基因。本文所用的"啟動子"是指DNA序列中的、引發(fā)RNA從DNA的轉(zhuǎn)錄所必需的區(qū)域；這個區(qū)域也可稱為"5'調(diào)節(jié)區(qū)"。啟動子位于待翻譯的DNA的上游，具有充當(dāng)RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域和具有與其他因子一起工作來促進(jìn)RNA轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。更具體的說，植物中的基本啟動子包含與轉(zhuǎn)錄的起始有關(guān)聯(lián)的規(guī)范區(qū)域(canonicalregion),如CAAT盒和TATA盒。TATA盒元件通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約20-35核苦酸處。CAAT盒元件通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約40-200核苷酸處。這些基本啟動子元件的位置導(dǎo)致包含翻譯ATG起始位點(diǎn)上游的一些核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物的合成。RNA中的ATG上游的區(qū)域通常稱為5'非翻譯區(qū)或5'UTR?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，來產(chǎn)生基本啟動子(即包含從CAAT盒到翻譯起始位點(diǎn)的序列的區(qū)域)與其他上游啟動子元件的組合，以提高或者改變啟動子活性或特異性。本領(lǐng)域公知，重組DNA構(gòu)建物除了包含啟動子外通常還包含其他調(diào)節(jié)元件，如但不限于3'非翻譯區(qū)(如聚腺普酸化位點(diǎn))、轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號肽和標(biāo)記基因元件。例如參見美國專利6,437,217(公開了玉米RS81啟動子)，美國專利5,641,876(公開了水稻肌動蛋白啟動子)，美國專利6，426，446(公開了玉米RS324啟動子)，美國專利6,429,362(公開了玉米PR-1啟動子)，美國專利6,232,526(^Hf了玉米A3啟動子)，美國專利6,177,611(V^開了組成型玉米啟動子，美國專利6,433,252(公開了玉米L3油質(zhì)蛋白啟動子)，美國專利6,429,357(公開了水稻肌動蛋白2啟動子和內(nèi)含子，美國專利5,837,848(公開了根特異性啟動子)，美國專利6,084,089(公開了冷可誘導(dǎo)啟動子)，美國專利6,294,714(公開了光可誘導(dǎo)啟動子)，美國專利6,140,078(公開了鹽可誘導(dǎo)啟動子)，美國專利6,252,138(公開了病原體可誘導(dǎo)啟動子)，美國專利6,175,060(公開了磷缺乏可誘導(dǎo)啟動子，美國專利申請公開說明書2002/0192813A1(公開了可用于設(shè)計(jì)有效的之物表達(dá)載體的5'元件、3'元件和內(nèi)含子元件)，美國專利申請系列號09/078,972(公開了薏苡辛(coixin)啟動子)和美國專利申請系列號09/757,089(公開了玉米葉綠體葉綠體啟動子)，所有這些專利都通過引用結(jié)合到本文中。可對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的測定，以證實(shí)外源DNA的穩(wěn)定整合。有用的選擇標(biāo)記基因包括如下基因賦予對抗生素如卡那霉素(nptll)、潮霉素B(aphIV)和慶大霉素(aac3和aacC4)的抗性的基因，或者賦予對除草劑如草銨膦(bar或pat)和草甘磷(EPSPS;CP4)的抗性的基因。這種可選擇標(biāo)記的實(shí)例在美國專利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中有說明，所有這些專利通過引用結(jié)合到本文中。也可采用能夠讓人視覺鑒定轉(zhuǎn)化子的可篩選標(biāo)記，例如表達(dá)有色蛋白或熒光蛋白如螢光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)的基因，或者表達(dá)P-葡糖醛酸酶的基因，或者已知有各種顯色底物的uidA基因(GUS)。本發(fā)明的一個重要優(yōu)點(diǎn)在于，它提供了用以有效轉(zhuǎn)化選定的基因和再生具有期望的農(nóng)藝性狀的植物方法和組合物。這樣，產(chǎn)量和其他農(nóng)藝性狀測定方案可在商業(yè)化過程的較早期進(jìn)行。選定用于按照本發(fā)明在植物宿主中進(jìn)行表達(dá)的基因的選擇，要取決于轉(zhuǎn)化的目的。作物轉(zhuǎn)化的一個主要目的是向該作物加入商業(yè)上合意的性狀、農(nóng)藝上重要的性狀或最終產(chǎn)品性狀。這種性狀包括但不限于除草劑抗性或耐受性、昆蟲抗性或耐受性、疾病抗性或耐受性(病毒性、細(xì)菌性、真菌性、線蟲性疾病)、應(yīng)激耐受性和/或抗性(例如對干旱、高溫、寒冷、凍害、水分過多、鹽應(yīng)激和氧化應(yīng)激的抗性或耐受性)、提高的產(chǎn)量、食品或飼料含量和價值、物理外觀、雄性不育、脫水(drydown)、抗伏性(standability)、豐產(chǎn)力(prolificacy)、淀粉含量和質(zhì)量、油含量和質(zhì)量、蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量、氨基酸組成等等。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可用超過一個外源(選定)基因來進(jìn)行。本文所用的"外源編碼區(qū)"或"選定編碼區(qū)"是在相同情形下通常不在宿主基因組中存在的編碼區(qū)。這樣意味著編碼區(qū)可從與宿主基因組不同的物種分離得到，或者從宿主基因組分離得到，但被可操作地連接(operablylinked)到一個或多個與未經(jīng)改變的天然基因中所存在的調(diào)節(jié)區(qū)不同的調(diào)節(jié)區(qū)。還可使用獨(dú)特的轉(zhuǎn)基因編碼載體，或者使用摻入兩個或更多個編碼序列的單一載體，將兩個或更多個外源編碼區(qū)在單個轉(zhuǎn)化事件中提供。任何兩個或更多個任何性狀(description)的轉(zhuǎn)基因都可按需進(jìn)行采用，所述轉(zhuǎn)基因例如那些賦予除草劑抗性、昆蟲抗性、疾病(病毒性、細(xì)菌性、真菌性、線蟲性疾病)抗性或干旱抗性、雄性不育、脫水、抗伏性、豐產(chǎn)性、淀粉特性、油含量和質(zhì)量的轉(zhuǎn)基因，或者提高產(chǎn)量或營養(yǎng)質(zhì)量的轉(zhuǎn)基因。除了用按照本發(fā)明制備的構(gòu)建物直接轉(zhuǎn)化特定的植物基因型如具有提高的可轉(zhuǎn)化性的優(yōu)異林系外，轉(zhuǎn)基因植株還可通過將具有本發(fā)明構(gòu)建物的植林與缺乏該構(gòu)建物的第二植林進(jìn)行雜交來產(chǎn)生。例如，可通過雜交將選定編碼區(qū)引入到特定的之物品種中，而不需老是直接轉(zhuǎn)化該給定品種的植林。因此，本發(fā)明不僅涵蓋直接從已按本發(fā)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生的植抹，也包括這種植抹的后代。本文所用的術(shù)語"后代，，表示親本植抹的按本發(fā)明制備的任何一代的子代，其中該后代包含按本發(fā)明制備的構(gòu)建物。本文所公開的將植林"雜交"以提供相對于起始植林來說具有一個或多個加入的轉(zhuǎn)基因的雜交植抹，定義為這樣的技術(shù)通過將起始植抹與包含本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的供體植抹進(jìn)行雜交，來將本發(fā)明轉(zhuǎn)基因引入到檔j朱中。為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，通常會例如進(jìn)33行如下步驟(a)種植第一親本植林(起始植林)和第二親本植抹(包含本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的供體植抹)的種子；(b)使第一和第二親本植林的種子生長成開花的植抹；(c)用第二親本植抹的花粉對第一親本植林的花進(jìn)行傳粉；和(d)收獲在具有已授粉花朵的親本植抹上產(chǎn)生的種子?；亟辉诒疚闹卸x為包括以下步驟的過程(a)將含有期望的基因、DNA序列或元件的第一基因型的植林與缺乏所述期望的基因、DNA序列或元件的第二基因型的植抹進(jìn)行雜交；(b)選出一個或多個含有期望的基因、DNA序列或元件的后代植株；(c)將該后代植林與第二基因型的植抹進(jìn)行雜交；和(d)重復(fù)步驟(b)和(c)，目的是使所述期望的基因、DNA序列或元件從第一基因型的植抹轉(zhuǎn)移到第二基因型的植抹。中漸滲了DNA序列的植林基因型可稱為回交轉(zhuǎn)化基因型、抹系、近交系或雜交系。類似地，缺乏所述期望的DNA序列的植株基因型可稱為未轉(zhuǎn)化基因型、林系、近交系或雜交系。以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表的是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)能在本發(fā)明的實(shí)施中很好起作用的技術(shù)，因此可被認(rèn)為構(gòu)成實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開說明書應(yīng)能認(rèn)識到，可不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍，對所公開的具體實(shí)施方案作出許多改變，且這些改變?nèi)垣@得相同或相似的結(jié)果。更具體的說，顯而易見的是，可將某些在化學(xué)上和生理上都相關(guān)的物質(zhì)替代本文所述的物質(zhì)，同時還會獲得相同或相似的結(jié)果。認(rèn)為所有這些對于本領(lǐng)域」汰術(shù)人員來說顯而易見的相似替代物和修改方案，都落入所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明精神、范圍和概念。本說明書中提到的所有出版物和專利申請案都通過引用結(jié)合到本文中，猶如專門地和個別地指出每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埌竿ㄟ^引用結(jié)合到本文中。以下實(shí)施例是以舉例說明的方式提供，而不是以限制本發(fā)明的方式提供。實(shí)施例1衍自Hi-n的雙單倍體抹系的可轉(zhuǎn)化性分析Hi-II是一種容易培育和再生的玉米雜交系(Armstrong等人1991和1992)。它已被廣泛用于通過轟擊(Gordon-Kamm等人1990;Songstad等人1996;和O,kennedy等人1998)和農(nóng)桿菌(Zhao等人1998和2001;Frame等人2002)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。雙單倍體植抹是通過用單倍體誘導(dǎo)系RWS對Hi-II植林進(jìn)行傳粉來衍生的。這些雙單倍體植抹含有兩套僅衍自Hi-II親本的純合染色體。父本RSW沒有對雙單倍體植林作出任何染色體貢獻(xiàn)。由于Hi-II是衍自兩個不同親本即親本A和親本B的雜交系，衍自Hi-II的雙單倍體植抹是母本減數(shù)分裂過程中基因重組和分離的結(jié)果。每個雙單倍體植抹代表獨(dú)特的重組，它們各自在遺傳上互相不同。這些雙單倍體將每個獨(dú)特的雙單倍體植抹進(jìn)行自花傳粉，以產(chǎn)生雙單倍體種子。從一個自交植林獲得的雙單倍體種子形成純合抹系。通過這個過程，從被認(rèn)為是Fl植抹的Hi-II植林產(chǎn)生出20個雙單倍體林系。種植這20個雙單倍體抹系的種子，對得自這20個雙單倍體林系的每一個的不成熟胚進(jìn)行可轉(zhuǎn)化性的評估。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化方法(Zhao等人2001)來評估這些株系的可轉(zhuǎn)化性。將從這些雙單倍體抹系分離的不成熟胚(傳粉后9-12天)用帶有超雙元載體的農(nóng)桿菌進(jìn)行感染，T-DNA含有可選擇的標(biāo)記35基因和可見的標(biāo)記基因。評估包括l)愈傷組織的類型(I型或II型或I型和II型的混合型等等)；2)遞送到胚中的T-DNA的水平(基于農(nóng)桿菌感染后可見的標(biāo)記基因在胚中的瞬時表達(dá)的水平)；3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的頻率(基于愈傷組織對選擇劑的抗性和可見的標(biāo)記基因在同一愈傷組織中的表達(dá))；4)植林再生的頻率(基于可選擇的標(biāo)記基因和可見的標(biāo)記基因在再生的植株中的表達(dá)，以證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植株從推定轉(zhuǎn)化的愈傷組織再生的頻率)。評估的結(jié)果在表l中列出。對于每個類別，用4個等級來度量結(jié)果。愈傷組織類型1=高質(zhì)量的II型愈傷組織，2=具有非胚胎發(fā)生組織的低質(zhì)量的II型愈傷組織，3=1型和11型愈傷組織的混合型，4=(高質(zhì)量的)1型愈傷組織，5=低質(zhì)量的I型愈傷組織，6=無愈傷組織應(yīng)答。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的頻率(％):1=15%或以上，2=5-14%，3=1-4%,4=0%。植株再生頻率(％):1=80%或以上，2=50-79%，3=1-49%,4=0%。表l.衍自Hi-II的雙單倍體品系的可轉(zhuǎn)化性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>林系1、2、12、13和17顯示高水平的T-DNA遞送，高頻率的愈傷組織轉(zhuǎn)化和高頻率的植抹再生。這五個抹系高度可轉(zhuǎn)化。抹系14顯示中等的T-DNA遞送和高頻率的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和植抹再生，它仍被認(rèn)為是高度可轉(zhuǎn)化的植抹。抹系3、6、8顯示高的T-DNA遞送，但沒有回收到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織。由于這些株系沒有產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織，不能評估植林再生。實(shí)施例2通過分析來自Hi-II的雙單倍體抹系鑒定與可轉(zhuǎn)化性有關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。用這20個衍自Hi-II的雙單倍體林系鑒定與可轉(zhuǎn)化性有關(guān)聯(lián)的標(biāo)記?？刹捎貌煌愋偷姆肿訕?biāo)記來定位會顯著影響可轉(zhuǎn)化性的基因。在本研究中，采用簡單序列重復(fù)(或者SSR或微衛(wèi)星)標(biāo)記。SSR標(biāo)記是基于PCR的DNA標(biāo)記。將電泳后顯示的PCR產(chǎn)物的大小，用作所研究基因座的個體區(qū)別特性。有很多公眾可獲得的SSR分子標(biāo)記可供進(jìn)4亍》匕類研究，它們可在互耳關(guān)網(wǎng)上(agron.missouri.edussr.html〃mapfiles)找到。只有能區(qū)分該群體的兩個親本的標(biāo)記才是有用的，因?yàn)檫@些標(biāo)記會跟蹤可能存在于分離群體中的交互等位基因(alternateallele)之一。將Hi-II的兩個親本即親本A和親本B用SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選。然后將多態(tài)性標(biāo)記選擇用于該群體。在選擇標(biāo)記時，考慮基因組覆蓋率、標(biāo)記質(zhì)量(穩(wěn)固性)和信息含量(由PIC測量)。37標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)性分析方法和結(jié)果SSR標(biāo)記與可轉(zhuǎn)化性性狀的統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性在表2A-2B和表3A-3B中顯示。每個表格的第1、2、3列給出SSR標(biāo)記的名稱、它們的染色體編號和它們在染色體上的位置(基于IBM遺傳連鎖圖譜、以圖譜距離厘摩或cM表示)。表2A和表3A的第4列中給出的樣本量是在性狀-標(biāo)記關(guān)聯(lián)性測定中實(shí)際使用的雙單倍體抹系的數(shù)目。性狀和標(biāo)記之間的統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性是用在SASVersion9.0(SASInstitute,Cary,NorthCarolina)上執(zhí)行的一般線性統(tǒng)計(jì)模型進(jìn)行測量。該模型測量可歸因于標(biāo)記等位基因狀態(tài)變化的總性狀表型變異的比例。比例越大表示性狀值和標(biāo)記等位基因狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)。用F檢驗(yàn)來測量統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(第5列)。將在P值小于10%(PO.l)下顯著的F檢驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為是顯著關(guān)聯(lián)性的證據(jù)。通過F檢驗(yàn)測定了總共239個標(biāo)記的每一個和性狀之間的成對關(guān)聯(lián)性，只有顯示顯著關(guān)聯(lián)性的標(biāo)記(第6歹'J)在表2A和表3A中報(bào)道。表2B和3B顯示等位基因狀態(tài)(第5列)、具有等位基因狀態(tài)的雙單倍體林系的數(shù)目(樣本量，第6歹'J)及它們的性狀值的平均值(第7歹'J)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)(第8列)。性狀平均值和性狀標(biāo)準(zhǔn)偏差(第7、8列)是用所有具有相同等位基因狀態(tài)的雙單倍體抹系計(jì)算出的。對于所有我們報(bào)道的標(biāo)記，不同等位基因狀態(tài)的各雙單倍體抹系之間在平均性狀值上都明顯有大的差異。我們的關(guān)聯(lián)性測定表明，有1個SSR標(biāo)記即圖譜位置91cM處的染色體5上標(biāo)記D與穩(wěn)定轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)有關(guān)聯(lián)(表2A、2B)，7個位于四個不同染色體上的SSR標(biāo)記與植抹再生有關(guān)聯(lián)(表3A和3B)。表2A.與Hi-II雙單倍體林系的轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)有顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記染色體位置標(biāo)i己名稱樣本量F值P值91標(biāo)記D163.150.1038表2B.表2A的等位基因類型和等位基因表型平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表3A.與Hi-II雙單倍體抹系的植林再生有顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表3B.表3A的等位基因類型和等位基因表型平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例3衍自Hi-IIxGaspeFlint的雙單倍體林系的可轉(zhuǎn)化性分析用Hi-II作為母本，用GaspeFlint(—種近交系)作為父本產(chǎn)生Fl雜交系。將這個雜交系的各植林用單倍體誘導(dǎo)系RSW進(jìn)行傳粉，產(chǎn)出單倍體不成熟胚。將這些單倍體不成熟胚在組織培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織。將愈傷組織用染色體加倍劑如秋水仙堿或拿草特(pronamide)進(jìn)行處理，產(chǎn)生雙單倍體愈傷組織。用這些雙單倍體組織產(chǎn)生雙單倍體植^^。將雙單倍體植林進(jìn)行自花傳^J分，產(chǎn)生雙單倍體種子。衍自每個單一單倍體胚的種子產(chǎn)生雙單倍體林系。對這些雙單倍體抹系中的50個評估可轉(zhuǎn)化性。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化方法(Zhao等人2001)評估這些抹系的可轉(zhuǎn)化性。將從這些雙單倍體林系分離的不成熟胚(傳粉后9-12天)用帶有超雙元載體的農(nóng)桿菌進(jìn)行感染，T-DNA含有可選擇的標(biāo)記基因和其他基因。評估包括l)愈傷組織的類型(I型或II型或I型和II型的混合型等等)；2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的頻率(基于愈傷組織對選擇劑的抗性)；3)植抹再生的頻率(基于可選擇的標(biāo)記基因在再生的植林中的表達(dá)，以證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植抹從推定轉(zhuǎn)化的愈傷組織再生的頻率)。評估的結(jié)果在表4中列出。對于每個類別，用4個等級來度量結(jié)果。愈傷組織類型1=高質(zhì)量的II型愈傷組織，2=具有非胚胎發(fā)生組織的低質(zhì)量的II型愈傷組織，3=1型和II型愈傷組織的混合型，4=高質(zhì)量的I型愈傷組織，5=低質(zhì)量的I型愈傷組織，6=無愈傷組織應(yīng)答。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的頻率(％):1=15%或以上，2=5-14%,3=1-4%,4=0%。植4朱再生頻率(％):1=80%或以上，2=50-79%，3=1-49%,4=0%。表4.衍自Hi-IIxGaspeFlint的雙單倍體抹系的可轉(zhuǎn)化性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實(shí)施例4通過分析來自Hi-IIxGaspeFlint的雙單倍體林系鑒定與可轉(zhuǎn)化性有關(guān)聯(lián)的標(biāo)^己用SSR標(biāo)記來鑒定基因組中能提高可轉(zhuǎn)化性的有關(guān)聯(lián)區(qū)域。兩親本Hi-II和GaspeFlint用所有的SSR產(chǎn)生標(biāo)記進(jìn)行評估，并鑒定了多態(tài)性標(biāo)記。選擇一套平均分布在整個基因組中的標(biāo)記，這些標(biāo)記還是具有穩(wěn)固性和高PIC(多態(tài)性信息含量)值。然后將這些標(biāo)記用從衍自Hi-IIXGaspeFlint雜交的雙單倍體群體的葉子材料提取的DNA進(jìn)行測定。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以找到從任一親本遺傳得到的特征性堿基對。標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)性分析方法和結(jié)果SSR標(biāo)記與可轉(zhuǎn)化性性狀的統(tǒng)計(jì)相關(guān)性在表5A-5B、表6A-6B和表7A-7B中報(bào)道。每個表格的第1、2、3列給出SSR標(biāo)記的名稱、它們的染色體編號和它們在染色體上的位置(以圖譜距離厘摩或cM表示)。用于本實(shí)施例的關(guān)聯(lián)性分析的遺傳圖譜和一套SSR標(biāo)記與實(shí)施例2相同。表5A、6A和7A的第4列中給出的樣本量是在性狀-標(biāo)記42關(guān)聯(lián)性測定中實(shí)際使用的雙單倍體抹系的數(shù)目。性狀和標(biāo)記之間的統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性用實(shí)施例2所用的同一統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行測量。該方法測量可歸因于標(biāo)記等位基因狀態(tài)變化的總性狀表型變異的比例。比例越大表示性狀值和標(biāo)記等位基因狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)。用F檢驗(yàn)來測量統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(第5列)。將在P值小于10%(P<0.1)下顯著的F檢驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為是顯著統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性的證據(jù)。通過F檢驗(yàn)測定了總共239個標(biāo)記的每一個和性狀之間的成對關(guān)聯(lián)性，只有顯示顯著關(guān)聯(lián)性的標(biāo)記(第6歹'J)在表5A、6A和7A中報(bào)道。表5B、6B和7B顯示等位基因狀態(tài)(第5列)、具有等位基因狀態(tài)的雙單倍體林系的數(shù)目(樣本量，第6歹'j)及它們的性狀值的平均值(第7列)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)(第8列)。性狀平均值和性狀標(biāo)準(zhǔn)偏差(第7、8列)是用所有具有相同等位基因狀態(tài)的雙單倍體4朱系計(jì)算出的。對于所有我們報(bào)道的標(biāo)記，不同等位基因狀態(tài)的各雙單倍體抹系之間在平均性狀值上都明顯有大的差異。我們的關(guān)聯(lián)性測定鑒定出17個與愈傷組織類型有關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記(表5A、5B),34個與愈傷組織轉(zhuǎn)換百分?jǐn)?shù)有關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記(表6A、6B)和17個與Hi-IIxGaspeFlint群體的植抹再生有關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記(表7A和7B)。表5A.與Hi-IIxGaspeFlint雙單倍體株系的愈傷組織類型有顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記染色體位置標(biāo)記名稱樣本量F值P值1213UMC1254433.730.031330UMC1774365.670.021399UMC1797443.010.06229UMC1265353.330.0831PHI453121413.270.084142標(biāo)記E458.400.014174UMC2041469.430.004195標(biāo)記G312.420.0943<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表7A.與Hi-IIxGaspeFlint雙單倍體抹系的植抹再生有顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表7B.表7A的等位基因類型和等位基因表型平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>非常相似。釆用農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化頻率在43.5°/。(用bar作為選擇基因)到53,9%(用GAT作為選擇基因)之間。采用槍轟擊，轉(zhuǎn)化頻率為35%。PHWWD的轉(zhuǎn)化效率與Hi-II的轉(zhuǎn)化效率相當(dāng)。因此，為了分析起見，假定PHWWD具有來自Hi-II的所有負(fù)責(zé)T-DNA感染、組織培養(yǎng)性狀和轉(zhuǎn)化效率的遺傳成分。PH09B是美國專利5,859,354中描述的優(yōu)異玉米抹系。PH09B具有非常低的轉(zhuǎn)化效率。采用農(nóng)桿菌，PH09B的轉(zhuǎn)化頻率為0%,Hi-IIxPH09B的Fl的轉(zhuǎn)化頻率低于0.3%。用分子標(biāo)記來分析PHWWD的遺傳成分。將450個顯示在PH09B和Hi-II之間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記用于這個分析。通過使用標(biāo)記，估計(jì)出PHWWD基因組中有約39%來自Hi-n，約61%來自PH09B。標(biāo)記數(shù)據(jù)表明了10個玉米染色體的每一個上的不同部分的染色體區(qū)域的來源(來自PH09B或Hi-II)。表8.PHWWD的SSR概況數(shù)據(jù)Bin才示i己名4爾堿基對1umcl0413271umcl354309.651.01phi056255.31.01umc腦1171.01umcl177107.71.01umcl269344.4751.01umcl484211.51.01umc201273.8251.01umc2224354.6951.03umc簡117.6751.04umcl452360.91.04umc2112311.51.04umc2217163.751.05umcl244348.27551<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>用作父本，產(chǎn)生F1種子。接著，種植F1種子，所產(chǎn)生的F1植抹的抽穗絲(silk)用來自單倍體誘導(dǎo)系RWS-GFP(GFP是能產(chǎn)生可見的綠色熒光蛋白的標(biāo)記基因)(美國專利申請案11/298,973)的花粉進(jìn)行傳粉。從這些F1穗(ear)分離不成熟胚，放在胚拯救培養(yǎng)基(rescuemedium)上。在熒光顯微鏡下，一些胚由于GFP表達(dá)顯示綠色，還有一些胚由于缺乏GFP表達(dá)顯示正常的胚顏色。那些缺乏GFP表達(dá)的胚是單倍體胚。使這些單倍體不成熟胚在含有染色體加倍劑如秋水仙^5咸或拿草特的培養(yǎng)基上發(fā)芽。將發(fā)芽的小植林移植到盆子中的土壤，在溫室下生長。當(dāng)這些植林產(chǎn)生花粉和抽穗絲時，使這些植林自花傳粉以產(chǎn)生種子。從每個雙單倍體植林產(chǎn)生的種子是純合的，認(rèn)為是雙單倍體種子。技術(shù)細(xì)節(jié)在美國專利申請案11/532,921中描述。通過這個過程，從超過658個雙單倍體植抹產(chǎn)生了種子。將衍自單個雙單倍體植抹的所有后代指稱為雙單倍體抹系。PHWWD含有61%的PH09B遺傳背景，因此PHWWD和PH09B之間雜交的Fl代應(yīng)含有80%的PH09B基因組。衍自這些Fl種子的雙單倍體抹系中的平均PH09B背景也應(yīng)為約80%。這些雙單倍體抹系的遺傳成分與PHWWDxPH09B的F2代相當(dāng)。PHWWD中的39%的Hi-II遺傳成分隨才幾分布在所有這些658個雙單倍體抹系中。每個雙單倍體抹系通過遺傳重組含有不同比例的該39%Hi-II背景。這提供了用以定位負(fù)責(zé)玉米遺傳轉(zhuǎn)化的遺傳基因座的理想群體。用分子標(biāo)記來分析這658個雙單倍體抹系的每一個的遺傳構(gòu)成。分子標(biāo)記數(shù)據(jù)顯示，這658個雙單倍體抹系具有PH09B遺傳背景的正態(tài)分布模式。這些雙單倍體抹系中的PH09B背景在65%-95%之間。數(shù)據(jù)證實(shí)，通過單倍體技術(shù)產(chǎn)生的這658個雙單倍體^^朱系，就像衍自Fl自花傳粉的F2群體一樣，提供了遺傳成分的隨機(jī)分布。將這些雙單倍體林系在田間種植。每個株系種植一排(約20個植林)，對衍自每個雙單倍體抹系的植株從小植抹階段到成熟階段進(jìn)行均勻表型的評估。關(guān)注的表型特性包括植林形狀、植林高度、穗高度、抽穗絲顏色、穗狀雄花(tassel)形狀、花粉嚢(anther)顏色、成熟曰期、穗軸(cob)顏色和仁(kernel)顏色等。用這些數(shù)據(jù)證實(shí)這658個雙單倍體株系是純合的。通過這些過程，構(gòu)建了用以定位與玉米可轉(zhuǎn)化性有關(guān)聯(lián)的遺傳基因座的群體。實(shí)施例6對這些雙單倍體抹系進(jìn)行遺傳可轉(zhuǎn)化性的表型分析對這658個雙單倍體抹系評估其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的可轉(zhuǎn)化性及一般組織培養(yǎng)特性。將來自每個雙單倍體株系的種子種植在溫室中，所產(chǎn)生的植抹進(jìn)行自花傳粉以產(chǎn)生不成熟的仁。從每個雙單倍體林系分離不成熟胚，以開始評估過程。通常，每個雙單倍體抹系選用大約50個不成熟胚進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的評估，和每個雙單倍體林系選用大約20個不成熟胚進(jìn)行沒有農(nóng)桿菌感染情況下的組織培養(yǎng)表征。從在溫室中隨同這些雙單倍體抹系一起生長的9個Hi-II植林和13個PHWWD植抹分離不成熟胚，用作農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化評估和沒有農(nóng)桿菌感染情況下的組織培養(yǎng)表征的對照。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方案在美國專利5,981,840和Zuo-yuZhao,WeiningGu,TishuCai,LauraTagliani,DaveHondred，DianeBond,SherylSchroeder,MarjorieRudert和DorothyPierce;"Highthroughputgenetictransformationmediatedbyy4gro6acten'wmrt/w咖c/ewsinmaize(通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米高通量遺傳轉(zhuǎn)化)"；MolecularBreeding,8(4):323-333，2001這篇發(fā)表文章中有描述。農(nóng)桿菌細(xì)胞中的T-DNA含有兩個標(biāo)記基因-區(qū)動作為可見標(biāo)記的GFP基因的玉米遍在蛋白(Ubi)啟動子和驅(qū)動作為選擇標(biāo)記的bar基因的35S啟動子。將馬鈴薯STLSl基因的第二內(nèi)含子插入到編碼區(qū)中產(chǎn)生內(nèi)含子-GFP,以防止農(nóng)桿菌細(xì)胞中的GFP表達(dá)。61完全評估了15個性狀。這15個性狀分成三大組。組l;農(nóng)桿菌感染的胚，包括A)T-DNA遞送，B)愈傷組織引發(fā)頻率，C)愈傷組織類型和質(zhì)量，D)愈傷組織生長速度，E)愈傷組織轉(zhuǎn)化頻率，F(xiàn))再生質(zhì)量和G)再生頻率。組2;非農(nóng)桿菌感染的胚，包括H)愈傷組織引發(fā)頻率，I)愈傷組織類型和質(zhì)量，J)愈傷組織應(yīng)答頻率，K)愈傷組織生長速度，L)再生質(zhì)量和M)再生頻率。組3:將農(nóng)桿菌感染的胚和非農(nóng)桿菌感染的胚進(jìn)行結(jié)合，包括N)農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答(愈傷組織引發(fā)頻率)和O)農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答(愈傷組織應(yīng)答頻率)。在這15個性狀中，有11個性狀(B-D、F-M)是組織培養(yǎng)相關(guān)性狀，4個性狀(A、E、N和O)與農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞的相互作用有關(guān)聯(lián)。對這些性狀進(jìn)行詳細(xì)評估，對各個雙單倍體株系都記錄每個評估情況。用于轉(zhuǎn)化評估的農(nóng)桿菌感染不成熟胚A.T-DNA遞送接受了T-DNA的不成熟胚的能力，是基于農(nóng)桿菌感染不成熟胚后可見的標(biāo)記基因GFP在不成熟胚中的瞬時基因表達(dá)。農(nóng)桿菌感染不成熟胚后第3天，對不成熟胚中的GFP表達(dá)進(jìn)行評分。將來自一個雙單倍體抹系的所有胚一起評分取平均分。來自Hi-II和PHWWD的不成熟胚用作陽性對照，來自PH09B的不成熟胚用作陰性對照。分?jǐn)?shù)1=高T-DNA遞送，分?jǐn)?shù)2=中等T-DNA遞送，分?jǐn)?shù)3=低T-DNA遞送，分?jǐn)?shù)4=極低T-DNA遞送，分?jǐn)?shù)5=無T-DNA遞送。這些分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)中等T-DNA遞送陽性對照(Hi-II和PHWWD)定義為中等T-DNA遞送，任何在其胚上顯示相似的GFP斑點(diǎn)(spot)的雙單倍體62抹系也評為中等T-DNA遞送。高T-DNA遞送不成熟胚上的GFP斑點(diǎn)比Hi-II和/或PHWWD多大約30%或以上定義為高T-DNA遞送。低T-DNA遞送不成熟胚上的GFP斑點(diǎn)比Hi-II和/或PHWWD少30-50%定義為低T-DNA遞送。極低T-DNA遞送每個不成熟胚上只有少數(shù)GFP斑點(diǎn)(每個胚上不到10個微小斑點(diǎn))定義為極低T-DNA遞送。無T-DNA遞送不成熟胚上沒有可見的GFP斑點(diǎn)定義為無T-DNA遞送。B.愈傷組織引發(fā)頻率農(nóng)桿菌感染和共培育后，將胚在含有除草劑選擇劑的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培育。每兩星期將胚進(jìn)行次培養(yǎng)(sub-cultured)。在第6星期結(jié)束時計(jì)算愈傷組織引發(fā)頻率。愈傷組織引發(fā)頻率是引發(fā)愈傷組織應(yīng)答的胚的數(shù)目除以每個雙單倍體抹系的胚培育物的總數(shù)目。C.愈傷組織類型和質(zhì)量在玉米組織培育中，明確定義了兩種主要的愈傷組織類型即I型和II型。一般來說，I型愈傷組織是密實(shí)和生長緩慢的愈傷組織，1I型愈傷組織是易碎和生長快速的愈傷組織。Hi-II胚產(chǎn)生非常易碎和快速生長的胚胎發(fā)生II型愈傷組織，而PH09B胚產(chǎn)生低頻率的I型愈傷組織。愈傷組織的質(zhì)量是基于以下進(jìn)行評分從每個雙單倍體抹系的一群胚產(chǎn)生的愈傷組織的均勻性、愈傷組織在培養(yǎng)基上的可維持性(maintainability)和愈傷組織的胚胎發(fā)生能力。在農(nóng)桿菌感染后第9個星期進(jìn)行評分。分?jǐn)?shù)1=高質(zhì)量II型，分?jǐn)?shù)2=中等質(zhì)量II型，分?jǐn)?shù)3=1型63和II型混合型，分?jǐn)?shù)4=I型，分?jǐn)?shù)5=低質(zhì)量愈傷組織，分?jǐn)?shù)6=無愈傷組織應(yīng)答。這些分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)高質(zhì)量II型快速生長、易碎和均勻的II型，類似于Hi-II或PHWWD愈傷組織。中等質(zhì)量II型非胚胎發(fā)生愈傷組織小于30°/。的II型，但對于轉(zhuǎn)化來說仍是良好的II型愈傷組織。I型和II型混合型I型愈傷組織為30%-50%,II型愈傷組織為50-70%。一^L來說，該愈傷組織仍適于轉(zhuǎn)化。I型如果超過50%的愈傷組織是1型，將它評為I型。低質(zhì)量愈傷組織如果愈傷組織具有大量的非可再生組織(超過總愈傷組織的70%)，如生根組織或水樣組織(waterytissue),將它評為低質(zhì)量愈傷組織。無愈傷組織應(yīng)答如果胚不能引發(fā)愈傷組織或者引發(fā)但短時間后停止，將它評為無愈傷組織應(yīng)答。D.愈傷組織生長速度愈傷組織生長速度是通過胚胎發(fā)生組織培育進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化的重要因素之一。在細(xì)胞分裂過程中，DNA被復(fù)制，外來DNA(轉(zhuǎn)基因)可摻入到植抹基因組中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。在農(nóng)桿菌感染后第9個星期進(jìn)行愈傷組織生長速度的評分。愈傷組織生長速度是基于每個雙單倍體株系分離到的所有的胚的愈傷組織的平均大小。來自Hi-II和PHWWD的胚的平均愈傷組織大小用作比4交標(biāo)準(zhǔn)。分?jǐn)?shù)1=非?？?，分?jǐn)?shù)2=快，分?jǐn)?shù)3=中等，分?jǐn)?shù)4=慢，分?jǐn)?shù)5=非常慢。這些分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)非?？煊鷤M織的平均大小比Hi-II和PHWWD愈傷組織大6420。/。或以上?？炫cHi-II和PHWWD的愈傷組織相似。慢愈傷組織的平均大小比Hi-II和PHWWD小40%-80%。中等介于快和慢之間。非常慢愈傷組織的平均大小比Hi-II和PHWWD小80%以上，包括沒有愈傷組織應(yīng)答的胚在內(nèi)。E.愈傷組織轉(zhuǎn)化頻率穩(wěn)定愈傷組織轉(zhuǎn)化是基于農(nóng)桿菌感染后第9星期時可見的標(biāo)記基因GFP在愈傷組織中的表達(dá)來測定。分?jǐn)?shù)為產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織(GFP+)的胚的數(shù)目除以受感染的胚的總數(shù)。F.再生質(zhì)量植林再生能力是植物遺傳轉(zhuǎn)化的另一重要因素。植物的胚發(fā)生涉及兩個主要步驟。植抹再生的第一個步驟是愈傷組織轉(zhuǎn)化成體細(xì)胞胚，第二個步驟是體細(xì)胞胚發(fā)芽長成小植林。用再生質(zhì)量來評估這兩個主要步驟。在再生培養(yǎng)基上培育穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織后，測量再生質(zhì)量的兩個標(biāo)準(zhǔn)是l)愈傷組織能多容易和多快地轉(zhuǎn)化成體細(xì)胞胚和形成小檔^朱，2)—個胚衍生的愈傷組織能產(chǎn)生多少小植抹。分?jǐn)?shù)l=高質(zhì)量，分?jǐn)?shù)2=中等質(zhì)量，分?jǐn)?shù)3=低質(zhì)量，分?jǐn)?shù)4=無再生。這些分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)高質(zhì)量在再生培養(yǎng)基上培育后第二個星期產(chǎn)生小植抹，衍自一個胚的組織產(chǎn)生5個或更多個小植株。中等質(zhì)量在再生培養(yǎng)基上培育后2-3個星期產(chǎn)生小植林，衍自一個胚的組織產(chǎn)生1-5個小植抹。低質(zhì)量在再生培養(yǎng)基上培育后3個星期以后產(chǎn)生小植抹，衍65自一個胚的組織產(chǎn)生1-5個小檔^朱。無再生在再生培養(yǎng)基上培育后沒有小植林產(chǎn)生。G.再生頻率定義為再生成為小植抹的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化愈傷組織事件的數(shù)目除以在再生培養(yǎng)基上培育的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化愈傷組織事件的總數(shù)。沒有農(nóng)桿菌感染情況下的組織培養(yǎng)表征H.愈傷組織引發(fā)頻率每個雙單倍體抹系選取20個胚在沒有農(nóng)桿菌感染情況下在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培育，每2個星期進(jìn)行次培養(yǎng)。在第4個星期計(jì)算愈傷組織引發(fā)頻率。愈傷組織引發(fā)頻率在培育的第4個星期以引發(fā)愈傷組織的胚的數(shù)目除以從每個雙單倍體株系培育的胚的總數(shù)來計(jì)算。I.愈傷組織類型和質(zhì)量對其進(jìn)行兩次評分，第一次在培育開始的第4個星期，第二次在第8個星期。同樣使用農(nóng)桿菌感染胚的評分標(biāo)準(zhǔn)對非感染的胚進(jìn)行評分。J.愈傷組織應(yīng)答頻率每個雙單倍體抹系選取20個胚在沒有農(nóng)桿菌感染情況下在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培育，每2個星期進(jìn)行次培養(yǎng)。愈傷組織應(yīng)答頻率在培育的第8個星期以產(chǎn)生愈傷組織的胚的數(shù)目除以從每個雙單倍體株系培育的胚的總數(shù)來計(jì)算。K.愈傷組織生長速度每個雙單倍體林系選取20個胚在沒有農(nóng)桿菌感染情況下在傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培育。分別在培育的第4個星期和培育的第8個星期，將得自每個雙單倍體株系的愈傷組織在天平上稱重兩次，然后用以下公式計(jì)算愈傷組織生長速度。侖你妙"4虔—第8星期的愈傷組織重量一第4星期的愈傷組織重量愈傷JU、生長速度第4星期的愈傷組織重量分?jǐn)?shù)1=非?？?，分?jǐn)?shù)2=快，分?jǐn)?shù)3=中等，分?jǐn)?shù)4=慢，分?jǐn)?shù)5=非常慢。Hi-II和PHWWD的胚的愈傷組織生長速度用作評分對照。這些分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)非?？?比Hi-II和PHWWD的愈傷組織生長速度大10%的愈傷組織生長速度評為分?jǐn)?shù)1?？?等于Hi-II和PHWWD的愈傷組織生長速度或比Hi-II和PHWWD的愈傷組織生長速度大1-9°/。的愈傷組織生長速度評為分?jǐn)?shù)2。中等=比Hi-II和PHWWD的愈傷組織生長速度小40%以內(nèi)的愈傷組織生長速度評為分?jǐn)?shù)3。慢=比Hi-II和PHWWD的愈傷組織生長速度小41-70%的愈傷組織生長速度評為分?jǐn)?shù)4。非常慢=比Hi-II和PHWWD的愈傷組織生長速度小70%以上的愈傷組織生長速度評為分?jǐn)?shù)5。L.再生質(zhì)量:同以上(F.)。M.再生頻率:同以上(G.)。67另兩個性狀同時涉及農(nóng)桿菌感染的胚和非農(nóng)桿菌感染的胚。N.農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答-IN:由于農(nóng)桿菌是植物病原體，來自一些基因型的玉米不成熟胚顯示對農(nóng)桿菌的超敏應(yīng)答。農(nóng)桿菌感染后，胚可能被農(nóng)桿菌殺死，這些胚不能產(chǎn)生健康的愈傷組織。這是限制農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的最重要因素之一。將沒有進(jìn)行農(nóng)桿菌感染的胚的愈傷組織形成頻率與進(jìn)行農(nóng)桿菌感染的胚進(jìn)行比較，可提供量度特定植抹基因型對農(nóng)桿菌感染的超敏性的數(shù)據(jù)。由于在非農(nóng)桿菌感染胚培育中記錄了兩個愈傷組織形成頻率一個是在胚的培育引發(fā)后第4個星期時記錄，另一個是在胚培育后第8個星期時記錄，因此有兩個比較。第一個是將非農(nóng)桿菌感染胚的培育的第4個星期時的愈傷組織形成頻率與農(nóng)桿菌感染胚進(jìn)行比較；這稱為農(nóng)桿菌超敏應(yīng)HN。第二個是將非農(nóng)桿菌感染胚的培育的第8個星期時的愈傷組織形成頻率與農(nóng)桿菌感染胚進(jìn)行比較；這稱為農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答-R。農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答-IN二非感染胚在第4星期的愈傷組織引發(fā)％—感染胚的愈傷組織引發(fā)％非感染胚在第4星期的愈傷組織引發(fā)％如果農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答-IN:1,意味著這個雙單倍體株系對農(nóng)桿菌感染的超^:性最高。如果農(nóng)桿菌超專文應(yīng)答-IN-O，意味著這個雙單倍體抹系對農(nóng)桿菌感染沒有超敏性。1和0之間的任何數(shù)字表示不同程度的超敏性。O.農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答-R:農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答-11=非感染胚在第8星期的愈傷組織引發(fā)％—感染胚的愈傷組織引發(fā)％非感染胚在第8星期的愈傷組織引發(fā)％68如果農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答-IN-1，意味著這個雙單倍體株系對農(nóng)桿菌感染的超敏性最高。如果農(nóng)桿菌超敏應(yīng)答-^=0,意味著這個雙單倍體抹系對農(nóng)桿菌感染沒有超敏性。1和0之間的任何數(shù)字表示不同程度的超敏性。在表型分析工作中，從658個雙單倍體^f朱系收集了上述15個性狀的數(shù)據(jù)。農(nóng)桿菌感染胚性狀-A:T-DNA遞送<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>性狀-B:愈傷組織引發(fā)％<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>性狀-C:愈傷組織類型和質(zhì)量<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>*由于在這些雙單倍體抹系中沒有從不成熟胚產(chǎn)生愈傷組織，因此沒有這些抹系的植林再生數(shù)據(jù)。性狀-G:再生％<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>非農(nóng)桿菌感染胚性狀-H:第4個星期時的愈傷組織引發(fā)％<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>性狀-I:愈傷組織類型和質(zhì)量<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>性狀-J:第8個星期時的愈傷組織應(yīng)答°/0<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>染胚的愈傷組織引發(fā)頻率的差異(CallusInitiation—Pent—Diff)、非感染胚和感染胚的愈傷組織類型和質(zhì)量的差異(Callus一Type_quality_Diff)和非感染胚和感染胚的再生頻率的差異(Reg—Pcnt—Diff)。這些相關(guān)性在下表9中列出。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>表9中的分析結(jié)果表明，T-DNA遞送這個性狀與其他組織培育相關(guān)性狀沒有關(guān)聯(lián)。愈傷組織轉(zhuǎn)化頻率與愈傷組織引發(fā)頻率、愈傷組織類型和質(zhì)量和愈傷組織生長速度等高度關(guān)聯(lián)。所有其他的組織培育相關(guān)性狀在一定程度上相關(guān)聯(lián)。實(shí)施例7用分子標(biāo)記對這些雙單倍體抹系進(jìn)行基因型分型由于PHWWD有31。/。的染色體區(qū)域來自Hi-II和61。/。來自PH09B,且PHWWD的遺傳轉(zhuǎn)化能力與Hi-II相同或相似；假定負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化的遺傳成分位于PHWWD中的這31%的Hi-II染色體區(qū)域。所有PHWWD和PH09B之間的多態(tài)性區(qū)域也位于這31%的Hi-II區(qū)域當(dāng)中。對這658個雙單倍體抹系的標(biāo)記分析集中在這31%的Hi-II染色體區(qū)域。將之前描述的筒單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記用于這658個雙單倍體抹系的基因型分型。對該群體的兩親本PH09B和PHWWD進(jìn)行篩選以鑒定多態(tài)性標(biāo)記。將這兩個親本之間的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)一步用于該群體的SSR分析。將涉及基因組覆蓋率(genomecoverage)的多態(tài)性標(biāo)記和標(biāo)記的質(zhì)量考慮在內(nèi)。將4-6個周齡的每個籽苗的葉盤(leafdisk)收集在96孔板中。用RoboticSystem提取DNA。進(jìn)行了SSR基因型分型。實(shí)施例8進(jìn)行數(shù)量性狀基因座(QTL)分析以定位可轉(zhuǎn)化性基因座使用Pioneer專有的遺傳圖譜(PHD圖譜)和上述的表型數(shù)據(jù)，在WindowsQTLCartographer版本2.5(WangS.,C,J.Basten和Z.-B.Zeng,2007;WindowsQTLCartographer2.5,DepartmentofStatistics,NorthCarolinaStateUniversity,Raleigh,NC.(互聯(lián)網(wǎng)〃statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)執(zhí)行單標(biāo)記和復(fù)合區(qū)間定位(CIM),以;險測影響每個性狀的QTLs。0.05顯著性水平下的閾LOD(Logarithmic^ds)分?jǐn)?shù)以300個排列進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)估計(jì)(Churchill，G.A.和75R.W.Doerge.1994.Empiricalthresholdvaluesforquantitativetraitmapping(數(shù)量性狀定位的經(jīng)驗(yàn)閾值).Genetics138:963-971)。用WindowsQTLCartographer中的默認(rèn)設(shè)置值進(jìn)行ATL分析。將標(biāo)記凝:據(jù)轉(zhuǎn)換成IBM2+2005Neighbors圖譜位置(可公開獲得)。通過對這些雙單倍體株系的QTL定位，將這15個性狀(A-O)定位在幾個染色體區(qū)域中。以下列出這些性狀。A.T-DNA遞送B.愈傷組織引發(fā)％-受感染C愈傷組織類型和質(zhì)量-受感染D.愈傷組織生長速度-受感染E.轉(zhuǎn)換％F.再生質(zhì)量-受感染G.再生％-受感染H.愈傷組織引發(fā)％-無農(nóng)桿菌I.愈傷組織類型和質(zhì)量-無農(nóng)桿菌J.愈傷組織應(yīng)答％-無農(nóng)桿菌K.愈傷組織生長速度-無農(nóng)桿菌L.再生質(zhì)量-無農(nóng)桿菌M.再生％-無農(nóng)桿菌N.農(nóng)桿菌超敏性-INO.農(nóng)桿菌超敏性-R通過QTL定位，將遺傳控制這13個性狀的基因座定位在染色體1、3、4和5的區(qū)域上。這些區(qū)域可在下表10中總結(jié)。表10.通過QTL定位被定位到IBM2+2005Neighbors上的可轉(zhuǎn)化性性狀。染色體側(cè)翼標(biāo)記(名稱，圖譜位置和性狀最大LOD76<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>為驗(yàn)證QTL定位的結(jié)果，選擇了五個性狀進(jìn)行基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)性定位。對于基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)性定位，使用基于條件可能性的定位工具GPA(GeneralPedigreeAssociation)(GuopingShu,BeiyanZengandOscarSmith,2003;DetectionPowerofRandom,Case-Control,andCase-ParentControlDesignsforAssociationTestsandGeneticMappingofComplexTraits:Proceedingsof15thAnnualKSUConferenceonAppliedStatisticsinAgriculture.15:191-204)。用于關(guān)聯(lián)性定位的這五個性狀是A.T-DNA遞送E.轉(zhuǎn)化％H.愈傷組織引發(fā)％-無農(nóng)桿菌I.愈傷組織類型和質(zhì)量-無農(nóng)桿菌J.愈傷組織應(yīng)答°/。-無農(nóng)桿菌下表11A-11E列出通過關(guān)聯(lián)性定位鑒定出的染色體區(qū)域和顯著SSR標(biāo)記。表IIA-IIE.通過關(guān)聯(lián)性定位被定位出的染色體區(qū)域、顯著SSR標(biāo)記和bin位置。表11A性狀染色體SSR標(biāo)記BinA.T-DNA遞送-受感染UMC18143.02BNLG16473.023UMC22583.033UMC10253.043UMC14953.04UMC22603.043UMC19083.043標(biāo)記K3標(biāo)記O3UMC22643.0478<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表12.QTL定位的結(jié)果表明，這5個性狀共享一些共同的標(biāo)記，定位在一些重疊的或相同的染色體區(qū)域中。在這些顯著SSR標(biāo)記當(dāng)中，以下44個標(biāo)記是這5個性狀的獨(dú)特標(biāo)記。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>對于這5個性狀，將關(guān)聯(lián)性定位所定位出的染色體區(qū)域與QTL定位所定位出的染色體區(qū)域進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)性狀定位在相同或相似的染色體區(qū)域中。實(shí)施例10上位性(epistasis)是基因之間的相互作用，通過該相互作用一個基因會干擾或增強(qiáng)另一個基因的表達(dá)(Bateson1907)。許多經(jīng)典的定量遺傳研究已確認(rèn)了上位性的重要性(例如Falconer1981)?，F(xiàn)在借助標(biāo)記，我們可以開始更詳細(xì)地研究上位性。已發(fā)現(xiàn)上位性在玉米的糧食產(chǎn)量成分上是重要的(Maetal，2007)。在QTL之間出現(xiàn)上位性或相互作用82的情況中，當(dāng)用標(biāo)記選擇性狀時，極其重要的是要考慮作用的類型。作用微小或不顯著的QTL在影響作用重大的QTL的表達(dá)上可能極其重要(Wade1992)。如果不考慮這種相互作用，僅選擇作用大的QTL可能不能產(chǎn)生期望的表型收益(phenotypicgain)。BatesonW(1907)TheprogressofgeneticssincetherediscoveryofMendel'spaper(重新發(fā)現(xiàn)孟德爾論文后遺傳學(xué)的進(jìn)展).ProgrReiBot1:368FalconerDS(1981)Introductiontoquantitativegenetics,2ndedition(數(shù)量遺傳學(xué)入門(第二版)).LongmanPress,NewYork.MaXQ,TangJH,TengWT,YanJB，MengYJ,LiJS.(2007)Epistaticinteractionisanimportantgeneticbasisofgrainyieldanditscomponentsinmaize(上位性相互作用是玉米4泉食產(chǎn)量及其成分的重要遺傳基礎(chǔ)).MolecularBreeding20:41-51WadeMJ(1992)SewallWright:geneinteractionandtheshiftingbalancetheory(基因相互作用和動態(tài)平衡理論).Oxf.Surv.Evol.Biol.8:35-62使用SAS(SASInstitute)中的廣義線性建模(GeneralizedLinearmodeling,ProcGLM),以標(biāo)記作為主要的和相互影響的作用，測定與主要QTL顯著相關(guān)聯(lián)的各標(biāo)記之間的成對(pair-wise)和三向(three-way)相互作用。通過比較每個標(biāo)記基因座處的各等位基因的組合的性狀平均值，研究各相互作用的表型作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>C_TQ=愈傷組織類型和質(zhì)量-無農(nóng)桿菌I一GR-愈傷組織生長速度-受感染I_I=愈傷組織？1發(fā)％-受感染I_TQ=愈傷組織類型和質(zhì)量-受感染~~T—DNA=T-DNA遞送Trans:轉(zhuǎn)化0/0表13:UMC1400(染色體3)和BNLGl189(染色體4)的主要作用和相互作用的P值。UMC1400(染色體3)BNLGl189(染色體4)UMC1400xBNLGl189A_Res0.0016**0.120.35C_GR0.00004,0.00000***0.07c一i0.00027***0.00000***0.02*C_RG0.00752**0.00003***0.08C一RGQ0.02*0.00033***0.04*C一Res0.00009***0.018*0.88C—TQ0.00009***0.00000***0.08I一GR0.00038***0.00004*"0.014*I_I0.00051***0.080.12ITQ0.00000***0,02*0.0008***TDNA0.230.730.33Trans0.00021,0.060.04*表I4:UMCI400(染色體3)和UMC1332(染色體》的主要作用和相互作用的P值。UMCI400(染色體3)UMCI332(染色體5)UMCI400xUMC1332A—Res0.150.00047***0.33C_GR0.05*0.00000***0.84c—I0.650.00004,03184<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表15A-C.其中檢測出BNLG1189(染色體4)和UMC1400(染色體3)的顯著相互作用的選定性狀的平均值(按每個性狀可獲得的數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)目分組)。"A"等位基因來自PH09B。"B"等位基因來自PHWWD。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表16.其中檢測出UMC1332(染色體5)和UMC1400(染色體3)的顯著組)。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>雖然相互作用的p值一般較小，這是因?yàn)樵撃Ｐ瓦€包括作為主要作用的標(biāo)記，因此限制了相互作用的假陽性檢測。當(dāng)檢驗(yàn)平均性狀值時，顯然這些相互作用具有顯著的生物作用。例如，對于性狀C—I,在染色體4上的BNLG1189處有A等位基因存在的情況下，將A等位基因改變成染色體3上的UMC1400的B等位基因，導(dǎo)致了該性狀提高3.49?；蛘?，在UMC1400處存在A等位基因的情況下，將A等位基因改變成BNLG1189的B等位基因?qū)е铝嗽撔誀钐岣?.86。將該兩個標(biāo)記處的兩個等位基因從A改變成B，導(dǎo)致了C一I提高16.76，即為在單個QTL處改變等位基因的平均表型作用的兩倍。這是超加和的(over-additive)相互作用，其中兩個QTL的總和超過各個單獨(dú)的QTL。雖然染色體3上的QTL具有大的作用，但這個大的作用只有與染色體4上的QTL組合才能實(shí)現(xiàn)，也就是說選擇這兩個QTL會導(dǎo)致更大的進(jìn)步。平均值的這種傾向在其他性狀上也明顯存在(在"低"數(shù)值有利的情況中，例如對于I—TQ而言1為良好質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)了兩個QTL的負(fù)效應(yīng))。即使在P值不顯著的情況中，如對于C—RG(P=0.08)，平均值也遵循類似的傾向，即用兩個QTL實(shí)現(xiàn)更大的表型作用，這提示具有較大能力的較大群體大小會^r測到這些相互作用。染色體3上的QTL和染色體4和5上的QTL之間的相互作用，即使在主要作用QTL沒有被檢測到時也是明顯的。例如，對于轉(zhuǎn)化％這個性狀，具有大的作用的QTL在染色體3上檢測到，但在染色體4上沒有檢測到(用區(qū)間定位法，不過用廣義線性建模在P=0.064企測到接近顯著QTL的情況)。相互作用分析和平均值檢驗(yàn)證明，對于轉(zhuǎn)化%來說，染色體4上的QTL區(qū)域?qū)μ岣呷旧w3QTL的作用是重要的。權(quán)利要求1.一種獲得具有提高的可轉(zhuǎn)化性的玉米植株的方法，所述方法包括a)將第一玉米植株和第二玉米植株進(jìn)行雜交，其中所述第一植株的可轉(zhuǎn)化性高于所述第二植株；b)從獲自所述雜交的細(xì)胞或從所述雜交的后期各子代的細(xì)胞獲取DNA，并與一個或多個位于由bin1.01、1.02、2.01、2.02、2.03、2.04、3.01、3.02、3.04、4.08、4.09、5.03、5.05、5.07、5.08、6.01、6.05、6.06、6.07、6.08、6.09、7.04、7.05、8.03、8.04、8.05、8.06、8.07、10.01、10.02和10.03組成的群組中的標(biāo)記進(jìn)行雜交；和c)選出其中所述DNA與一個或多個所述標(biāo)記雜交的植株，以獲得與所述第二植株的可轉(zhuǎn)化率相比具有提高的可轉(zhuǎn)化性的植株。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述第一玉米親本是Hi-II。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一玉米親本是A188。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述第一玉米親本是H99。5.—種獲得具有提高的可轉(zhuǎn)化性的玉米植抹的方法，所述方法包括a)將第一玉米植林和第二玉米植抹進(jìn)行雜交，其中所述第一植抹的可轉(zhuǎn)化性高于所述第二植林；b)從獲自所述雜交的細(xì)胞或從所述雜交的后期各子代的細(xì)胞獲取DNA，并與一個或多個位于由umc2225和umcl711之間且包括umc2225和umcl711在內(nèi)、位于umc2258和umcl908之間且包括umc2258和umcl908在內(nèi)、位于bnlgl189和umci043之間且包括bnlgl189和umcl043在內(nèi)、位于blngl189和umcl043之間且包括blngl189和umcl043在內(nèi)、位于umcl587和PHI333597之間且包括umc1587和PHI333597在內(nèi)以及位于umcl941和umcl08之間且包括umcl941和umcl08在內(nèi)組成的群組中的標(biāo)記進(jìn)行雜交；和c)選出其中所述DNA與一個或多個所述標(biāo)記雜交的植林，以獲得與所述第二植林的可轉(zhuǎn)化率相比具有提高的可轉(zhuǎn)化性的植林。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一玉米親本是Hi-II。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一玉米親本是A188。8.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一玉米親本是A188。9.一種獲得具有提高的T-DNA遞送效率的玉米植株的方法，所述方法包括a)將第一玉米植林和第二玉米植林進(jìn)行雜交，其中所述第一植林的T-DNA遞送效率高于所述第二植4朱;b)從獲自所述雜交的細(xì)胞或從所述雜交的后期各子代的細(xì)胞獲取DNA,并與一個或多個位于由bin5.02、5.03和5.04組成的群組中的標(biāo)記進(jìn)4亍雜交；和c)選出其中所述DNA與一個或多個所述標(biāo)記雜交的植抹，以獲得與所述第二植林的T-DNA遞送效率相比具有更高的T-DNA遞送效率的植4朱。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述第一玉米親本是Hi-n。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述第一玉米親本是A188。12.權(quán)利要求9的方法，其中所述第一玉米親本是H99。13.權(quán)利要求9的方法，所迷方法還包括從獲自所述雜交的細(xì)胞或從所述雜交的后期各子代的細(xì)胞獲取DNA,并與一個或多個位于bin3.04或3.05的標(biāo)記進(jìn)行雜交。14.一種獲得具有提高的愈傷組織引發(fā)和質(zhì)量的玉米植林的方法，所述方法包括a)將第一玉米植林和第二玉米植林進(jìn)行雜交，其中所述第一植林的愈傷組織引發(fā)高于所述第二植抹；b)從獲自所述雜交的細(xì)胞或從所述雜交的后期各子代的細(xì)胞獲取DNA，并與一個或多個位于由bin4.07、4.08和4.09組成的群組中的標(biāo)記進(jìn)行雜交；和c)選出其中所述DNA與一個或多個所述標(biāo)記雜交的植;眛，以獲得與所述第二植株的愈傷組織引發(fā)頻率相比具有提高的愈傷組織引發(fā)和質(zhì)量的植林。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述第一玉米親本是Hi-II。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述第一玉米親本是A188。17.權(quán)利要求14的方法，其中所述第一玉米親本是H99。18.權(quán)利要求14的方法，所述方法還包括從獲自所述雜交的細(xì)胞或從所述雜交的后期各子代的細(xì)胞獲取DNA，并與一個或多個位于由bin3,02、3.03、3.04、3.05和3.06組成的群組中的標(biāo)記進(jìn)行雜交。19.一種培育具有提高的可轉(zhuǎn)化性的玉米植林的方法，所述方法包括a)將第一玉米植林和第二玉米植株進(jìn)行雜交，其中所述第一植林的可轉(zhuǎn)化率高于所述第二植抹；b)從獲自所述雜交的細(xì)胞或從所述雜交的后期各子代的細(xì)胞獲取DNA;c)將所述DNA與表12所示的一個或多個標(biāo)記進(jìn)行雜交；和d)選出與所述第二植抹的可轉(zhuǎn)化率相比具有提高的可轉(zhuǎn)化性的玉米植株。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一玉米親本是Hi-II。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一玉米親本是A188。22.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一玉米親本是H99。全文摘要本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有提高的可轉(zhuǎn)化性的玉米的方法。提供了用于提高的可轉(zhuǎn)化性的標(biāo)記，以及它們用于獲得具有提高的可轉(zhuǎn)化性的玉米植株的用途。鑒定了染色體上的會影響單子葉植物的轉(zhuǎn)化效率的位置。文檔編號A01H1/04GK101662931SQ200780042210公開日2010年3月3日申請日期2007年9月14日優(yōu)先權(quán)日2006年9月14日發(fā)明者D·巴特拉馬基,O·S·史密斯,徐國平,李柏林,趙佐宇申請人:先鋒高級育種國際公司;納幕爾杜邦公司