專利名稱：：改善農(nóng)作物的植物生長、蒸騰效率和耐旱性的玉米erecta基因的制作方法改善農(nóng)作物的植物生長、蒸騰效率和耐旱性的玉米ERECTA基因發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來講涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：許多植物的馴化與產(chǎn)量大幅提高有關(guān)。發(fā)生在自然種群中的大多數(shù)表型變異是連續(xù)的，是通過多種基因影響實(shí)現(xiàn)的。在馴化植物中鑒定出引起產(chǎn)量巨大差異的特定基因，已成為農(nóng)業(yè)研究中的重要焦點(diǎn)。研究表明，在擬南芥中，ERECTA基因通過促進(jìn)細(xì)胞增殖來控制器官生長和花的發(fā)育(Shpak等(2003)尸/a"ZCe〃15:1095-1110;Deve/o/w7eW(2004)131:1491-501)。擬南芥ERECTA基因通過促進(jìn)細(xì)胞增殖從而影響花序發(fā)育，控制器官生長。異位過量表達(dá)ERECTA基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物通過影響氣孔密度、表皮細(xì)胞膨脹、葉肉細(xì)胞增殖和細(xì)胞間接觸，從而改善植物蒸騰效率和耐旱性。ERECTA基因編碼富含亮氨酸重復(fù)序列受體才羊;敫酶(leucine-richrepeatreceptor-likekinase,LRR-RLK)，可以4空制植物生長/器官大小和生物量累積。另外，MasleGilmore和Farquhar指出除已知對植物構(gòu)造的不同作用以外，擬南芥ERECTA基因還決定了植物的轉(zhuǎn)化效率(MasleGilmore和Farquhar,A^we(2005)436:866)。這在農(nóng)業(yè)，尤其在耐旱性和農(nóng)藝性能方面具有意義。ERECTA與生長加快有關(guān)。ERECTA基因可用于控制玉米或其它農(nóng)作物整抹植物或特定器官的大小。該基因的潛在用途是在轉(zhuǎn)基團(tuán)植物中使之過量表達(dá)以增加生物量累積，使用組織特異性啟動(dòng)子使該基因的表達(dá)靶定在特定組織中從而促進(jìn)根生長、加快幼苗生長以實(shí)現(xiàn)快速的林冠郁閉、葉片變大、穗大小增加、胚加大、胚乳生長適于較大谷粒和操控整個(gè)谷粒中的油、蛋白質(zhì)或淀粉含量等等。通過改變玉米穗絲生長率，可以操控同步化或ASI(雌;維穗開花間隔(anthesisandsilkinginterval)),這可改善脅迫耐受性。另一個(gè)潛在的應(yīng)用是改善得自體外組織培養(yǎng)的作物的轉(zhuǎn)化和再生?？梢钥刂拼嘶虻谋磉_(dá)以提高細(xì)胞增殖率和培養(yǎng)組織生長率。ERECTA還可用于通過在特定組織中使表達(dá)下調(diào)，從而操控基因以減小器官大小，例如雄花穗大小。ERECTA基因可用于通過改善玉米和其它作物的蒸騰效率，從而提高耐旱性。探索此基因的天然等位基因變異可用于通過鑒定與近交種脅迫抗性表型有關(guān)的等位基因單元型，從而改善育種或轉(zhuǎn)基團(tuán)植物。該基因作圖位于染色體的干旱QTL附近的位置，這表明可能是抗性等位基因變體。本發(fā)明包括鑒定與擬南芥ERECTA基因(SEQIDNO:1和SEQIDNO:3)有關(guān)的推定的玉米ERECTA基因，即ZmERECTAA和ZmERECTAB(SEQIDNO:5和SEQIDNO:7)。具有與擬南芥ERECTA(SEQIDNO:l)最大相似性的直向同源物(ortholog)是ZmERECTA1(SEQIDNO:5)。該基因的表達(dá)與未成熟的生殖組織有關(guān)，主要見于花序分生組織和莖端分生組織，在其它分生組織相關(guān)的組織中水平較低。預(yù)期表達(dá)ZmERECTAA(SEQIDNO:5)的轉(zhuǎn)基因植物對生物量累積和玉米植物的生長率以及器官大小增大都有著積極的效杲。同樣預(yù)期表達(dá)ZmERECTA的轉(zhuǎn)基因植物耐旱性得到改善。這些玉米基因可用于改善玉米(和其它作物)的農(nóng)藝性狀。本發(fā)明還包括鑒定其它植物品種的ERECTA基因。水稻基因家族由2個(gè)家族成員表示。大豆(G(y"'wema;c)中還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)基因序列，兩色蜀黍CSorg/mm^'co/or)中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)基因。本文公開了ERECTA擬南芥基因家族的兩個(gè)成員。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于控制植物生長和器官大小以提高植物產(chǎn)量的組合物和方法。所述組合物包括得自玉米、大豆、擬南芥、水稻和高粱的ERECTA序列。本發(fā)明的組合物包含選自SEQIDNO:5-8的氨基酸序列和核苷酸序列及其變體和片段。本發(fā)明在DNA構(gòu)建體中提供編碼ERECTA序列的多核苷酸用于在目標(biāo)植物中進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明序列的表達(dá)盒、植物、植物細(xì)胞、植物組成部分和種子。在具體的實(shí)施方案中，所述多核苷酸與組成型啟動(dòng)子有效連接。本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)植物或植物組成部分的ERECTA序列水平的方法。該方法包括將包含本發(fā)明ERECTA序列的異源多核苷酸導(dǎo)入植物或植物組成部分?？梢蕴岣呋蚪档虴RECTA多肽的水平。這類方法可用來提高植物的產(chǎn)量；在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用來提高谷類的谷粒產(chǎn)量。附圖簡述圖1:B73、Mo17、B73xMo17F1雜種和Mol7xB73Fl雜種(MG6006.42,44)的穗狀花序分生組織(EIM)和莖端分生組織(SAM)在三個(gè)階段的ZmERECTA-A的MPSS表達(dá)。所述基因在穗狀花序分生組織中以高水平進(jìn)行表達(dá)，而在莖端分生組織中則以略微較低的水平進(jìn)行表達(dá)。圖2:顯示共有序列和保守區(qū)的得自玉米、擬南芥、水稻、高粱和大豆的ERECTA序列的比對。圖3:ERECTAA基因(SEQIDNO:3)優(yōu)選在分生組織和未成熟穗中表達(dá)，在多種組織中的表達(dá)詳見圖中所示。圖4:樹形圖表示得自擬南芥、玉米、大豆、高粱和水稻的ERECTA序列的親緣關(guān)系。發(fā)明詳述除非另有說明，否則本文所用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非另有說明，否則本發(fā)明所采用或包括的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。材料、方法和實(shí)施例只是說明性的，而不是限制性的。下面通過舉例進(jìn)行說明，但無意限制本發(fā)明的范圍。下文將參照附圖對本發(fā)明進(jìn)行更詳盡的說明，其中僅顯示本發(fā)明的一些實(shí)施方案，而非全部實(shí)施方案。事實(shí)上，這些發(fā)明可用許多種不同的方式進(jìn)行表達(dá)，因此不得解釋為限于本文所提出的實(shí)施方案；然而，這些實(shí)施方案應(yīng)按這樣的方式提供，即令本公開內(nèi)容符合適用的法律要求。在通篇說明書中，近似的數(shù)量是指相近的元素。在獲得先前描述和有關(guān)附圖中所提出的教導(dǎo)內(nèi)容的益處之后，本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想到本文所公開的本發(fā)明的許多修改和其它實(shí)施方案。因此，要了解的是，本發(fā)明不限于所公開的具體實(shí)施方案，有關(guān)修改和其它實(shí)施方案均包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。雖然本文采用特定的術(shù)語，但是這些術(shù)語只按普通描述性意義使用，而不是用于限制目的。除非另有說明，否則為了實(shí)施本發(fā)明將應(yīng)用植物學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握。這類技術(shù)詳細(xì)記載于文獻(xiàn)中。參見侈'B口Langenheim和Thimann,(1982)萬otowyP/a"f5z'o/ogy/teie/ariow7b/7w,"4^"'"，JohnWiley;Ce〃Cw/旨eiSbm加'cCW/o/(1984),第1巻，Vasil主編；Stanier等(1986)7TeMz'craZ^/『o^/，第5版，Prentice-Hall;Dhringra和Sinclair,(1985)5"WcP/awf尸a/Ao/ogyM"/o電CRCPress;Maniatis等(1982)Mo/ec油rC7om'wg.'Z^orato"Mam/a/;Z)AC4C/om'"g,第I巻和第II巻，(1985)Glover主編；Wgo肌c/eo"de^涵e^，(1985)Gait,主編；iVwc/e/c場6"'cfea"ow,(1984)Hames和Higgins主編；以及AfeAoA/五"^wo/ogy系列叢書，Colowick和Kaplan主編，AcademicPress,Inc.,SanDiego，CA。單位、前綴和符號可以按其SI可接受的形式表示。除非另有說明，否則核酸按5，到3'的方向自左向右書寫；氨基酸序列按氨基到羧基的方向自左向右書寫。限定范圍的數(shù)字也包括在數(shù)字范圍內(nèi)。本文可按周知的氨基酸三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的一字母符號使用氨基酸。同樣，可按公認(rèn)的核苷酸單字母代碼使用核苷酸。下面定義的術(shù)語將通過參照整個(gè)說明書總體上得到更詳細(xì)的定義。為了描述本發(fā)明，將采用下列術(shù)語，并按以下說明來定義。術(shù)語"微生物"是指任何微生物(包括真核和原核微生物)，例如真菌、酵母、細(xì)菌、放線菌、藻類和原生動(dòng)物以及其它單細(xì)胞結(jié)構(gòu)。術(shù)語"擴(kuò)增"是指用至少一個(gè)核列作為模板構(gòu)建多拷貝的核酸序列或與該核酸序列互補(bǔ)的多個(gè)拷貝。擴(kuò)增系統(tǒng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系統(tǒng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA、Cangene、Mississauga、Ontario)、Q(3復(fù)制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)和鏈置換擴(kuò)增(SDA)。參見例如Z)z'ag7zo幼'cMo/ecw/wM!'cro&o/ogy:尸/7'"ci^/es朋c/4p//Zc加'o叫(1993)Persing等主編,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC。擴(kuò)增產(chǎn)物稱為擴(kuò)增子。術(shù)語"保守修飾的變體(conservativelymodifiedvariant)"適用于氨基酸序列和核酸序列兩者。對于特定核酸序列，保守修飾的變體是指編碼相同氨基酸序列或氨基酸序列保守修飾的變體的核酸。由于遺傳密碼的簡并性，因此許多功能上相同的核酸都編碼任一指定蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU全都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸出現(xiàn)的每個(gè)位置都用一個(gè)密碼子標(biāo)明，該密碼子可變成所述相應(yīng)的任何密碼子而又不改變所編碼的多肽。這類核酸變異是"沉默變異(silentvariation)",代表一種保守修飾的變異。本文編碼多肽的每個(gè)核酸序列還記載了核酸的每一個(gè)可能的沉默變異。普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可以對核酸中的每個(gè)密碼子(AUG除外，它通常是曱硫氨酸的唯一密碼子；一個(gè)例外是紅色微球菌(Mz'cracocctwrw&似)，GTG是其甲硫氨酸的密碼子(Ishizuka等(1993),/M!'cra&o/.139:425-32)進(jìn)行修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼本發(fā)明多肽的核酸的每種沉默變異在各個(gè)所述多肽序列中都是隱含的，并且通過引用結(jié)合到本文中。至于氨基S^f列，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，當(dāng)改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸取代時(shí)，在被編碼序列上改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的各個(gè)取代、缺失或添加，即為"保守修飾的變體"。因此，選自l-15任何整數(shù)中的任何數(shù)目的氨基酸殘基可被如此改變。因此，可產(chǎn)生例如l、2、3、4、5、7或IO種變化。保守修飾的變體通常提供與未修飾多肽序列(保守修飾的變體從中衍生)類似的生物活性。例如，對于天然底物，底物特異性、酶活性或配體/受體結(jié)合一般是天然蛋白質(zhì)的至少30%、40%、50%、60%、70°/。、80%或90%，優(yōu)選60-90%。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域眾所周知的。下面6組分別含有彼此保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰酸(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。另參見Creighton,尸rato'/w,(1984)W.H.FreemanandCo.。本文所用"基本由......組成"是指包含對于目標(biāo)多核苷酸而言的附加序列(additionalsequence)在內(nèi)，其中所述附加序列在嚴(yán)格性條件下，不與與所述多核香酸相同的cDNA選擇性雜交，其中所述雜交條件包括在65。C下在0.1XSSC和0.1%十二烷基硫酸鈉中的洗滌步驟。術(shù)語"編碼"或"編碼的"對于特定核酸而言，是指包含用于翻譯成特定蛋白質(zhì)的信息。蛋白質(zhì)編碼核酸可包含核酸翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如內(nèi)含子)，或者可缺乏這類間插非翻譯序列(例如cDNA中的間插非翻譯序列)。編碼蛋白質(zhì)的信息通過密碼子使用而被具體化。通常由使用"通用"遺傳密碼的核酸編碼氨基酸序列。然而，當(dāng)采用以下這些生物表達(dá)核酸時(shí)，可以使用通用密碼的變體，例如存在于某些植物、動(dòng)物和真菌線斗立體、纟田菌山羊沖支原、體(A(vco//asmaca;n.co/ww)(Yamao等,(1985)/Voc.A^/.爿ca么<SW.L/5L482:2306-9)或纖毛蟲大核(Macra做c/ew力中的通用密碼的變體。當(dāng)通過合成來制備或改變核酸時(shí)，可利用將在其中表達(dá)核酸的目標(biāo)宿主的已知的密碼子偏愛性。例如，雖然本發(fā)明的核酸序列可同時(shí)在單子葉植物品種和雙子葉植物品種兩者中表達(dá)，但是可根據(jù)單子葉植物或雙子葉植物對特定密碼子的偏愛和GC含量的偏愛，來對序列進(jìn)行修飾，研究表明因?yàn)檫@些偏愛有所不同(Murray等(1989),M/c/ez'c」cz'&17:477-98，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。因此，可從玉米的已知基因序列，得到特定氨基酸的玉米偏愛的密碼子。得自玉米植物的28個(gè)基因的玉米密碼子選擇見Murray等人文獻(xiàn)中的表4,出處同上。本文所用"異源"當(dāng)指核酸時(shí)是起源于外源品種的核酸，或者如果得自同一品種，則是由其天然組成形式和/或基因組基因座通過人為刻意干預(yù)的基本修飾形式。例如，與異源結(jié)構(gòu)基因有效連接的啟動(dòng)子得自不同于得到結(jié)構(gòu)基因的品種，或者如果都得自同一品種，則一個(gè)或兩個(gè)是其原始形式的基本修飾形式。異源蛋白可源自外源品種，或者如果得自同一品種，則它是由其原始形式通過刻意人為干預(yù)得到的基本修飾形式。術(shù)語"宿主細(xì)胞"是指含有載體并支持表達(dá)載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(例如大腸桿菌(Eco/z'))，或者是真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲、植物、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選宿主細(xì)胞是單子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、水稻、棉花、油菜、大麥、粟和番茄。特別優(yōu)選的單子葉植物宿主細(xì)胞是玉米宿主細(xì)胞。術(shù)語"雜交復(fù)合體(hybridizationcomplex)"包括有關(guān)由2條單鏈核酸序列彼此選擇性雜交所形成的雙鏈體核酸結(jié)構(gòu)。有關(guān)將核酸插入細(xì)胞方面的術(shù)語"導(dǎo)入"，是指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并且包括有關(guān)將核酸摻入真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，其中核酸可摻到細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)、轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或者進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。術(shù)語"分離的"是指這樣的材料，例如核酸或蛋白質(zhì)，它基本或根本不含正常時(shí)在其天然存在的環(huán)境下伴隨存在或者與之相互作用的組分。分離材料任選包含在其天然環(huán)境中不與該材料一起存在的材料。作為如本文定義的"分離的"核酸，亦稱"異源"核酸。除非另有說明，否則術(shù)語"ERECT核酸"是指包含編碼ERECTA多肽的多核苷酸("ERECTA多核苷酸")的核酸。本文所用"核酸"是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核普酸或核糖核苷酸多聚體，除非特別限定，否則包括已知的具有天然核苷酸基本性質(zhì)的類似物，因?yàn)樗鼈儼磁c天然存在的核苷酸(例如肽核酸)同樣的方式與單鏈核酸雜交。術(shù)語"核酸文庫"是指一批分離的DNA或RNA分子，它包含并基本上代表了特定生物基因組的整個(gè)轉(zhuǎn)錄部分。示例性核酸文庫(例如基因組文庫和cDNA文庫)的構(gòu)建可參見標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)文獻(xiàn)，例如Berger和Kimmel，GWJe7bMo/ecw/arC7om."grecAm々wes,A/eAc^/"￡>2^>7wo/ogy系列叢書，第152巻，AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA(1987);Sambrook等(1989),Mo/ecw/"rC/,'"g.'爿Z^0rato7M"wwa/,第二版,第1-3巻；以及CWreWPratoco/sMo/ecw/ar5Zo/ogy,Ausubel等主編,CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.與JohnWiley&Sons,Inc.合資企業(yè)(1994增刊)。本文所用"有效連接"是指第一序列(例如啟動(dòng)子)和第二序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列啟動(dòng)和介導(dǎo)相當(dāng)于第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般而言，有效連接是指待連接的核酸序列是鄰接的，必要時(shí)將2個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)相鄰連接并在同一讀框內(nèi)。本文所用術(shù)語"植物"是指完整植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子及植物細(xì)胞和它們的子代。本文所用植物細(xì)胞包括但不限于種子懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、才艮、莖干(shoot)、配子體、孢子體、花粉和小孢子。可用于本發(fā)明方法的植物類別，通常與適于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物的類別一樣廣泛，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括下列屬的品種南瓜屬(CwcwA"a)、薔薇屬(及o犯)、葡萄屬(Wto)、核沖兆屬C/wg7a"力、草莓屬(Frag"n'fl)、百月永才艮屬(丄o^y)、苜蓿屬(Afec^'cago)、驢食豆屬((9"o^yc/u'力、三葉草屬(7V7/o/!'wm)、胡盧巴屬(7Wgo"e〃a)、豇豆屬(Fifgwa)、柑橘屬(CV化w力、亞麻屬(丄/wwm)、老鸛草屬(Geram'ww)、木薯屬(Mam'/iof)、胡蘿卜屬(Dawcws)、擬南芥屬04ra6Wo;wi's)、蕓莒屬(5nm7'ca)、蘿卜屬(/a;/^"w力、白芥屬OSV"a;的、顛癡屬04&o;7")、,束才權(quán)屬(Ca/w'cwm)、曼陀羅屬(Z)"ft/ra)、天4山子屬(場osc少amw力、番癡屬(Z;yco/7era/co")、煙草屬(7Wco〃a"a)、癡屬(5b/fl"ww)、碧冬癡屬(尸e,w"z'fl)、毛地黃屬(D妙a叫、Mq/orawa、菊苣屬(C7c/zo"'廳)、向曰葵屬(//e/z'a"^m力、萵苣屬(Zac似cfl)、雀麥屬(5ramw力、天門冬屬(/4s/7flragw5)、金魚草屬(Zw">r/u>iwm)、螢草屬(//emeraca/fc)、iVem&sb、天竺葵屬(尸e/orgom'wm)、禾爰屬、《良尾草屬(尸ewwie似m)、毛萊屬(iammcw/ws)、千里光屬(5^eci'o)、iSa/jo!'g/o孤's、黃瓜屬(Cwcwmz's)、藍(lán)英花屬(5rawfl仏'a)、大豆屬(G(y"'we)、豌豆屬CfVsww)、菜豆屬(P/"5eo/w力、黑麥草屬(Lo"iim)、稻屬(Oryza)、燕麥屬(^ve打a)、大麥屬(/ZoWewm)、黑麥屬(&az/e)、蔥屬(^/^m)和小麥屬(7W"cwm)。特別優(yōu)選的植物是玉米本文所用的"產(chǎn)量"是指收獲時(shí)經(jīng)調(diào)整谷類水分(通常為15%)后每英畝谷類農(nóng)作物蒲式耳。谷類水分在收獲的谷物中測量。收獲時(shí)調(diào)整谷類水分水平后測定經(jīng)調(diào)整的谷類測試重量(testweight),以磅/蒲式耳重量表示。本文所用"多核苷酸"是指具有天然核糖核普酸基本性質(zhì)的脫氧核糖多核香酸(deoxyribopolynucleotide)、核糖多核苦酸(ribopolynucleotide)或其類似物，因?yàn)樵趪?yán)格性雜交條件下，它們與與天然存在的核普酸基本相同的核苷酸序列雜交和/或允許翻譯成與天然存在的核苷酸所翻譯的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然基因、異源結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的全長序列或亞序列。除非另有說明，否則該術(shù)語是指特定序列及其互補(bǔ)序列。因此，出于穩(wěn)定性或其它原因，骨架經(jīng)修飾的DNA或RNA是本文所用術(shù)語"多核苷酸"。此外，包含稀有堿基例如肌苷或經(jīng)修飾的堿語多核香酸。應(yīng)當(dāng)了解的是，可以對DNA和RNA進(jìn)行各種修飾，以達(dá)到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種有用目的。本文所采用的術(shù)語多核苷酸包括這類化學(xué)修飾形式、S^修飾形式或代謝修飾形式的多核苷酸，以及病毒和細(xì)胞(還包括簡單細(xì)胞和復(fù)雜細(xì)胞)特有的DNA和RNA的化學(xué)形式。術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的多聚體。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸多聚體，并適用于天然存在的氨基酸多聚體。本文所用的"啟動(dòng)子"是指自轉(zhuǎn)錄開始并參與識別和結(jié)合RNA聚合酶和其它蛋白質(zhì)以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA上游區(qū)域。"植物啟動(dòng)子"是能夠在植物細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。示例性植物啟動(dòng)子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細(xì)胞中表達(dá)基因的細(xì)菌(如土壤桿菌屬(4gra6flc&n'wm)或才艮瘤菌屬(iA/zo&wm))得到的啟動(dòng)子。實(shí)例有在某些組織例如葉、根、種子、須根、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織中優(yōu)先啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子被稱為"組織優(yōu)選的"啟動(dòng)子。"細(xì)胞型，，特異性啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)在一種或多種器官中的某些細(xì)胞類型(例如根或葉的維管細(xì)胞)中進(jìn)行表達(dá)。"誘導(dǎo)型，，或"可調(diào)節(jié)"啟動(dòng)子是受環(huán)境控制的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^誘導(dǎo)型啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件或光線的存在。另一類型的啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，例如在花粉發(fā)育期間驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。組織優(yōu)選的啟動(dòng)子、細(xì)胞型特異性啟動(dòng)子、發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成"非組成型"啟動(dòng)子類別。"組成型"啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境條件下都有活性的啟動(dòng)子。術(shù)語"ERECTA多肽"是指一個(gè)或多個(gè)M酸序列。該術(shù)語還包括氨基酸序列的片段、變體、同源物、等位基因或前體(例如前蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)原)。"ERECTA蛋白"包含ERECTA多肽。除非另有說明，否則術(shù)語"ERECT核酸"是指包含編碼ERECTA多肽的多核苷酸("ERECTA多核苷酸")的核酸。本文所用"重組，，是指通過導(dǎo)入異源核酸而被修飾細(xì)胞或載體，或者從如此修飾的細(xì)胞衍生的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的細(xì)胞中不會(huì)以相同形式存在的基因，或者由于人為刻意干預(yù)從而表達(dá)否則會(huì)異常表達(dá)、表達(dá)不足或完全不表達(dá)的天然基因。本文所用術(shù)語"重組"不包括由天然存在的事件(例如自發(fā)突變、天然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)所引起的細(xì)胞或載體變化，例如由無人為刻意千預(yù)而發(fā)生的細(xì)胞或載體變化。本文所用"重組表達(dá)盒"是經(jīng)重組或合成產(chǎn)生的具有一系列特定核酸元件的核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體允許特定核酸在靶細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄?？蓪⒅亟M表達(dá)盒摻到質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。表達(dá)載體的重組表達(dá)盒部分除其它序列以外，通常還包括待轉(zhuǎn)錄的核酸和啟動(dòng)子。術(shù)語"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"在本文中可互換使用，是指摻到蛋白質(zhì)、多肽或肽(總稱"蛋白質(zhì)")的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另有限定，否則可包括已知的可按與天然存在的氨基酸同樣的方式起作用的天然氨基酸的類似物。術(shù)語"選擇性雜交"是指在嚴(yán)格性雜交條件下，比起其與非耙核酸序列雜交的程度,核酸序列以可檢測的較高程度(例如超過本底的至少2倍)與特定核酸靶序列雜交，并且基本不包括非靶核酸。選擇性雜交序列彼此間通常具有約至少40%序列同一性，優(yōu)選60-90%序列同一性，最優(yōu)選100%序列同一性(即互補(bǔ))。術(shù)語"嚴(yán)格性條件"或"嚴(yán)格性雜交條件"是指比起其它序列，探針可與其靶序列以可檢測的較高程度(例如超出本底的至少2倍)雜交的條件。嚴(yán)格性條件是序列依賴性的，在不同情況下將有所不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒定出與探針互補(bǔ)可高達(dá)100。/。的靶序列(同源探測)?；蛘?，可調(diào)整嚴(yán)格性條件，使得序列中存在一些錯(cuò)配，從而檢測較低程度的相似性(異源探測)。探針長度最理想約為500個(gè)核苦酸，但是也可在長度500個(gè)核苷酸以下到等于靶序列完整長度之間大幅變化。嚴(yán)格性條件通常是這樣的條件，其中在pH7.0-8.3下鹽濃度小于約1.5M鈉離子，通常約O.Ol-l.OM鈉離子濃度(或其它鹽)，對于短探針(例如10-50個(gè)核苷酸)，溫度至少約為30°C,對于長探針(例如大于50個(gè)核苷酸)至少約為60°C。還可加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺或Denhardt試劑來達(dá)到嚴(yán)格性條件。示例性的低嚴(yán)格性條件包括在37X:下在30-35%曱酰胺、1MNaCl、1。/。SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液中進(jìn)行雜交，并在50-55。C下用1X-2XSSC(20XSSC-3.0MNaC1/0.3M檸檬酸三鈉)洗滌。1。/。SDS中進(jìn)行雜交，并在55-60。C下用0.5X-1XSSC洗滌。示例性的高嚴(yán)格性條件包括在37。C下在50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS中進(jìn)行雜交，并在60-65。C下用O.IXSSC洗滌。特異性通常隨雜交后洗滌而變化，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對于DNA-DNA雜交，可由下列公式得到Tm的近似值Tm=81.5。C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)匿500/L(Meinkoth和Wahl,j加/.5ZocAem.,(1984)138:267-84);其中M是一價(jià)陽離子的體積摩爾濃度，％GC是DNA中鳥噪呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，。/。form是雜交溶液中曱酰胺的百分比，L是以堿基對為單位的雜交序列長度。Tm是互補(bǔ)耙序列與完全匹配的探針雜交達(dá)50%時(shí)的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。對于每1%的錯(cuò)配，TJ更降低大約1°C;因此，可以調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件從而與所需同一性的序列雜交。例如，如果要尋獲同一性^90%的序列，則可將Tm降低10°C。一般選擇在規(guī)定離子強(qiáng)度和pH下低于特定序列及其互補(bǔ)序列熱熔點(diǎn)(Tm)約5。C的嚴(yán)格性條件。然而，極嚴(yán)格性條件可采用比熱熔點(diǎn)(Tm)低rC、2°C、3。C或4。C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格性條件可采用比熱熔點(diǎn)(Tm)低6。C、7°C、8°C、9。C或10。C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格性條件可采用比熱熔點(diǎn)(TJ低11°C、12°C、13°C、14°C、15。C或20。C的雜交和/或洗滌。在使用所述公式、雜交和洗滌組合物及所需的Tm時(shí)，普通技術(shù)人員應(yīng)清楚雜交和/或洗滌溶液的變化是固有發(fā)生的。如果所需的錯(cuò)配程度引起Tm低于45'C(含水溶液)或32。C(曱酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC濃度以便可使用較高的溫度。核酸雜交的詳盡指南可參見Tijssen,5z.o/ogy-場6n.Gfc:aft'o/2w"/iVwc/eifc7Vo6&s,第2章,第I吾卩分,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays(雜交原理與核酸探針實(shí)驗(yàn)策略綜述)"，Elsevier,NewYork(1993);以及Cw^rew,/Votoco/s/"Mo/ec油r第2章，Ausubel等主編，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)。除非另有說明，否則本申請中高嚴(yán)格性定義為在65。C下在4XSSC、5XDenhardt試劑(含5g菲可(Ficoll)、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g胎牛血清白蛋白的500ml水)、0.1mg/ml煮沸的鮭精DNA和25mM磷酸鈉中進(jìn)行雜交，并在65。C下用0.1XSSC、0.1%SDS洗滌。本文所用"轉(zhuǎn)基因植物"是指在其基因組中包含異源多核苦酸的植物。異源多核苷酸一般穩(wěn)定地整合到基因組中，使得多核普酸傳遞給連續(xù)世代。異源多核苷酸可單獨(dú)或者作為重組表達(dá)盒的組成部分整合到基因組中。本文所用"轉(zhuǎn)基因的"包括任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物組成部分或植物，其基因型由于異源核酸的存在而發(fā)生了改變，所述異源核酸包括最初如此改變的轉(zhuǎn)基團(tuán)植物的異源核酸，以及由最初的轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)有性雜交或無性繁殖所產(chǎn)生的異源核酸。本文所用術(shù)語"轉(zhuǎn)基因的"不包括通過常規(guī)植物育種方法或者由天然存在的事件(例如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變)引起的基因組(染色體或染色體外)改變。本文所用"載體"是指用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的核酸，并且在載體中可插入多核苷酸。載體常常是復(fù)制子。表達(dá)載體允許插入其中的核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。使用下列術(shù)語來描述兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多核普酸或者多肽之間的序列關(guān)系:(a)"參比序列",(b)"比較窗(comparisonwindow)",(c)"序列同一性"，(d)"序列同一性百分比"，和(e)"基本相同"。本文所用"參比序列"是用作序列比較基礎(chǔ)的規(guī)定序列。參比序列可以是特定序列的亞序列或全序列；例如作為全長cDNA或基因序列的區(qū)段，或者是完整的cDNA或基因序列。本文所用"比較窗"是指包括多核苷酸序列連續(xù)的特定區(qū)段，其中可將多核苷酸序列與參比序列進(jìn)行比較，且其中與用于兩個(gè)序列的最佳比對的參比序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗的多核苷酸序列部分可包含添加或缺失(即空位)。比較窗長度一般至少為20個(gè)連續(xù)核苷酸，任選可以是30、40、50、IOO個(gè)或更長。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，為了避免由于多核苷酸序列含有空位所致的與參比序列有較高的相似性，通常會(huì)引入空位罰分并且從匹配數(shù)中扣減。用于比較的核苷酸序列和氨基酸序列的比對方法是本領(lǐng)域眾所周知的。局部同源算法(BESTFIT)(見Smith和Waterman,(1981)爿^.^;/.MaA2:482)，可進(jìn)行最佳序列比對以便比較；還可通過以下方法進(jìn)行同源比對算法(GAP)(Needleman和Wunsch,(1970)</Mo/.5!'o/.48:443-53);檢索相似性方法(Tfasta和Fasta)(Pearson和Lipman,(1988)/Voc.7Va"^ca《t/5L485:2444);這些算法的計(jì)算機(jī)運(yùn)行，包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(Intelligenetics,MountainView,California),GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和Wisconsin遺傳軟件包第8版(WisconsinGeneticsSoftwarePackage)的TFASTA(可得自GeneticsComputerGroup(GCG⑧程序(Accelrys,Inc.,SanDiego,CA))。有關(guān)CLUSTAL程序的詳情參見Higgins和Sharp,(1988)73:237-44;Higgins和Sharp,(1989)5:151-3;Corpet等(1988)M/c/e/c16:10881-90;Huang等(1992)Com/*/-^Wca"om1z>z萬Zos"'ewces8:155-65;以及Pearson等(l994)Me仇Mc/.歷o/.24:307-31。用于多個(gè)序列的最佳全局比對的優(yōu)選程序是PileUp(Feng和Doolittle，(1987)JMo/,五vo/.，25:351-60,該方法與Higgins和Sharp所述方法(Higgins和Sharp(1989)C4^/OS5:151-53)類似，并通過引用結(jié)合到本文中)?？捎糜跀?shù)據(jù)庫相似性檢索的一類BLAST程序包括對照核苷酸數(shù)據(jù)庫序列用于核苦酸查詢序列的BLASTN;對照蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列用于核香酸查詢序列的BLASTX;對照蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列用于蛋白質(zhì)查詢序列的BLASTP;對照核苦酸數(shù)據(jù)庫序列用于蛋白質(zhì)查詢序列的TBLASTN;以及對照核苷酸數(shù)據(jù)庫序列用于核普酸查詢序列的TBLASTX。參見CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,第19章，Ausubel等主編，GreenePublishingandWiley畫Interscience,NewYork(1995)。GAP使用Needleman和Wunsch的算法(出處同上)，來查找使匹配數(shù)最大且空位數(shù)最小的2個(gè)全序列的比對。GAP將所有可能的比對和空位都考慮在內(nèi)，創(chuàng)建具有堿基匹配數(shù)最大和空位最少的比對。這允許提供以匹配堿基為單位的空位建立罰分(gapcreationpenalty)和空位延伸罰分(gapextensionpenalty)。對于其插入的每個(gè)空位，GAP都必須得到(makeaprofitof)匹配的空位建立罰分?jǐn)?shù)。如果選擇空位延伸罰分大于零，則GAP另還必須因每個(gè)插入的空位而得到空位長度乘以空位延伸罰分的值。Wisconsin遺傳軟件包(第10版)中默認(rèn)空位建立罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2?？瘴唤⒘P分和空位延伸罰分可用選自0-100之間的整數(shù)表示。因此，例如空位建立罰分和空位延伸罰分可以為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或以上。GAP是最佳比對類別的一員。該類別中可有許多成員，但其它成員并不具有較好的質(zhì)量。GAP顯示出比對的4項(xiàng)品質(zhì)因素質(zhì)量(quality)、比率、同一性和相似性。質(zhì)量是為了對序列進(jìn)行比對的量度(metric)最大化。比率是質(zhì)量除以較短區(qū)段的堿基數(shù)。百分比同一性是實(shí)際匹配符號的百分比。百分比相似性是相似符號的百分比。空位跨過的符號可忽略不計(jì)。當(dāng)一對符號的評分矩陣值(scoringmatrixvalue)20.50(即相似性閾值)時(shí)，被評為有相似性。Wisconsin遺傳軟件包(第10版)中所用的評分矩陣是BLOSUM62(參見Henikoff和Henikoff，(1989)尸rac.A/a".^cfldWX489:10915)。除非另有說明，否則本文所提供的序列同一性/相似性數(shù)值是指應(yīng)用BLAST2.0程序組采用默認(rèn)參數(shù)所得到的分值(Altschul等(1997)iVwc/dc爿c^to.25:3389-402)。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的一樣，BLAST假定蛋白質(zhì)可作為隨機(jī)序列模型來進(jìn)行檢索。然而，許多真實(shí)蛋白質(zhì)包含非隨機(jī)序列區(qū)域，它可以是同聚束(homopolymerictract)、短周期重復(fù)序列(short-periodrepeat)或富含一種或多種氨基酸的區(qū)域?？蓪o關(guān)蛋白質(zhì)之間的這類低復(fù)雜性區(qū)域進(jìn)行比對，即使蛋白質(zhì)的其它區(qū)域完全不同?？刹捎枚喾N低復(fù)雜性過濾程序(filterprogram)以減少這類低復(fù)雜性比對?？蓡为?dú)或聯(lián)合使用例如SEG(Wooten和Federhen，(1993)Compwf.Oe肌17:149-63)和XNU(Claverie和States,(1993)Cow/wf.CAem.17:191-201)低復(fù)雜性過濾程序。本文所用"序列同一性"或"同一性"在兩個(gè)核酸序列或兩個(gè)多肽序列的情況下，是指兩個(gè)序列中的殘基，當(dāng)在特定比較窗內(nèi)對最大對應(yīng)性進(jìn)行比對時(shí)是相同的。當(dāng)序列同一性百分比用來提及蛋白質(zhì)時(shí)，一般認(rèn)為不相同的殘基位置常常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基取代，因此不會(huì)改變分子的功能性質(zhì)。如果序列在保守取代方面不同，則百分比序列同一性可以向上調(diào)整以糾正保守性質(zhì)的取代。由于這類保守取代而不同的序列，被稱為具有"序列相似性"或"相似性"。進(jìn)行這類調(diào)整的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這通常包括將保守取代作為部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配進(jìn)行評分，從而提高百分比序列同一性。因此，例如當(dāng)相同的氨基酸得分為1，且非保守取代得分為0時(shí)，保守取代的得分介于0和1之間。例如，按照Meyers和Miller算法(Meyers和Miller,(1988)Cbm/wferv4jc;p/Zc.Ao/.4:11-17),例如執(zhí)行程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California,USA)，計(jì)算出保守取代的得分。本文所用"序列同一性百分比"是指在比較窗內(nèi)對兩個(gè)最佳比對序列進(jìn)行比較所測定的值，其中與用于兩個(gè)序列最佳比對的參比序列(不包含添加或缺失)相比，比較窗內(nèi)的多核香酸序列部分可包含添加或缺失(即空位)。如下計(jì)算百分比確定同時(shí)在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)，得到匹配位置數(shù)，用比較窗的位置總數(shù)除匹配位置數(shù)，結(jié)果乘以100便得到序列同一性的百分比。術(shù)語多核香酸序列的"基本相同"是指包含與參比序列相比，序列同一性介于50-100%之間的序列的多核苷酸，優(yōu)選至少50%序列同一性，優(yōu)選至少60%序列同一性，優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,所述序列同一性通過應(yīng)用所述比對程序之一用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)計(jì)算得出。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可以將密碼子簡并性、氨基酸相似性、讀框定位等考慮在內(nèi)，對這些數(shù)值進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以確定由兩個(gè)核苷酸序列編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的同一性。出于這些目的的氨基frl/f列的基本相同通常是指介于55-100%之間的序列同一性，優(yōu)選至少55%,優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%、80%、90%，最優(yōu)選至少95%。核苷酸序列是基本相同的另一個(gè)標(biāo)志是如果兩個(gè)分子在嚴(yán)格性條件下能彼此雜交。遺傳密碼的簡并性為許多氨基酸取代創(chuàng)造了條件，該取代導(dǎo)致了編碼相同氨基酸的核苷酸序列的多樣性，因此，有可能出現(xiàn)的是，可編碼相同多肽的DNA序列在嚴(yán)格性條件下彼此間不會(huì)雜交。例如，當(dāng)用遺傳密碼所允許的最大密碼子筒并產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)，這種情況便可能出現(xiàn)。2個(gè)核酸序列是基本相同的一個(gè)標(biāo)志是這樣的多肽，即第一核酸編碼的多肽與第二核酸的多肽有免疫交叉反應(yīng)性。術(shù)語"基本相同"在肽的情況下是指肽包含在特定比較窗內(nèi)與參比序列相比序列同一性介于55-100%的序列，優(yōu)選至少55%序列同一性，優(yōu)選60%、優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、最優(yōu)選至少90%或95%序列同一性。優(yōu)選采用Needleman和Wunsch的同源比對算法(出處同上)進(jìn)行最佳比對。兩個(gè)肽序列是基本相同的標(biāo)志是一種肽與針對第二種肽所產(chǎn)生的抗體有免疫反應(yīng)性。因此，例如當(dāng)兩種肽僅因保守取代而不同時(shí)，第一肽與第二肽是基本相同的。另外，當(dāng)兩種肽因非保守變化而不同時(shí)，如果抗體識別的表位是基本相同的，則第一肽與第二肽是基本相同的。與如上所述序列有共同序列只是殘基位置有所不同的"基本相似，，的肽，可因保守氨基酸改變而有所不同。本發(fā)明公開了ERECTA多核苷酸和ERECTA多肽。本發(fā)明的新的核苷酸和蛋白質(zhì)具有的表達(dá)模式表明它們在植物發(fā)育中起著重要作用。所述多核苷酸在多種植物組織中進(jìn)行表達(dá)。因此，所述多核苷酸和多肽為操控植物發(fā)育以改變種子和營養(yǎng)組織發(fā)育、時(shí)間控制或組成提供了機(jī)會(huì)。這可用來產(chǎn)生不育植物、無籽植物或胚乳組成改變的植物。表l序列鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>核酸本發(fā)明此外還提供包含ERECTA多核苷酸的RNA、DNA及其類似物和/或嵌合體的分離核酸。本發(fā)明還包括使在不同生物中表達(dá)最優(yōu)化的多核香酸。例如，對于玉米植物中多核苦酸的表達(dá)，可按照Murray等的方法(出處同上)，使序列改變以符合特定的密碼子偏愛，并改變GC含量。對于得自玉米植物28個(gè)基因的玉米密碼子選擇可參見Murray等人(出處同上)的表4。本發(fā)明的ERECT核酸包含分離的ERECTA多核苷酸，其包括(a)編碼ERECTA多肽的多核苷酸及其保守性修飾的變體和多態(tài)性變體；(b)與(a)或(b)的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；(c)(a)或(b)的多核苷酸的互補(bǔ)序列。核酸的構(gòu)建可采用(a)標(biāo)準(zhǔn)重組方法，(b)合成技術(shù)，或其組合，來制備本發(fā)明的分離核酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可被克隆、擴(kuò)增，或者另由真菌或細(xì)菌構(gòu)建。核酸可適宜包含除本發(fā)明多核香酸以外的序列。例如，可將包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)切核酸酶限制位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)插入核酸中以助于分離多核苷酸。同樣，可以插入可翻譯序列以助于分離翻譯的本發(fā)明多核苷酸。例如，六聚組氨酸標(biāo)記序列為純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)提供方便的方法。本發(fā)明的上述核酸-多核苷酸序列除外-任選為用于本發(fā)明多核苷酸克隆和/或表達(dá)的載體、銜接子或接頭?？蓪⒏郊有蛄刑砑拥竭@類克隆和/或表達(dá)序列上以使其在克隆和/或表達(dá)時(shí)最優(yōu)化，從而有助于分離多核苦酸，或者促進(jìn)多核香酸導(dǎo)入細(xì)胞。本發(fā)明核酸的長度減去其本發(fā)明多核苷酸的長度通常小于20千堿基對，常常小于15kb,時(shí)常小于10kb?？寺≥d體、表達(dá)載體、銜接子和接頭的使用是本領(lǐng)域眾所周知的。示例性的核酸包括諸如這樣的載體M13、、ZAPExpress、人ZAPII、人gt10、Xgtll、pBK-CMV、pBK-RSV、pBl應(yīng)riptII、人DASHII、入EMBL3、XE廳L4、pWE15、SuperCosl、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3，SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和H、pOPRSVICAT、pOPI3CAT、pXTl、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pOG44、pOG45、pFRT|3GAL、pNEO(3GAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、、MOSSlox和XMOSElox。用于本發(fā)明的任選的栽體包括但不限于XZAPII和pGEX。有關(guān)各種核酸的描述參見例如StratageneCloningSystems,1995、1996、1997目錄(LaJolla,CA);以及AmershamLifeSciences,Inc,，97目錄(ArlingtonHeights,IL)。構(gòu)建核酸的合成方法可用以下方法通過直接化學(xué)合成來制備本發(fā)明的分離核酸例如磷酸三酯方法(Narang等(1979)MeA.五w27mo/.68:90-9);磷酸二酯方法(Brown等，(1979)Me決.五"2jw0/.68:109-51);二乙基亞石癢酰胺(diethylphosphoramidite)方'法(Beaucage等(1981)Te^a.22(20):1859-62);固相亞磷酰胺三酯方法(Beaucage等(出處同上)，該方法例如使用自動(dòng)合成儀，參見例如Needham-VanDevanter等(1984)M/c/eZc12:6159-68);以及固相支持體方法(美國專利第4,458,066號)?；瘜W(xué)合成法一般產(chǎn)生單鏈寡核苷酸。這可通過與互補(bǔ)序列雜交或者通過用該單鏈作為模板用DNA聚合酶聚合來轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，雖然DNA的化學(xué)合成限于約100個(gè)堿基的序列，但是可通過較短序列的連接得到較長的序列。UTR和密碼子偏愛研究發(fā)現(xiàn)翻譯效率一般受RNA的5'非編碼區(qū)或非翻譯區(qū)(5，UTR)特定序列元件的調(diào)節(jié)。正向序列基序包括翻譯起始共有序列(Kozak,(1987)M/c/e!'cJc!A15:8125)和5<G>7曱基GpppGRNA帽子結(jié)構(gòu)(Drummond等(1985)M/c/^^d&i"13:7375)。負(fù)向元件包括穩(wěn)定的分子內(nèi)5，UTR莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(Muesing等(1987)Ce〃48:691)和AUG序列或位于5，UTR中合適AUG之后的短可讀框(Kozak,出處同上，Rao等(1988)嵐朋t/Ce〃.腺.8:284)。因此，本發(fā)明提供5，和/或3'UTR區(qū)用于調(diào)節(jié)異源編碼序列的翻譯。此外，可以對本發(fā)明多核苷酸的多肽編碼區(qū)段進(jìn)行^務(wù)飾以改變密碼子選擇。可利用已改變的密碼子選擇來改變翻譯效率和/或使編碼序列在所需宿主中的表達(dá)最優(yōu)化，或者使在玉米中表達(dá)的異源序列中的密碼子選擇最^尤4b?？梢詰?yīng)用獲自UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup的市售軟件包例如"CodonPreference",對本發(fā)明多核苷酸編碼區(qū)中的密碼子選擇進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。參見Devereaux等(1984)M/c/dc」c/&12:387-395;或MacVector4.1(EastmanKodakCo.,NewHaven，Conn.)。因此，本發(fā)明提供至少一個(gè)本發(fā)明多核苷酸的編碼區(qū)密碼子選擇頻率特征。可以用來確定密碼子選擇頻率的多核苷酸數(shù)(3個(gè)核芬酸/氨基酸)，可以是3個(gè)至本文所提供的本發(fā)明多核苷酸數(shù)之間的任何整數(shù)。任選多核苷酸可以是全長序列。用于統(tǒng)計(jì)分析的示例性序列數(shù)可為至少1、5、10、20、50或100。序列改組本發(fā)明提供使用本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行序列改組的方法以及從其中得到的組合物。序列改組可參見WO公布號97/20078。另參見Zhang等(1997),尸rac.iVa"JcaJ.94:4504-9;以及Zhao等(1998)iVa&reAo&c/16:258-61。序列改組一般提供用于產(chǎn)生具有所需特征的多核苦酸文庫的方法，所述特征是可被選擇或篩選的。重組多核香酸文庫由一群序列相關(guān)的多核苷酸產(chǎn)生，所述序列相關(guān)的多核苷酸包含具有基本序列同一性并可在體外或體內(nèi)進(jìn)行同源重組的序列區(qū)。所述序列重組的多核苷酸群包含多核苷酸亞群，該多核苷酸亞群具有所需要的特征或優(yōu)勢特征，并且可通過合適的選擇或篩選方法被選出。所述特征可以是能夠在篩選系統(tǒng)中被選出或被檢測的性質(zhì)或?qū)傩?，可包括以下蛋白、元件或序列的性質(zhì)編碼的蛋白質(zhì)；轉(zhuǎn)錄元件；控制轉(zhuǎn)錄、RNA加工、RNA穩(wěn)、定性、染色質(zhì)構(gòu)象、翻譯或基因或轉(zhuǎn)基因的其它表達(dá)性質(zhì)的序列；復(fù)制元件；蛋白質(zhì)結(jié)合元件等，例如賦予可篩選或可檢測性質(zhì)的任何特征。在一些實(shí)施方案中，選擇特征可以是與如本文所提供的野生型蛋白質(zhì)相比Km和/或K^改變。在其它實(shí)施方案中，由序列改組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多核苷酸的配體結(jié)合親和力可大于未改組野生型多核苷酸的配體結(jié)合親和力。在又一些實(shí)施方案中，與未改組野生型多核香酸的相比，由序列改組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多核苷酸最適宜pH被改變。這類性質(zhì)的提高可以是野生型數(shù)值的至少110%、120%、130%、140%或150%以上。重組表達(dá)盒本發(fā)明還提供包含本發(fā)明核酸的重組表達(dá)盒。編碼所需的本發(fā)明多核苷酸的核酸序列(例如長度足以編碼本發(fā)明活性蛋白的cDNA或編碼多肽的基因組序列)，可用來構(gòu)建可導(dǎo)入所需宿主細(xì)胞的重組表達(dá)盒。重組表達(dá)盒通?？砂c轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)序列有效連接的本發(fā)明多核香酸，該轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)序列可指導(dǎo)多核苷酸在既定宿主細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)化植物的組織)中轉(zhuǎn)錄。例如，植物表達(dá)載體可包括(1)受5，和3，調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)錄控制的克隆的植物基因，(2)顯性選擇標(biāo)記。如有需要，這類植物表達(dá)載體還可包含啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(例如賦予誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)性表達(dá)或者細(xì)胞或組織特異性/選擇性表達(dá)的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū))、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或聚腺苷酸化信號?？梢圆捎弥参飭?dòng)子片段，該片段可指導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸在再生植物的所有組織中表達(dá)。這類啟動(dòng)子本文稱為"組成型"啟動(dòng)子，并且在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下都具有活性。組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括1，啟動(dòng)子或2，啟動(dòng)子(衍生自根癌土壤桿菌(jgra^cter^w似me/a"'ew)的T-DNA)、Smas啟動(dòng)子、肉桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(美國專利第5，683，439號)、Mw啟動(dòng)子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動(dòng)子、GRPl-8啟動(dòng)子、得自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子(參見Odell等(1985)A^we313:810-2)、水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McHroy等(1990)尸/a"Ce〃163-171)、泛素啟動(dòng)子(Christensen等(1992)尸/a^Afo/.Ao/.12:619-632和Christensen等(1992)尸/朋；Mo/.所o/.18:675-89)、pEMU(Last等(1991)7%,.如/.81:581-8)、MAS(Velten等(1984)冊萬0/.3:2723-30)、玉米H3組蛋白啟動(dòng)子(Lepetit等(1992)Mo/.G饑231:276-85)和Atanassvoa等(1992)尸/a"f/owtw/2(3):291-300)、ALS啟動(dòng)子(參見PCT專利申請?zhí)朩。96/30530、GOS2(美國專利第6,504,083號)以及得自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種植物基因的其它轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。對于本發(fā)明而言，泛素啟動(dòng)子是優(yōu)選的用于在單子葉植物中表達(dá)的啟動(dòng)子?；蛘?，植物啟動(dòng)子可指導(dǎo)本發(fā)明的多核普酸在特定組織中表達(dá)，或者另可處于更精細(xì)的環(huán)境或發(fā)育控制之下。這類啟動(dòng)子在此稱為"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子(Rab17、RAD29)。可影響通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件包括病原體攻擊、厭氧條件或光線的存在。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例有由缺氧或冷脅迫誘導(dǎo)的Adhl啟動(dòng)子、由熱脅迫誘導(dǎo)的Hsp70啟動(dòng)子和由光誘導(dǎo)的PPDK啟動(dòng)子。受發(fā)育控制的啟動(dòng)子的實(shí)例包括僅僅或優(yōu)先在某些組織(例如葉、根、果實(shí)、種子或花)中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的操作還可隨啟動(dòng)子在基因組中的位置而變化。因此，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在某些位置上可能變成完全組成型或部分組成型。如果需要多肽表達(dá)，則一般需要的是在多核苷酸編碼區(qū)的3'端包括聚腺苷酸化區(qū)?？蓮亩喾N植物基因或者從T-DNA中得到聚腺苷酸化區(qū)。待添加的3，端序列可得自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因，或者得自其它植物基因，或者次優(yōu)選得自任何其它真核基因。這類調(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括但不限于3'終止區(qū)和/或聚腺苷酸化區(qū)，例如根癌土壤桿菌胭脂堿合酶(nos)基因的3'終止區(qū)和/或聚腺苷酸化區(qū)(Bevan等(1983)TVwc/ez'cJaA/"12:369-85);馬鈴薯蛋白酶抑制劑II(PINII)基因(Keil等(19S6)M/c/ez'c爿c^s14:5641-50;An等(1989)尸/cm〖Ce〃1:115-22);以及CaMV19S基因(Mogen等(1990)尸/a"fCe〃2:1261-72)?？蓪?nèi)含子序列添加到5，非翻i奪區(qū)或部分編碼序列的編碼序列中以增加在細(xì)胞溶膠積蓄的成熟信息的量。在植物和動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體兩者的轉(zhuǎn)錄單元中包括可剪接內(nèi)含子顯示出在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的基因表達(dá)提高多達(dá)1000倍(Buchman和Berg,(1988)Mo/.Ce〃5!'o/.8:43954405;Callis等(1987)Gew^Dev.1:1183-200)。這類內(nèi)含子增強(qiáng)的基因表達(dá)通常在置于接近轉(zhuǎn)錄單元5，端時(shí)最高。玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子1、2和6及Bronze-l內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域已知的。一般參見7TieZ/aw必ooA:，第116章，F(xiàn)reeling和Walbot主編，Springer,NewYork(1994)。植物信號序列可用于本發(fā)明，所述植物信號序列包括但不限于使蛋白質(zhì)靶向植物細(xì)胞胞外基質(zhì)的信號肽編碼DNA7RNA序列(Dratewka-Kos等(1989)乂編.CW264:4896-900)，例如白花丹葉煙草(M'co"a"ap/w^ag!'m/o/Za)擴(kuò)延基因(DeLoose等(1991)基因99:95-100);使蛋白質(zhì)靶向液泡的信號肽，例如甘薯塊根貯存蛋白(sporamin)基因(Matsuka等(1991)尸rac.A/a"爿cat/.5W.C/5L488:834)和大麥凝集素基因(Wilkins等(1990)尸/a^CW/,2:301-13);引起蛋白質(zhì)分泌的信號肽，例如PRIb信號肽(Lind等(1992)P/朋fMo/.5z'o/.18:47-53)或大麥a淀粉酶(BAA)(Rahmatullah等(1989)尸/a"fMo/.所o/.12:119，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)；或者使蛋白質(zhì)靶向質(zhì)體的信號肽，例如油菜籽烯酰Acp還原酶的信號肽(Verwaert等(1994)尸/a",Mo/.AW.26:189-202)。對于本發(fā)明，與ERECTA多核普酸融合的大麥a淀粉酶信號序列是用于在玉米中表達(dá)的優(yōu)選的構(gòu)建體。包含得自本發(fā)明多核苷酸的序列的載體通常包含標(biāo)記基因，它賦予植物細(xì)胞可選擇的表型。選擇標(biāo)記基因一般可通過合適的基因編碼抗生素抗性，合適的基因包括抗生素大觀霉素抗性編碼基因(例如aada基因)、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPT)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因、起抑制乙酰乳酸合酶(ALS)、特別是抑制磺酰脲型除草劑作用的除草劑抗性的編碼基因(例如因含有導(dǎo)致這種抗性的突變、特別是S4和/或Hra突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、起抑制谷氨酰胺合酶作用的除草劑(例如膦絲菌素或basta)抗性的編碼基因(例如6ar基因)或者本領(lǐng)域已知的其它這類基因。k^基因編碼除草劑basta抗性，ALS基因編碼除草劑氯磺隆抗性。用于在高等植物中進(jìn)行基因表達(dá)的典型載體是本領(lǐng)域眾所周知的，包括得自根癌土壤桿菌誘導(dǎo)根癌的(Ti)質(zhì)粒的載體，參見Rogers等(1987)Me仇五"^no/.153:253-77。這些載體是植物整合性載體，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)化時(shí)，載體將部分載體DNA整合到宿主植物的基因組中。本文可用的示例性根癌土壤桿菌載體是質(zhì)粒pKYLX6和pKYLX7(Schardl等(1987)61:1-11和Berger等(1989)/Voc.A^/.A^/.5W.86:8402-6)。本文另一個(gè)可用的載體是可獲自CLONTECHLaboratories,Inc.(PaloAlto，CA)的質(zhì)粒pBI101.2。宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)采用本發(fā)明的核酸，可以在重組改造的細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者優(yōu)逸植物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。31細(xì)胞以非天然狀況(例如數(shù)量、組成、位置和/或時(shí)間)產(chǎn)生出蛋白質(zhì)，因?yàn)樗鼈円淹ㄟ^人為干預(yù)如按計(jì)劃進(jìn)行了遺傳改造。期望本領(lǐng)域技術(shù)人員已掌握可用于本發(fā)明蛋白質(zhì)編碼核酸表達(dá)的多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)。因此不再試圖詳述用于在原核生物或真核生物中表達(dá)蛋白質(zhì)的各種已知方法。簡而言之，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的分離核酸的表達(dá)通?？赏ㄟ^將例如DNA或cDNA與啟動(dòng)子(它是組成型或是誘導(dǎo)型的)有效連接，隨后摻入表達(dá)載體中來實(shí)現(xiàn)。載體可適于在原核生物或真核生物中復(fù)制并整合。表達(dá)載體通常含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和用于調(diào)節(jié)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA表達(dá)的啟動(dòng)子。為了獲得高水平表達(dá)的克隆基因，需要構(gòu)建表達(dá)載體至少含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子(例如泛素啟動(dòng)子)、用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子。可將組成型啟動(dòng)子歸類以提供各種組成型表達(dá)。因此，有些是弱組成型啟動(dòng)子，有些是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。所謂"弱啟動(dòng)子"一般是指驅(qū)動(dòng)編碼序列按低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。所謂"低水平"是指約1/10,000轉(zhuǎn)錄物至約1/100，000轉(zhuǎn)錄物至約1/500,000轉(zhuǎn)錄物的水平。相反地，"強(qiáng)啟動(dòng)子"驅(qū)動(dòng)編碼序列按"高水平"或約1/10轉(zhuǎn)錄物至約1/100轉(zhuǎn)錄物至約1/1,000轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行表達(dá)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可對本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾但不降低它的生物活性?？梢赃M(jìn)行某些修飾以促進(jìn)克隆、表達(dá)或?qū)ぐ蟹肿訐饺肴诤系鞍?。這類修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括例如將甲硫氨酸添加到N端以提供起始位點(diǎn)，或者將額外的氨基酸(例如polyHis)置于任一端以形成方便定位的限制位點(diǎn)或終止密碼子或純化序列。原核生物中的表達(dá)原核細(xì)胞可用作表達(dá)宿主。原核生物最常用的代表是不同的大腸桿菌菌抹；然而，也可使用其它的微生物菌株。本文定義的包括用于轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子、任選的操縱基因、以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列一起的常用的原核控制序列，包括諸如以下常用的啟動(dòng)子卩內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等(1977)A^wre198:1056)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel等(1980)7Vwc/"c爿"'^A"8:4057)和"汙生PL啟動(dòng)子和N-基因核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shimatake等(1981)7V^we292:128)。在已轉(zhuǎn)進(jìn)大腸桿菌內(nèi)的DNA載體中包含選擇標(biāo)記也是有用的。這類標(biāo)記的實(shí)例包括賦予氨千西林、四環(huán)素或氯霉素抗性的基因。選捧載體以使目標(biāo)基因能夠?qū)牒线m的宿主細(xì)胞。細(xì)菌載體通常是質(zhì)粒或噬菌體源的。合適的細(xì)菌細(xì)胞用嚯菌體載體顆粒感染，或者用棵露的噬菌體載體DNA轉(zhuǎn)染。如果使用質(zhì)粒載體，則細(xì)菌細(xì)胞用質(zhì)粒載體DNA轉(zhuǎn)染。用芽孢桿菌(S"a'〃w取)和沙門氏菌CSa/mo"e〃a)可獲得用于表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)(Palva等(1983)22:229-35;Mosbach等(1983)A^似re302:543-5)。得自Pharmacia的pGEX-4T-l質(zhì)粒載體是本發(fā)明優(yōu)選的大腸桿菌表達(dá)載體。真核生物中的表達(dá)多種真核表達(dá)系統(tǒng)例如酵母、昆蟲細(xì)胞系、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。正如下面簡要說明的一樣，本發(fā)明可在這些真核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，使用如下文中論述的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞，作為生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。酵母中異源蛋白質(zhì)的合成是眾所周知的。Sherman等(1982)MeAoAyecwfGe"e&cs(ColdSpringHarborLaboratory)是公i^的巨著,它4葛述了可在酵母中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的各種方法。用于生產(chǎn)真核蛋白質(zhì)的兩種普遍使用的酵母是釀酒酵母CSacc/owm;;ce;ycerev&z'ae)和巴斯德畢赤酵母(尸fc/^a/aWw7'力。用于在釀酒酵母和畢赤酵母中表達(dá)的載體、菌抹和方案是本領(lǐng)域已知的，可由供應(yīng)商(例如Invitrogen)提供。合適的載體通常根據(jù)需要33具有表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶啟動(dòng)子和復(fù)制起點(diǎn))和終止序列等。本發(fā)明的蛋白質(zhì)一經(jīng)表達(dá)，便可通過使細(xì)胞裂解并將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分離技術(shù)用于裂解物或沉淀，從而從酵母中分離出來。可通過應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)或放射免疫測定法或其它標(biāo)準(zhǔn)免疫測定法技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對純化過程的監(jiān)測。本發(fā)明蛋白質(zhì)的編碼序列還可與用于轉(zhuǎn)染例如哺乳動(dòng)物、昆蟲或植物源的細(xì)胞培養(yǎng)物的各種表達(dá)載體連接。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)常常是單層細(xì)胞的形式，盡管也可使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸液。本領(lǐng)域已開發(fā)出能夠表達(dá)完整蛋白質(zhì)的許多合適的宿主細(xì)胞系，包括HEK293、BHK21和CHO細(xì)胞系。用于這些細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，例如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子(例如CMV啟動(dòng)子、HSV汰啟動(dòng)子或zgA:(磷酸甘油酸激酶)啟動(dòng)子)、增強(qiáng)子(Queen等(1986)/wwtmo/.iev.89:49)和必需的加工信息位點(diǎn)(例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苦酸化位點(diǎn)(例如SV40大TAg加polyA位點(diǎn)))和轉(zhuǎn)錄終止子序列。可從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)細(xì)胞系和雜交瘤目錄(第7版，1992)獲得用于生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的其它動(dòng)物細(xì)胞。用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的合適載體一般得自SF9桿狀病毒。合適的昆蟲細(xì)胞系包括蚊幼蟲、蠶、粘蟲、蛾和果蠅(Draw;/n7a)細(xì)胞系，例如Schneider細(xì)胞系(參見例如Schneider,(1987)/^^70/.五罕.Mo—/.27:353-65)。如使用酵母的情況一樣，當(dāng)使用高等動(dòng)物或植物宿主細(xì)胞時(shí)，聚腺苷酸化序列或轉(zhuǎn)錄終止子序列通常被摻入載體中。終止子序列的一個(gè)實(shí)例是得自牛生長激素基因的聚腺苷酸化序列。還包括用于精確剪接轉(zhuǎn)錄物的序列。剪接序列的一個(gè)實(shí)例是得自SV40的VP1內(nèi)含子(Sprague等(1983)/.K&o/.45:773-81)。另外，可將在宿主細(xì)胞中控制復(fù)制的基因序列摻到載體中，例如存在于牛乳頭瘤型載體的載體(Saveria-Campo,"BovinePapillomaVirusDNAaEukaryoticCloningVector(—種真核克隆載體牛乳頭瘤DNA)",Z)A64C/(m'"g:XfVacrtcfl/々少raac/,笫II巻，Glover主編，IRLPress,Arlington,VA,第213-38頁(1985))。另外，置于合適植物表達(dá)載體上的ERECTA基因可用來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。然后從植物愈傷組織分離出多肽，或者轉(zhuǎn)化細(xì)胞可用來再生出轉(zhuǎn)基因植物?？墒斋@這類轉(zhuǎn)基因植物，并可對合適的組織(例如種子或葉)進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)提取和純化。植物轉(zhuǎn)化方法將外源基因?qū)胫参锏亩喾N方法是已知的，可用來將ERECTA多核苷酸插入植物宿主中，包括生物和物理的植物轉(zhuǎn)化方案。參見例如Miki等,"ProcedureforIntroducingForeignDNAintoPlants(夕卜源DNA導(dǎo)入才直物的方法)，，，尸/fl"fA/b/ecw/ar5z'o/ogy所o,ec/mo/ogy，Glick和Thompson主編，CRCPress,Inc.，BocaRaton,第67-88頁(1993)。所選擇的方法因宿主植物而異，包括化學(xué)轉(zhuǎn)染方法(例如磷酸鉤法)、微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(例如土壤桿菌)(Horsch等(1985)227:1229-31)、電穿孔、顯微注射和生物射彈轟擊。用于植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和植物再生的表達(dá)盒和栽體以及體外培養(yǎng)方法是已知并可獲得的。參見例如Gruber等，"VectorsforPlantTransformation(才直物轉(zhuǎn)4匕的載體)"，載于P/tmfA/o/eoJar5Zo/ogy5w&c/mo/ogy,出處同上，第89-119頁?？梢酝ㄟ^通常用于直接遞送給細(xì)胞的一種或多種技術(shù)，將分離多核苷酸或分離多肽導(dǎo)入植物中。這類方案可隨基因修飾所靶定的生物、細(xì)胞、植物或植物細(xì)胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)而變化。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞合適的方法包括顯微注射(Crossway等(1986)所ofec/mz'^as354:320-334和美國專利第6,300,543號)、電穿孔(Riggs等(1986)尸rac.A^/.力o^.WX483:5602-5606)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等(1984)五M503:2717-2722)和射彈粒子加速法(ballisticparticleacceleration)(參見例如Sanford等，美國專利第4,945,050號；WO91/10725;以及McCabe等(1988)5/ofec/mo/柳6:923-926)。另參見Tomes等,DirectDNATransferintoIntactPlantCellsViaMicroprojectileBombardment(通過微粒轟擊使DNA直接轉(zhuǎn)移到完整植物細(xì)胞中)，第197-213頁，載于尸/aWCe//,r^weam/OrgcmCw/似re,Fwwflamewto/A/e^oc^，Q.L.Gamborg禾口G.C.Phillips主編，Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork,1995;美國專利第5，736，369號(分生組織)；Weissinger等(19S8)^肌iev.22:421-477;Sanford等(1987)尸aWcwtoeSde"ceawe/Tec/mo/ogy5:27-37(洋蔥)；Christou等(簡)Pte》/.87:671-674(大豆)；Datta等(1990)5ZWec/z"o/ogv8:736-740(水稻)；Klein等(1988)尸rac.7Vaf/.^c^/.L^X485:4305-4309(玉米)；Klein等(1988)5〖Wec/mo,ogy6:559-563(玉米)；WO91/10725(玉米);Klein等(1988)尸/aW尸/^z'o/.91:440-444(玉米);Fro腿等(1990)Biotechnology8:833剛839;以及Gordon-Kamm等(1990)P/aWCe//2:603-618(玉米)；Hooydaas-VanSlogteren&Hooykaas(1984)iVaft^e(London)311:763-764;Bytebier等(1987)iVa"爿cczJ.84:5345-5349(百合科(Liliaceae));DeWet等(1985)'載于7Tze五jc;m'we"to/A/纖》w/加'owo/(9vw/e77iww&s,G.P.Chapman等，第197-209頁,Longman,NY(花粉)；Kaeppler等(1990)P/fl"fCe〃/e;wfs9:415-418;以及Kaeppler等(1992)7%艦徹/.G匿A84:560-566(頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；美國專利第5,693,512號(超聲處理)；D，Halluin等(1992)尸/a",Ce〃4:1495-1505(電穿孔)；Li等(1993)尸/a"《CW/ie/orto12:250-255;以及Christou和Ford(1995)^畫&o/5oto"_y75:407-413(水稻)；Osjoda等(1996)淑,胸ec/.14:745-750;土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化(美國專利第5，981，840號);碳化珪晶須(siliconcarbidewhisker)方法(Frame等(1994)尸/a"f/6:941-948);激光方法(Guo等(1995)尸/yw'o/ogz'fl尸/a"tanw293:19_24);超聲處理方法(Bao等(1997)L^nxyowm/〖"MWa'wecfe胸/ogy23:953-959;Finer和Finer(2000)j;;/Mz'cro&o/.30:406-10;Amoah等(2001)JExp5of52:1135-42);聚乙二醇方法(Krens等(1982);V^we296:72-77);單子葉植物和雙子葉植物細(xì)胞的原生質(zhì)體可用電穿孔(Fromm等(1985)A^/.4cc^.OX482:5824-5828)和顯微注射(Crossway等(1986)M/.G饑202:179-185進(jìn)行轉(zhuǎn)化；所述所有文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體導(dǎo)入植物的最普遍使用的方法以土壤桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為基礎(chǔ)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌(AW^ogewe力是植物致病性土壤細(xì)菌，它從遺傳上轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒和發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒分別攜帶負(fù)責(zé)遺傳轉(zhuǎn)化植物的基因。參見例如Kado，(1991)iev.尸/cm""'.10:1。有關(guān)用于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的土壤桿菌載體系統(tǒng)和方法的描述參見Gruber等(出處同上)、Miki等(出處同上)和Moloney等(1989)P/"WCe〃i印oW8:238。同樣，可將基因插入分別得自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒或發(fā)根土壤桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)。因此，可以用這些質(zhì)粒根據(jù)以上所述來構(gòu)建表達(dá)盒。多種控制序列是已知的，當(dāng)其與異源編碼序列偶聯(lián)并轉(zhuǎn)化到宿主生物內(nèi)時(shí)，相對于原始編碼序列的組織/器官特異性，在基因表達(dá)時(shí)具有保真度。參見例如Benfey和Chua,(1989)5Wewce244:174-81。用于這異性表達(dá)的啟動(dòng)子。其它有用的控制序列包括得自胭脂堿合酶基因(NOS)的啟動(dòng)子和終止子。NOS啟動(dòng)子和終止子存在于質(zhì)粒pARC2中，可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，并被命名為ATCC67238。如果使用這類37系統(tǒng)，則還需存在來自Ti或Ri質(zhì)粒的毒力(v的基因，所述毒力基因或者連同T-DNA部分一起存在，或者借助其中v!y基因存在于單獨(dú)載體上的二元系統(tǒng)。這類系統(tǒng)、用于其中的栽體，以及轉(zhuǎn)化^f直物細(xì)胞的方法參見美國專利第4,658,082號；1986年10月1日提交的美國專利申請?zhí)?13,914,正如1993年11月16日授予的美國專利第5,262,306號中所引用的一樣；以及Simpson等(1986)尸/a"fMo/.所o/.6:403-15(同樣在'306專利中引用)；所述所有文獻(xiàn)均通過引用全部結(jié)合到本文中。這些質(zhì)粒一經(jīng)構(gòu)建，便可置于發(fā)根土壤桿菌或根癌土壤桿菌以及用于轉(zhuǎn)化植物品種的細(xì)胞的載體中，所述植物品種通常易受鐮孢(/^san'wm)或鏈格孢04/teman'a)感染。本發(fā)明還包括若干其它的轉(zhuǎn)基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三葉草、甘藍(lán)、香蕉、咖啡樹、芹菜、煙草、豆工豆、棉花、甜瓜和辣椒。根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌任一種的選擇將取決于其轉(zhuǎn)化的植物。根癌土壤桿菌一般是用于轉(zhuǎn)化的優(yōu)選生物。大多數(shù)雙子葉植物、一些棵子植物和少數(shù)單子葉植物(例如某些百合目(丄z7iafe力和天南星目(Jra/e力的某些成員)易受根癌土壤桿菌感染。發(fā)根土壤桿菌的宿主范圍也十分廣，包括大多數(shù)雙子葉植物和一些棵子植物，它們包括豆科(Legwmz'"cwae)、菊科(Comp(wtoe)和藜科(C7^"o/ofifeceae)成員。目前單子葉植物的轉(zhuǎn)化也取得了一定成效。歐洲專利申請?zhí)?04662Al公開了利用土壤桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。歐洲專利申請?zhí)?72752Al公開了使用未成熟胚盾蓋用土壤桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。Ishida等人對通過將未成熟胚暴露于根癌土壤桿菌以轉(zhuǎn)化玉米的方法進(jìn)行了論述(iVaft^e萬z'wec/mo/ogy14:745-50(1996))。這些細(xì)胞一經(jīng)轉(zhuǎn)化，則可用來再生轉(zhuǎn)基因植物。例如可通過割傷植物然后將載體引入傷口部位，從而用這些載體感染整林植物?？梢愿顐参锏娜魏谓M成部分，包括葉、莖和根。或者，可將這些載體接種到外植體形式的植物組織中，例如子葉組織或葉盤，并在促進(jìn)植物再生的條38件下進(jìn)行培養(yǎng)。用發(fā)根土壤桿菌或根癌土壤桿菌接種植物組織轉(zhuǎn)化得到的根或莖干(含有串珠鐮孢黃菌素降解酶編碼基因)，可用作植物組織源，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生或器官發(fā)生，再生出串珠鐮孢黃菌素抗性轉(zhuǎn)基因植物。再生植物組織的這類方法的實(shí)例公開于Shahin,(1985)7Teor.G,"9:23540;美國專利第4,658,082號；Simpson等(出處同上);以及1986年10月1日同時(shí)提交的美國專利申請?zhí)?13,913和913,914,如在1993年11月16日授予的美國專利第5,262,306號中引用一樣，該處的全部公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。直接基因轉(zhuǎn)移盡管土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的宿主范圍較廣，但是一些主要谷類農(nóng)作物品種和棵子植物通?？咕苓@種模式的基因轉(zhuǎn)移，即使最近在水稻中取得一定成果(Hiei等(1994)P/a"Z/owma/6:271-82)。已經(jīng)開發(fā)出替代土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的若干種植物轉(zhuǎn)化方法，統(tǒng)稱為直接基因轉(zhuǎn)移。普遍適用的植物轉(zhuǎn)化方法是微彈介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中尺寸約為l-4|Lim的微彈表面上攜帶DNA。用將微彈加速至300-600m/秒速度的生物射彈裝置，將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織中，該速度足以穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜(Sanford等(1987)Tec/mo/.5:27;Sanford，(1988)7Vew^5/o&c/6:299;Sanford,(1990)P/j;^'o/.P/awf79:206;以及Klein等(1992)5/ofec/mo/og^10:268)。將DNA物理性傳遞到植物中的另一種方法是對耙細(xì)胞進(jìn)行超聲處理，參見Zang等(1991)所orec/mo/ogy9:996?；蛘撸褂弥|(zhì)體或原生質(zhì)球融合將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中。參見例如Deshayes等(l985)乂4:2731;以及Christou等(1987)iVa".v4cadt/5L484:3962。有研究報(bào)道了采用CaClz沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鳥氨酸使DNA直接被攝取進(jìn)入原生質(zhì)體。參見例如Hain等(19S5)Mo/.Gew^.199:161;以及z'o/.23:451。還有研究纟皮露了原生質(zhì)體和整個(gè)細(xì)胞和組織的電穿孔。參見例如Donn等，載于爿6對racteo/FZ/,/7hf7.CowgreASow尸/awfCe〃朋c/775孤eCw/m""尸7U("/TC第七屆國際植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)會(huì)議文摘)，A2-38,第53頁(1990);D'Halluin等(1992)尸/朋fCe〃4:1495-505;以及Spencer等(1994)尸/a"/Mo/.歷o/.24:51-61。提高ERECTA多肽的活性和/或水平本發(fā)明提供提高本發(fā)明ERECTA多肽的活性和/或水平的方法。可通過向植物提供ERECTA多肽來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明ERECTA多肽的水平和/或活性的提高。可通過將編碼ERECTA多肽的tt酸序列導(dǎo)入植物、將編碼ERECTA多肽的核苷酸序列導(dǎo)入植物或者通過對編碼本發(fā)明ERECTA多肽的基因組基因座進(jìn)行修飾，來提供ERECTA多肽。如本文其它部分所述，本領(lǐng)域已知向植物提供多肽的多種方法，包括但不限于將多肽直接導(dǎo)入植物、將編碼具有植物生長調(diào)節(jié)活性的多肽的多核苷酸構(gòu)建體(瞬時(shí)或穩(wěn)定地)導(dǎo)入植物。還要了解的是，本發(fā)明的方法可釆用無法在轉(zhuǎn)化植物中指導(dǎo)蛋白質(zhì)或RNA表達(dá)的多核普酸。因此，可通過改變編碼ERECTA多肽的基因或其啟動(dòng)子來提高ERECTA多肽的水平和/或活性。參見例如Kmiec，美國專利第5,565,350號；Zarling等，PCT/US93/03868。因此，本發(fā)明提供攜帶ERECTA基因突變的經(jīng)誘變的植物，其中所述突變增加ERECTA基因的表達(dá)或提高已編碼的ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育的活性。降低ERECTA多肽的活性和/或水平本發(fā)明提供了通過用表達(dá)抑制ERECTA多肽表達(dá)的多核苷酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，來降低或消除本發(fā)明ERECTA多肽活性的方法。所述多核苷酸可通過防止ERECTA信使RNA翻譯，直接抑制ERECTA多肽的表達(dá)；或者通過編碼抑制編碼ERECTA多肽的ERECTA基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的多肽，間接抑制ERECTA多肽表達(dá)。用于在植物中抑制或消除基因在植物中表達(dá)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，而且任何的這類方法都可用于本發(fā)明以抑制ERECTA多肽的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，以下情況說明ERECTA多肽的表達(dá)受到抑制ERECTA多肽的蛋白質(zhì)水平低于未經(jīng)遺傳修飾或誘變以抑制同一ERECTA表達(dá)的植物中該ERECTA多肽的蛋白質(zhì)水平的70%。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，在本發(fā)明的改性植物中，ERECTA多肽的蛋白質(zhì)水平低于不是突變型或未經(jīng)遺傳修飾以抑制ERECTA多肽表達(dá)的植物中的同一ERECTA多肽蛋白質(zhì)水平的60%、低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于10%、低于5%或低于2%?？梢酝ㄟ^例如測定ERECTA多肽在植物細(xì)胞或植物中的表達(dá)水平，來直接測定ERECTA多肽的表達(dá)水平；或者可以通過例如測定ERECTA多肽在植物細(xì)胞或植物中的植物生長和/或器官發(fā)育活性，或測定植物的生物量，來間接測定ERECTA多肽的表達(dá)水平。用于進(jìn)行這類測定的方法見本文其它部分的描述。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，通過用包含編碼抑制ERECTA多肽活性的多肽的多核苷酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，降低或消除ERECTA多肽的活性。根據(jù)本發(fā)明，以下情況說明ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性受到抑制ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性小于未經(jīng)改性以抑制該ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性的植物的同一ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性的70%。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明改性植物的ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性小于未經(jīng)改性以抑制ERECTA多肽表達(dá)的植物的同一ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性的60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%或小于5%。當(dāng)使用本文其它部41分所述測定方法未檢出ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性時(shí)，則表示本發(fā)明ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性被"消除"。ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性的測定方法見本文其它部分的描述。在其它實(shí)施方案中，可通過破壞ERECTA多肽的編碼基因，來降低或消除ERECTA多肽的活性。本發(fā)明包括在ERECTA基因中攜帶突變的誘變植物，其中突變降低ERECTA基因的表達(dá)或者抑制編碼的ERECTA多肽的植物生長和/或器官發(fā)育活性。因此，可以采用多種方法以降低或消除ERECTA多肽的活性。另夕卜，可使用不止一種方法來降低單一ERECTA多肽的活性。下文中給出了降低或消除ERECTA多肽表達(dá)的方法的非限制性實(shí)例。丄基于多核苷酸的方法在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用能夠表達(dá)抑制本發(fā)明ERECTA多肽表達(dá)的多核苷酸的表達(dá)盒來轉(zhuǎn)化植物。本文所用術(shù)語"表達(dá)"是指基因產(chǎn)物的生物合成，包括所述基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或翻"^奪。例如，對于本發(fā)明的目的，能夠表達(dá)抑制至少一種ERECTA多肽表達(dá)的多核普酸的表達(dá)盒是能夠產(chǎn)生抑制至少一種本發(fā)明ERECTA多肽轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的RNA分子的表達(dá)盒。由DNA分子"表達(dá)"或"產(chǎn)生"蛋白質(zhì)或多肽是指產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，而由RNA分子"表達(dá)"或"產(chǎn)生，，蛋白質(zhì)或多肽則是指產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽的RNA編碼序列進(jìn)行翻譯。抑制ERECTA多肽表達(dá)的多核苷酸的實(shí)例見下文。/.有義抑制/共抑制在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可通過有義抑制(sensesuppression)或共抑制(cosuppression)來達(dá)到ERECTA多肽表達(dá)的抑制。對于共抑制，表達(dá)盒被設(shè)計(jì)成表達(dá)RNA分子，該RNA分子對當(dāng)于按"有義"方向編碼ERECTA多肽的信使RNA的全部或部分。該RNA分子的過量表達(dá)可導(dǎo)致天然基因表達(dá)的降低。因此，對用共抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的得到多個(gè)植物系進(jìn)行篩選，以鑒定ERECTA多肽表達(dá)受最大抑制的植物系。用于共抑制的多核苷酸可相當(dāng)于ERECTA多肽編碼序列的全部或部分、ERECTA多肽轉(zhuǎn)錄物5'和/或3'非翻譯區(qū)的全部或部分、或者編碼ERECTA多肽的轉(zhuǎn)錄物的編碼序列以及非翻譯區(qū)兩者的全部或部分。在其中多核苷酸包含ERECTA多肽編碼區(qū)全部或部分的一些實(shí)施方案中，表達(dá)盒被設(shè)計(jì)來消除多核苷酸的起始密碼子，從而不翻譯任何蛋白質(zhì)產(chǎn)物。可利用共抑制來抑制植物基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生這樣植物，其中測不出由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水平。參見例如Broin等(2002)尸/fl^Ce〃14:1417-1432。還可利用共抑制來抑制同一植物中多種蛋白質(zhì)的表達(dá)。參見例如美國專利第5,942,657號。利用共抑制來抑制植物內(nèi)源基因表達(dá)的方法參見Flavell等(1994)JV^/.A;^/.5W.91:3490-3496;Jorgensen等(1996)尸/aWMo/.Ao/.31:957-973;Johansen和Carrington(2001)/V朋,尸/^Wo/.126:930-938;Broin等(2002)尸/a"fCe〃14:1417-1432;Stoutjesdijk等(2002)尸/a"f129:1723-1731;Yu等(2003)尸/^toc/je/m;^y63:753-763;以及美國專利號5,034,323、5,283,184和5,942,657;所述每個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。通過在表達(dá)盒有義序列的3'端位置包括poly-dT區(qū)以及5'包括聚腺苷酸化信號，來提高共抑制的效率。參見美國專利公布號20020048814,該專利通過引用結(jié)合到本文中。這類核苷酸序列通常與內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄物的序列具有基本序列同一性，宜大于約65%序列同一性，更宜大于約85%序列同一性，最宜大于約95%序列同一性。參見美國專利號5,283,184和5,034,323;所述專利通過引用結(jié)合到本文中。43"反義抑制在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以通過反義抑制實(shí)現(xiàn)對ERECTA多肽表達(dá)的抑制。對于反義抑制，表達(dá)盒被設(shè)計(jì)來表達(dá)與編碼ERECTA多肽的信使RNA的全部或部分互補(bǔ)的RNA分子。反義RNA分子的過量表達(dá)可導(dǎo)致天然基因的表達(dá)降低。因此，對用反義抑制表達(dá)盒轉(zhuǎn)化得到的多個(gè)植物系進(jìn)行篩選，以鑒定ERECTA多肽表達(dá)受最大抑制的植物系。用于反義抑制的多核苷酸可相當(dāng)于ERECTA多肽編碼序列的互補(bǔ)序列的全部或部分、ERECTA轉(zhuǎn)錄物5'和/或3啡翻譯區(qū)的互補(bǔ)序列的全部或部分或者編碼ERECTA多肽的轉(zhuǎn)錄物的編碼序列和非翻譯區(qū)兩者的互補(bǔ)序列的全部或部分。另外，反義多核苷酸可與耙序列完全互補(bǔ)(即與革巴序列的互補(bǔ)序列同一性為100%)或部分互補(bǔ)(即與輩巴序列的互補(bǔ)序列的同一性小于100%)。反義抑制可用來抑制同一植物多種蛋白質(zhì)的表達(dá)。參見例如美國專利第5,942,657號。此外，部分反義核苷酸可用來破壞耙基因的表達(dá)。一般可采用至少50個(gè)核苦酸、IOO個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸、300、400、450、500、550個(gè)以上核普酸的序列。用反義抑制以抑制植物內(nèi)源基因表達(dá)的方法參見例如Liu等(2002)P/aW尸/yw'o/.129:1732-1743和美國專利號5,759,829和5,942,657,所述文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中?？赏ㄟ^在表達(dá)盒反義序列3'端位置包括poly-dT區(qū)以及包括5'聚腺苷酸化信號，來提高反義抑制的效率。參見美國專利公布號20020048814，該專利通過引用結(jié)合到本文中。iii.雙鏈RNA干擾在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以通過雙鏈RNA(dsRNA)干擾實(shí)現(xiàn)對ERECTA多肽表達(dá)的抑制。對于dsRNA干擾，在同一細(xì)胞中表達(dá)如互補(bǔ)的反義RNA分子，導(dǎo)致對相應(yīng)內(nèi)源信使RNA表達(dá)的抑制。通過設(shè)計(jì)同時(shí)包含有義序列和反義序列的表達(dá)盒，可實(shí)現(xiàn)有義和反義分子的表達(dá)?；蛘?，可以使用有義序列和反義序列分開的表達(dá)盒。用dsRNA干擾表達(dá)盒轉(zhuǎn)化多個(gè)植物系，或者之后對表達(dá)盒進(jìn)行篩選，以鑒定ERECTA多肽表達(dá)受最大抑制的植物系。用dsRNA干擾以抑制內(nèi)源植物基因表達(dá)的方法參見Waterhouse等(1998)A/af/.^cac/,L/iSJ95:13959-13964;Liu等(2002)P/朋fP/yw》/.129:1732-1743;以及WO99/49029、WO99/53050、WO99/61631和WO00/49035;所述每個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。/v.發(fā)夾RNA干擾和含有內(nèi)含子的發(fā)夾RNA干擾在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以通過發(fā)夾RNA(hpRNA)干擾或含有內(nèi)含子的發(fā)夾RNA(ihpRNA)干擾，來獲得對ERECTA多肽之一的表達(dá)的抑制。這些方法在抑制內(nèi)源基因表達(dá)中非常有效。參見Waterhouse和Helliwell(2003)A^.iev.4:29-38及其中引用的參考文獻(xiàn)。對于hpRNA干擾，表達(dá)盒被設(shè)計(jì)成表達(dá)與自身雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含單鏈環(huán)區(qū)和堿基配對莖。堿基配對莖區(qū)包含相當(dāng)于編碼其表達(dá)將被抑制的基因的內(nèi)源信使RNA全部或部分的有義序列，以及與該有義序列完全或部分互補(bǔ)的反義序列。因此，該分子的堿基配對莖區(qū)一般決定RNA干擾的特異性。hpRNA分子在抑制內(nèi)源基因表達(dá)時(shí)十分有效，它們誘導(dǎo)的RNA干擾被遺傳給植物后代。參見例^口Chuang和Meyerowitz(2000)尸rac.A^"^cadL/S497:4985-4990;Stoutjesdijk等(2002)尸/a^尸A"/0/.129:1723-1731;以及Waterhouse和Helliwell(2003)iV^.iev.4:29-38。用hpRNA干擾抑制基因表達(dá)或使基因表達(dá)沉默的方法參見例如Chuang和Meyerowitz(2000)iVoc.Ato/.C/5L497:4985-4990;Stoutjesdijk等(20Q2)P/aW45尸/j;w'o/.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)iV化iev.4:29-38;Pandolfini等，SMC5z'o&cA"o/ogy3:7;以及美國專利公布號20030175965;所述每個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。hpRNA構(gòu)建體體內(nèi)使基因表達(dá)沉默的效率的瞬時(shí)測定法參見Panstruga等(2003)Mo/.30:135-140，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。對于ihpRNA，該干擾分子具有與hpRNA相同的通用結(jié)構(gòu)，但是該RNA分子另包含在ihpRNA進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞中能夠被剪接的內(nèi)含子。內(nèi)含子的使用使發(fā)夾RNA分子環(huán)的大小在剪接后減到最小，這就提高了干擾的效率。參見例如Smith等(2000)A/^we407:319-320。實(shí)際上，Smith等人指出，用ihpRNA介導(dǎo)的干擾100%抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。用ihpRNA干擾以抑制內(nèi)源植物基因表達(dá)的方法參見例如Smith等(20(X))A^wre407:319-320;Wesley等(2001)尸/a"〃.27:581-590;Wang和Waterhouse(2001)CWr.O戸'"，尸/朋f歷o/.5:146-150;Waterhouse和Helliwell(2003)A^.GWz".4:29-38;Helliwell和Waterhouse(2003)30:289-295以及美國專利公布號20030180945,所述每個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。還可設(shè)計(jì)這樣的hpRNA干擾表達(dá)盒，使得有義序列和反義序列不與內(nèi)源RNA相對應(yīng)。在本實(shí)施方案中，有義序列和反義序列在包含與把基因內(nèi)源信使RNA全部或部分相應(yīng)'的核芬酸序列的環(huán)序列的兩側(cè)。因此，正是該環(huán)區(qū)決定了RNA干擾的特異性。參見例如WO02/00904，該專利通過引用結(jié)合到本文中。v，擴(kuò)增子介導(dǎo)的干擾擴(kuò)增子表達(dá)盒包含植物病毒衍生的序列，該序列含有靶基因的全部或部分，但是一般不含天然病毒基因的全部。表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在的病毒序列使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠指導(dǎo)自我復(fù)制。由擴(kuò)增子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物相對于把序列(即ERECTA多肽的信使RNA)可以是有義或反義的。用擴(kuò)增子抑制內(nèi)源植物基因表達(dá)的方法參見例如Angell和Baulcombe(1997)丄16:3675-3684;Angell和Baulcombe(1999)尸/a"fJ20:357-362;以及美國專利第6，646，805號，所述每個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。v/.核酶在一些實(shí)施方案中，通過本發(fā)明表達(dá)盒表達(dá)的多核苷酸是催化性RNA或具有對ERECTA多肽信使RNA有特異性的核酶活性。因此，該多核苷酸引起內(nèi)源信使RNA降解，導(dǎo)致ERECTA多肽表達(dá)降低。該方法參見例如美國專利笫4,987,071號，該專利通過引用結(jié)合到本文中。W/.小干擾RNA或孩史小RNA在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)微小RNA(miRNA)編碼基因的表達(dá)通過RNA干擾來實(shí)現(xiàn)對ERECTA多肽表達(dá)的抑制。miRNA是由約22個(gè)核糖核苷酸組成的調(diào)節(jié)劑。miRNA在抑制內(nèi)源基因表達(dá)中非常有效。參見例如Javier等(2003)iVaft^e425:257-263，.該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。對于miRNA干擾，表達(dá)盒被設(shè)計(jì)成表達(dá)模仿內(nèi)源miRNA基因的RNA分子。所述miRNA基因編碼形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA,所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)含有與另"內(nèi)源基因(靶序列)互補(bǔ)的22個(gè)核苦酸的序列。對于抑制ERECTA表達(dá)，22個(gè)核苷酸的序列選自ERECTA轉(zhuǎn)錄物序列，并含有所述ERECTA序列按有義方向的22個(gè)核苷酸以及對應(yīng)于與有義序列互補(bǔ)的反義序列的21個(gè)核苷酸。miRNA分子在抑制內(nèi)源基因表達(dá)中非常有效，且它們誘導(dǎo)的RNA干擾被遺傳給植物后代。472.基于多肽的基因表達(dá)的抑制在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸編碼與ERECTA多肽編碼基因結(jié)合的鋅指蛋白，導(dǎo)致基因表達(dá)降低。在具體實(shí)施方案中，鋅指蛋白與ERECTA基因的調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，鋅指蛋白與編碼ERECTA多肽的信使RNA結(jié)合并阻止其進(jìn)行翻譯。選擇被鋅指蛋白耙向的位點(diǎn)的方法參見例如美國專利第6,453,242號，利用鋅指蛋白抑制植物中基因表達(dá)的方法參見例如美國專利公布號20030037355;所述每個(gè)專利均通過引用結(jié)合到本文中。義基于多肽的蛋白質(zhì)活性的抑制在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，多核苷酸編碼與至少一種ERECTA多肽結(jié)合的抗體，并降低ERECTA多肽的植物生長調(diào)節(jié)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體的結(jié)合通過細(xì)胞質(zhì)量控制機(jī)制使抗體-ERECTA復(fù)合體的更新加快。植物細(xì)胞中抗體的表達(dá)，以及植物細(xì)胞中通過抗體表達(dá)及抗體與蛋白質(zhì)的結(jié)合來進(jìn)行的抑制分子途徑是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如Conrad和So皿ewald(2003)JVWww所Wec/.21:35-36,該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。4.基因破壞在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過破壞編碼ERECTA多肽的基因來降低或消除ERECTA多肽的活性。可以通過本領(lǐng)域已知方法石皮壞編碼ERECTA多肽的基因。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，基因被轉(zhuǎn)座子標(biāo)記破壞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用隨機(jī)誘變或定向誘變對植物進(jìn)行誘變來破壞基因，并選出植物生長調(diào)節(jié)活性降低的植物。/.轉(zhuǎn)座子標(biāo)記在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座子標(biāo)記用來降低或消除一種或多種ERECTA多肽的ERECTA活性。轉(zhuǎn)座子標(biāo)記包括將轉(zhuǎn)座子插入內(nèi)源ERECTA基因中以降低或消除ERECTA多肽的表達(dá)。"ERECTA基因，，是指編碼本發(fā)明ERECTA多肽的基因。在本實(shí)施方案中，通過將轉(zhuǎn)座子插入ERECTA多肽編碼基因的調(diào)節(jié)區(qū)或編碼區(qū)來降低或消除一種或多種ERECTA多肽的表達(dá)?？梢允褂迷谕怙@子、內(nèi)含子、5'或3'非翻譯序列、啟動(dòng)子或ERECTA基因的任何其它調(diào)節(jié)序列內(nèi)的轉(zhuǎn)座子來降低或消除編碼ERECTA多肽的表達(dá)和/或活性。植物中用于特定基因轉(zhuǎn)座子標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如Maes等(1999)JVewfe尸/a"f4:90陽96;Dharmapuri和Sonti(1999)^fiMS"M,cra^'o/.丄e".179:53-59;Meissner等(2000)22:265-274;Phogat等(2000)5zVwcz'.25:57-63;Walbot(2000)Cwrr.尸/a"f歷o/.2:103-107;Gai等(2000)M/c/dc^"^sA"28:94-96;Fitzmaurice等(1999)Generics153:1919-1928)。另外，在選定基因中選出p插入的TUSC法參見Bensen等(1995)尸/a"fCe//7:75-84;Mena等(1996)Sdewce274:1537-1540;以及美國專利第5,962,764號；所述每個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。,7.活性降低的突變型植物的，同樣可適用于本發(fā)明。這些方法包括其它誘變形式，例如曱磺酸乙酯誘導(dǎo)的誘變、缺失誘變和用于在(用PCR)反向遺傳學(xué)有義(reversegeneticssense)的快速中子缺失誘變(fastneutrondeletionmutagenesis),以鑒定其中內(nèi)源基因已缺失的植物系。這些方法的實(shí)例參見Ohshima等(1998)Wra/ogy243:472-481;Okubara等(1994)Gewe"cs137:867-874;以及Quesada等(2000)154:421-436;所述每個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。另外，用于篩選化學(xué)誘導(dǎo)突變的自動(dòng)化快速方法TILLING(定向i秀導(dǎo)基因組局部突變法(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes)),利用變性HPLC或選擇性內(nèi)切核酸酶消化選出的PCR產(chǎn)物，同樣適用于本發(fā)明。參見McCallum等(2000)Ato.5z'o&c/mo/.18:455-457，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。影響基因表達(dá)或者干擾編碼蛋白質(zhì)的功能(植物生長調(diào)節(jié)活性)的突變是本領(lǐng)域眾所周知的。在基因外顯子中的插入突變常常導(dǎo)致無效突變體。保守殘基的突變在抑制編碼蛋白質(zhì)的植物生長調(diào)節(jié)活性時(shí)特別有效。肽的保守殘基。這類突變型可按照眾所周知的方法分離出來，而且不同ERECTA基因座中的突變可以通過遺傳雜交堆積。參見例如Gruis等(2002)尸/""fCe〃14:2863-2882。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，顯性突變型可用來引發(fā)由復(fù)制基因座的基因倒置和重組基因所致的RNA沉默。參見例如Kusaba等(2003)/WCe//15:1455-1467。本發(fā)明包括用于降低或消除一種或多種ERECTA多肽活性的其它領(lǐng)域已知的，包括但不限于使用RNA:DNA載體、RNA:DNA突變載體、RNA:DNA修復(fù)載體、混合雙鏈體寡核苷酸(mixed-duplexoligonucleotide)、自身互補(bǔ)的RNA:DNA寡核苷酸(self-complementaryRNA:DNAoligonucleotide)和誘重組的寡核苷酸石咸基(recombinogenicoligonucleobase)。這類載體和4吏用方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如美國專利號5，565，350、5,731,181、5,756，325、5，760,012、5,795,972和5,871,984;所述每個(gè)專利均通過引用結(jié)合到本文中。另參見WO98/49350、WO5099/07865、WO99/25821和Beetham等(1999)iVa".ZcfldL/5L496:8774-8778;所述每個(gè)專利均通過引用結(jié)合到本文中。調(diào)節(jié)植物生長和/或器官發(fā)育活性在具體方法中，植物中特定組織生長的水平和/或活性隨植物中ERECTA多肽水平或活性的提高而提高。本文其它部分論述了用于提高植物中ERECTA多肽的水平或活性的方法。簡單來說，這類方法包括向植物提供本發(fā)明的ERECTA多肽從而提高ERECTA多肽的水平或活性。在其它實(shí)施方案中，可按如下方式提供編碼ERECTA多肽的ERECTA核苷酸序列將包含本發(fā)明ERECTA核苷酸序列的多核苷酸導(dǎo)入植物，使ERECTA序列進(jìn)行表達(dá)，提高ERECTA多肽的活性，從而增加植物或植物組成部分中的組織細(xì)胞數(shù)。在其它實(shí)施方案中，導(dǎo)入植物的ERECTA核普酸構(gòu)建體被穩(wěn)定摻入植物的基因組。在其它方法中，通過提高植物中ERECTA多肽的水平和/或活性來增加細(xì)胞數(shù)和植物組織的生物量。本文其它部分詳細(xì)公開了這類方法。在這類的一種方法中，ERECTA核苷酸序列被導(dǎo)入植物，且所述ERECTA核苦酸序列的表達(dá)降低ERECTA多肽的活性，從而加快植物或植物組成部分的植物生長和/或器官發(fā)育。在其它實(shí)施方案中，導(dǎo)入植物的ERECTA核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定摻入植物的基因組。育多核苦酸和多肽的水平/活性的合適的啟動(dòng)子。本文其它部分^^開了該實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明還提供當(dāng)與對照植物組織的植物生長和/或器官發(fā)育相比時(shí)，植物生長和/或器官發(fā)育得到改進(jìn)的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中的本發(fā)明ERECTA多肽的水平/活性提高，從而植物組織中植物生長和/或器官發(fā)育加快。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中的本發(fā)明ERECTA多肽水平降低或消除，從而植物組織中植物生長和/或器官發(fā)育減緩。在其它實(shí)施方案中，這類植物具有穩(wěn)定摻入其基因組的核酸分子，該核酸分子包含與在植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子有效連接的本發(fā)明ERECTA核苷酸序列。/v.調(diào)節(jié)根發(fā)育本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)植物根發(fā)育的方法。所謂"調(diào)節(jié)根發(fā)育"是指當(dāng)與對照植物相比時(shí)，植物根發(fā)育中產(chǎn)生的任何變化。這類根發(fā)育中的變化包括但不限于初生根生長率、新鮮根重、側(cè)根和不定根形成程度、維管系統(tǒng)、分生組織發(fā)育或輻射延伸的變化。本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)植物根發(fā)育的方法。該方法包括調(diào)節(jié)植物ERECTA多肽的水平和/或活性。在一種方法中，向植物提供本發(fā)明的ERECTA序列。在另一種方法中，按如下方式提供ERECTA核苷酸序列將包含本發(fā)明ERECTA核香酸序列的多核苷酸導(dǎo)入植物，使ERECTA序列進(jìn)行表達(dá)，從而改善根發(fā)育。在另外的其它方法中，導(dǎo)入植物的ERECTA核苷酸構(gòu)建體穩(wěn)定摻入植物基因組。在其它方法中，通過改變植物中ERECTA多肽的水平或活性來調(diào)節(jié)根發(fā)育。當(dāng)與對照植物相比時(shí)，ERECTA活性的提高可引起至少一種或多種根發(fā)育的下列變化，包括但不限于根分生組織變大、根生長加快、輻射延伸加強(qiáng)、維管系統(tǒng)增加、根分支增加、不定根較多和/或新鮮根重增加。本文所用"根生長"包括在單子葉植物和雙子葉植物根系發(fā)育不同階段構(gòu)成根系不同部分的生長的所有方面。要了解的是，根生長的加快可以由根的一個(gè)或多個(gè)組成部分(包括初生根、側(cè)根、不定根等)的生長加快引起。測定根系的這類發(fā)育變化的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如美國專52利申請?zhí)?0030074698和Werner等(2001)尸A^S118:10487-10492,這兩個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。如上所述,技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解用來調(diào)節(jié)植物根發(fā)育的合適的啟動(dòng)子。本實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子和根優(yōu)選的啟動(dòng)子(root-preferredpromoter)。本文其它部分公開了示例性的根優(yōu)選的啟動(dòng)子。通過提高ERECTA多肽的活性和/或水平以刺激根生長和增加根質(zhì)量還用于改善植物的抗倒伏性(standability)。術(shù)語"抗倒伏，，或"抗倒伏性"是指植物將自身固定在土壤中的能力。對于具有直立或半直立生長習(xí)性的植物，該術(shù)語還指不利(環(huán)境)條件下保持豎立的能力。該性狀與根系的大小、深度和形態(tài)有關(guān)。另外，通過提高ERECTA多肽的水平和/或活性來刺激根生長和增加根質(zhì)量還用于體外促進(jìn)外植體的繁殖。此外，由ERECTA活性的水平和/或活性提高所致的較高的根生物產(chǎn)量對產(chǎn)量有直接作用，并對由根細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因根細(xì)胞或所述轉(zhuǎn)基因根細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的化合物產(chǎn)量有間接作用。根培養(yǎng)物中產(chǎn)生有價(jià)值的化合物的一個(gè)實(shí)例是紫草寧，可以通過所述方法有利地提高其產(chǎn)量。因此，本發(fā)明還提供當(dāng)與對照植物的根發(fā)育相比時(shí)根發(fā)育受到調(diào)節(jié)的植物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中的本發(fā)明ERECTA多肽的水平/活性提高，而且根生長增強(qiáng)和/或根生物量增加。在其它實(shí)施方案中，這類植物具有穩(wěn)定摻到其基因組的核酸分子，該核酸分子包含與在植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子有效連接的本發(fā)明ERECTA核苦酸序列。v.調(diào)節(jié)莖干和葉發(fā)育本發(fā)明還提供用于調(diào)節(jié)植物莖干(shoot)和葉發(fā)育的方法。所謂"調(diào)節(jié)莖干和/或葉發(fā)育"是指植物莖干和/或葉發(fā)育中的任何變化。莖干和/或葉發(fā)育中的這類變化包括但不限于以下變化莖干分生組織(shootmeristem)53發(fā)育、葉數(shù)、葉大小、葉和莖維管、節(jié)間長度和葉衰老。本文所用"葉發(fā)育"和"莖干發(fā)育"分別包括在單子葉植物和雙子葉植物的葉和莖干發(fā)育的不同階段，構(gòu)成葉系和莖軸系不同組成部分生長的所有方面。用于測定莖軸系和葉系的這類發(fā)育變化的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Werner等(2001)/WJS98:10487-10492和美國專利申請?zhí)?0030074698,所述每個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。用于調(diào)節(jié)植物莖干和/或葉發(fā)育的方法包括調(diào)節(jié)本發(fā)明ERECTA多肽的活性和/或水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供本發(fā)明的ERECTA序列。在其它實(shí)施方案中，可通過以下方式提供ERECTA核苷酸序列將包含本發(fā)明ERECTA核苷酸序列的多核苷酸導(dǎo)入植物，使ERECTA序列進(jìn)行表達(dá)，從而改善莖干和/或葉發(fā)育。在其它實(shí)施方案中，導(dǎo)入植物的ERECTA核苦酸構(gòu)建體被穩(wěn)定摻入植物基因組。在具體的實(shí)施方案中，通過降低植物中ERECTA多肽的水平或活性來調(diào)節(jié)莖干或葉發(fā)育。當(dāng)與對照植物相比時(shí)，ERECTA活性的降低可引起至少一種或多種莖干和/或葉發(fā)育的下列變化，包括但不限于葉數(shù)減少、葉表面縮小、維管減少、節(jié)間變短和生長受阻和葉衰老延遲。如上所述，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解用于調(diào)節(jié)植物莖干和葉發(fā)育的合適的啟動(dòng)子。本實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、莖干優(yōu)選的啟動(dòng)子、莖干分生組織優(yōu)選的啟動(dòng)子和葉優(yōu)選的啟動(dòng)子。本文其它部分公開了示例性的啟動(dòng)子。降低植物的ERECTA活性和/或水平導(dǎo)致節(jié)間變短且生長受阻。因此，本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生矮生植物。另外，如上所述，調(diào)節(jié)植物的ERECTA活性可調(diào)節(jié)根和莖干的生長。因此，本發(fā)明還提供用于改變根冠比的方法。還可通過降低植物的ERECTA多肽的水平和/或活性來調(diào)節(jié)莖干或葉發(fā)育。因此，本發(fā)明還提供當(dāng)與對照植物相比時(shí)莖干和/或葉發(fā)育受到調(diào)節(jié)的植物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中的本發(fā)明ERECTA多肽的水平/活性提高，莖干和/或葉發(fā)育發(fā)生改變。這類變化包括但不限于當(dāng)與對照植物相比時(shí)葉數(shù)增多、葉表面擴(kuò)大、維管增加、節(jié)間變長和#_物高度增高以及葉衰老發(fā)生改變。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中的本發(fā)明ERECTA多肽的水平/活性降低。v/調(diào)節(jié)生殖組織發(fā)育本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)生殖組織發(fā)育的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供調(diào)節(jié)植物花發(fā)育的方法。所謂"調(diào)節(jié)花發(fā)育"是指當(dāng)與其中ERECTA多肽的活性或水平未受調(diào)節(jié)的對照植物相比時(shí)，植物生殖組織結(jié)構(gòu)的任何變化。"調(diào)節(jié)花發(fā)育"還包括當(dāng)與其中ERECTA多肽活性或水平未受調(diào)節(jié)的對照植物相比時(shí)，植物生殖組織發(fā)育時(shí)間上的任何變化(即花發(fā)育的時(shí)間延遲或加快)。宏觀變化可包括以下方面的改變生殖器官的大小、形狀、數(shù)量或位置、這些結(jié)構(gòu)形成的發(fā)育時(shí)期或者在環(huán)境脅迫期間維持或繼續(xù)整個(gè)開花過程的能力。微觀變化可包括構(gòu)成生殖器官的細(xì)胞類型或形狀的改變。用于調(diào)節(jié)植物花發(fā)育的方法包括調(diào)節(jié)植物中的ERECTA活性。在一種方法中，提供本發(fā)明的ERECTA序列?？砂慈缦路绞教峁〦RECTA核苷酸序列將包含本發(fā)明ERECTA核苷酸序列的多核香酸導(dǎo)入植物，使ERECTA序列進(jìn)行表達(dá)，從而改善花發(fā)育。在其它實(shí)施方案中，導(dǎo)入植物的ERECTA核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定摻到植物基因組。在具體方法中，通過降低植物中ERECTA多肽的水平或活性來調(diào)節(jié)花發(fā)育。ERECTA活性的降低可導(dǎo)致花發(fā)育的至少一種或多種下列變化，包括但不限于當(dāng)與對照植物相比時(shí)開花延遲、花的數(shù)量減少、部分雄性不育和結(jié)籽減少。誘導(dǎo)開花延遲或抑制開花可用來提高飼料作物(例如苜蓿)的產(chǎn)量。用于測定花發(fā)育中的這類發(fā)育變化的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Mouradov等(2002)77^尸taCe〃S111-S130，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。本實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、莖干優(yōu)選的啟動(dòng)子和花序優(yōu)選的啟動(dòng)子。在其它方法中，提高本發(fā)明ERECTA序列的水平和/或活性來調(diào)節(jié)花的發(fā)育。這類方法可包括將ERECTA核苷酸序列導(dǎo)入植物及提高ERECTA多肽的活性。在其它方法中，導(dǎo)入植物的ERECTA核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定摻到植物基因組。增加本發(fā)明ERECTA序列的表達(dá)可在脅迫期間調(diào)節(jié)花的發(fā)育。這類方法見本文其它部分。因此，本發(fā)明還提供與對照植物的花發(fā)育相比，花的發(fā)育受到調(diào)節(jié)的植物。組合物(composition)包括本發(fā)明ERECTA多肽的水平/活性提高且花的發(fā)育受到調(diào)節(jié)的植物。組合物還包括本發(fā)明ERECTA多肽的水平/活性得到提高的植物，其中植物在脅迫期間維持或繼續(xù)整個(gè)開花過程。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的ERECTA序列以增加種子大小和/或種子重量的方法。該方法包括提高植物或植物組成部分(例如種子)中ERECTA序列的活性。種子大小和/或重量的增加包括種子大小或重量的增加和/或一個(gè)或多個(gè)種子組成部分大小或重量的增加，包括例如胚、胚乳、種皮、糊粉或子葉。如上所述，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解用來增加種子大小和/或種子重量的合適的啟動(dòng)子。本實(shí)施方案的示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、種子優(yōu)選的啟動(dòng)子、胚優(yōu)選的啟動(dòng)子和胚乳優(yōu)選的啟動(dòng)子。用于減小植物種子大小和/或減輕種子重量的方法包括降低植物的ERECTA活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，可按如下方式提供ERECTA核苷酸序列將包含本發(fā)明ERECTA核苷酸序列的多核苷酸導(dǎo)入植物，使ERECTA序列進(jìn)行表達(dá)，從而減輕種子重量和/或減小種子大小。在其它實(shí)施方案中，導(dǎo)入植物的ERECTA核苷酸構(gòu)建體被穩(wěn)定摻入到植物基因組。還要了解的是，增加種子大小和/或重量還伴隨著幼苗生長速度加快或早期活力增強(qiáng)。本文所用術(shù)語"早期活力(earlyvigor)"是指植物在早期發(fā)育期快速生長的能力，并且與萌發(fā)之后成功建立起發(fā)育完善的根系和發(fā)育充分的光合器有關(guān)。另外，當(dāng)與對照相比時(shí)，種子大小和/或重量的增加還可導(dǎo)致植物產(chǎn)量提高。因此，本發(fā)明還提供當(dāng)與對照植物相比時(shí)種子重量和/或種子大小增加的植物。在其它實(shí)施方案中，還提供活力和植物產(chǎn)量提高的植物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明植物中的本發(fā)明ERECTA多肽的水平/活性提高，且種子重量和/或種子大小增加。在其它實(shí)施方案中，這類#4勿具有穩(wěn)定摻入其基因組的核酸分子，該核酸分子包含與在植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子有效連接的本發(fā)明ERECTA核苷酸序列。W/.ERECTA啟動(dòng)子多核苷酸的使用方法包含本發(fā)明所公開的ERECTA啟動(dòng)子及其變體和片段的多核苷酸當(dāng)與DNA構(gòu)建體進(jìn)行裝配使得啟動(dòng)子序列與包含目標(biāo)多核苷酸的核苷酸序列有效連接時(shí)，可用于任何宿主細(xì)胞、優(yōu)選植物細(xì)胞的遺傳操控。按這種方式，在表達(dá)盒中提供連同用于在目標(biāo)宿主細(xì)胞中表達(dá)的目標(biāo)多核苷酸序列的本發(fā)明ERECT啟動(dòng)子多核苷酸。如下面的實(shí)施例2中所論迷的一樣，本發(fā)明的ERECTA啟動(dòng)子序列在多種組織中表達(dá)，因此該啟動(dòng)子序列可用于調(diào)節(jié)目標(biāo)多核苷酸的時(shí)序表達(dá)和/或空間表達(dá)。合成雜合啟動(dòng)子區(qū)是本領(lǐng)域已知的。這類區(qū)域包含與另一種多核苷酸的啟動(dòng)子元件有效連接的一種多核苷酸的上游啟動(dòng)子元件。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，異源序列表達(dá)受合成雜合啟動(dòng)子的控制，該雜合啟動(dòng)子包含與得自異源啟動(dòng)子的上游啟動(dòng)子元件有效連接的本發(fā)明57ERECTA啟動(dòng)子序列或其變體或片段。已鑒定出參與植物防御系統(tǒng)的上游啟動(dòng)子元件，并可用來產(chǎn)生合成啟動(dòng)子。參見例如Rushton等(1998)CW,—.尸ta廳.1:311-315?；蛘撸铣蒃RECTA啟動(dòng)子序列可包含ERECTA啟動(dòng)子序列內(nèi)存在的上游啟動(dòng)子元件的重復(fù)。構(gòu)建體可用來轉(zhuǎn)化任何目標(biāo)植物以產(chǎn)生所需要的表型變化，例如調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)、調(diào)節(jié)根、莖干、葉、花和胚發(fā)育、脅迫耐受性和本文其它部分所述的其它任何表型。為了改變植物的表型，本文所公開的啟動(dòng)子核苷酸序列和方法可用來調(diào)節(jié)宿主植物中任何異源核普酸序列的表達(dá)。各種表型變化是有益的，包括改善植物中的脂肪酸組成、改變植物的氨基酸含量、改變植物的病原體防御機(jī)制等?？赏ㄟ^提供表達(dá)的異源產(chǎn)物或增加植物中內(nèi)源產(chǎn)物的表達(dá)，來達(dá)到這類效果。或者，可通過降低植物一種或多種內(nèi)源產(chǎn)物(特別是酶或輔因子)的表達(dá)，來達(dá)到這類效果。這些變化導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物表型發(fā)生改變。目標(biāo)基因反映出商業(yè)市場和參與作物開發(fā)的各方的利益。目標(biāo)作物和目標(biāo)市場不斷改變，而且因?yàn)榘l(fā)展中國家向世界開放市場，所以新的作物和技術(shù)也將涌現(xiàn)。另外，當(dāng)我們對農(nóng)藝性狀和特征(例如產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢)的了解加深時(shí)，對用于轉(zhuǎn)化的基因的選擇也會(huì)因此發(fā)生改變。目標(biāo)基因的通用種類包括例如參與信息的基因(例如鋅指)、參與通訊的基因(例如激酶)和參與持家的基因(例如熱激蛋白)。轉(zhuǎn)基因更特別的種類例如包括重要農(nóng)藝性狀、抗蟲性、抗病性、除草劑抗性、不育性、谷類特征和商業(yè)產(chǎn)物的編碼基因。目標(biāo)基因一般包括參與油、淀粉、糖或營養(yǎng)代謝的基因以及影響谷粒大小、蔗糖負(fù)載等的基因。在某些實(shí)施方案中，為了產(chǎn)生具有所需表型的植物，可將本發(fā)明的核酸序列與其它目標(biāo)多核苷酸序列組合使用("堆積(stacked)")。所形成的組合可包括目標(biāo)多核苷酸任一種或多種的多個(gè)拷貝。本發(fā)明的多核苷酸還可與任何基因或組合基因堆積以產(chǎn)生具有多種所需性狀組合的植物，包括但不限于用于動(dòng)物伺料的所需性狀，例如高油基因(例如美國專利第6,232,529號)；平衡型氨基酸(例如hordothionins(美國專利號5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409);大麥高賴氨酸(Williamson等(1987)五w廠.J歷oc/em.165:99-106和WO98/20122);高曱硫氨酸蛋白(Pedersen等(1986)祝o/.CAem.261:6279;Kirihara等(1988)Ge"e71:359和Musumura等(1989)P/a^Mo/.歷o/.12:123);提高可消化性(例如改性貯藏蛋白(2001年11月7日提交的美國專利申請順序號10/053,410);以及硫氧還蛋白(2001年12月3日提交的美國專利申請順序號10/005，429)),所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明的多核苷酸還可與抗蟲性、抗病性或除草劑抗性等所需要的性狀堆積(例如蘇云金芽孢桿菌(5fl"'〃w;Aw7'"g&似/力毒蛋白(美國專利號5,366,892、5,747,450、5,737,514、5723,756、5,593,881;Geiser等(1986)48:109);凝集素(VanDamme等(1994)尸/a^Mo/.所o/.24:825);串珠鐮孢黃菌素解毒基因(美國專利第5，792,931號)；無毒基因和抗病性基因(Jones等(l994)5Wewce266:789;Martin等(1993)Sde"ce262:1432;Mindrinos等(1994)Ce〃78:1089);導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變型，例如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶抑制劑，例如膦絲菌素或basta(例如bar基因)；草甘膦抗性(EPSPS基因))；用于處理或加工產(chǎn)品所需要的性狀，例如高油(例如美國專利第6,232,529號)；改良油(例如脂肪酸去飽和酶基因(美國專利第5,952,544號、WO94/11516));改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(SDBE));聚合物或生物塑料(bioplastics)(例如美國專利第5.602,321號；促進(jìn)聚羥基鏈烷酸酯(PHA)表達(dá)的(3-酮硫解酶、聚羥基丁S吏合酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶(Schubert等(1988)/Sa"mW.170:5837-5847)),所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。還可以將本發(fā)明的多核苷酸與影響以下農(nóng)藝性狀的多核苷酸組合例如雄性不育(例如參見美國專利第5,583,210號)、柄(stalk)強(qiáng)度、開花時(shí)間或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀(例如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或基因?qū)ぐ?(例如WO99/61619、WO00/17364、WO99/25821)，所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)序列改進(jìn)植物生長和/或提高農(nóng)作物產(chǎn)量。例如，目標(biāo)序列包括導(dǎo)致初生根系或側(cè)根系改善的具有農(nóng)藝重要性的基因。這類基因包括但不限于養(yǎng)分/水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和生長誘導(dǎo)基因。這類基因的實(shí)例包括但不限于玉米質(zhì)膜IT-ATP酶(MHA2)(Frias等(1996)尸/fl"fCW/8:1533-44);AKT1,—種擬南芥鉀攝取器(potassiumuptakeappamtus)的組分(Spalding等(1999)/Ge"尸/z;w'o/113:909-18);在根端細(xì)胞中激活細(xì)胞分裂周期的RML基因(Cheng等(1995)P/aW尸/^fo//做:881);玉米谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya等(1994)尸/"WMo/5/o/26:1935-46)和血紅蛋白(Duff等(1997)/腸/.Cta27:16749-16752，Arredondo-Peter等(l997)尸/a"f尸/jw》/.115:1259-1266;Arredondo-Peter還可用于表達(dá)對根發(fā)育有負(fù)面影響的基因的反義核苷酸序列。另外，除采用傳統(tǒng)育種方法以外，還可從遺傳上改變具有農(nóng)藝重要性的性狀(例如油、淀粉和蛋白質(zhì)含量)。有關(guān)改進(jìn)包括增加油酸、飽和與不飽和油的含量、提高賴氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸，還包括淀粉改性。Hordothionin蛋白改進(jìn)參見美國專利號5，703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389，這些專利均通過引用結(jié)合到本文中。另一個(gè)實(shí)例是由大豆2S白蛋白編碼的富含賴氨酸和/或硫的種子蛋白(參見美國專利第5,850,016號)和得自大麥的胰凝乳蛋白酶抑制劑(參見Williamson等(1987)五w.所oc/em.165:99-106,所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到60本文中)?？赏ㄟ^位點(diǎn)定向誘變制備編碼序列的衍生物以提高編碼多肽中預(yù)選定氨基酸的水平。例如，大麥高賴氨酸多肽(BHL)編碼基因得自大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑(1996年11月1日提交的美國專利專利申請順序號08/740,682,以及WO98/20133,所述專利的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。其它蛋白質(zhì)包括例如得自向日葵種子的富含曱硫氨酸的植物蛋白(Lilley等(1989)/VoceWwg^o/Ae,r/c/CowgmwowF"egeto6/eiVotef"t/"/z.zfi^/ow7fw附cmFoo^ya"d」m'mfl/Fee^s似炎(才直物蛋白質(zhì)在人類食4勿和動(dòng)物飼料中利用世界大會(huì)會(huì)議錄)，Applewhite主編(美國油類化學(xué)家學(xué)會(huì)(AmericanOilChemistsSociety),Champaign,Illinois),第497-502頁；該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)；玉米(Pedersen等(1986)所o/.CAew.261:6279;Kirihara等(l988)(7e"e71:359;所述兩份文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中)；以及水稻(Musumura等(1989)P/a",Mo/.歷o/.12:123,該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。其它有農(nóng)藝重要性的基因編碼乳膠、Floury2、生長因子、種子貯藏因子(seedstoragefactor)和轉(zhuǎn)錄因子?？瓜x性基因可編碼害蟲抗性，所述害蟲顯著拉低產(chǎn)量，例如才艮蟲、切根蟲、歐洲玉米螟等。這類基因包括例如蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因(美國專利號5,366,892、5,747,450、5，736，514、5,723,756、5,593,881;以及Geiser等(1986)48:109)等。抗病性性狀編碼基因包括解毒基因，例如針對串珠鐮孢菌素的解毒基因(美國專利第5,792,931號)；無毒(avr)基因和抗病(R)基因(Jones等(1994)5We"ce266:789;Martin等(1993)S".e"ce262:1432;以及Mindrinos等(1994)Ce〃78:1089)等。除草劑抗性性狀可包括起抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草劑、特別是磺酰脲型除草劑的抗性編碼基因(例如含有導(dǎo)致這類抗性的突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，特別是S4和/或Hra突變)；起抑制谷氨酰胺合酶作用的除草劑(例如膦絲菌素或basta)的抗性編碼基因(例如bar基因)或者本領(lǐng)域已知的其它這類基因。6flr基因編碼除草劑basta抗性，w/^/基因編碼抗生素卡那霉素和遺傳霉素抗性，ALS-基因突變型編碼除草劑氯磺隆抗性。還可在表達(dá)盒中編碼不育基因，并提供物理去雄的替代方法。用于這類方式的基因的實(shí)例包括雄性組織優(yōu)選的基因和具有雄性不育表型的基因，例如QM，參見美國專利第5,583,210號。其它基因包括激酶和編碼對雄性或雌性配子體發(fā)育有毒的化合物的基因。谷類品質(zhì)反映在性狀上，例如飽和及不飽和油的水平和類型、必需氨基酸的品質(zhì)和數(shù)量以及纖維素的水平。玉米中，改良的hordothionin蛋白可參見美國專利號5,703,049、5，885，801、5,885,802和5,990,389。商業(yè)性狀還可編碼到一個(gè)或多個(gè)基因上，從而可增加例如用于生產(chǎn)乙醇的淀粉或者提供蛋白質(zhì)表達(dá)。轉(zhuǎn)化植物的另一種重要的商業(yè)用途是生產(chǎn)聚合物和生物塑料，例如參見美國專利第5，602，321號?；蚶?3-酮硫解酶、PHBase(聚羥基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰輔酶A還原酶(參見Schubert等(1988)S""m'o/.170:5837-5847)可促進(jìn)聚羥基鏈烷酸酯(PHA)表達(dá)。外源產(chǎn)物包括#_物酶和才直物產(chǎn)物以及得自包括原核生物和其它真核生物在內(nèi)的其它來源的產(chǎn)物。這些產(chǎn)物包括酶、輔因子、激素等?？梢蕴岣叩鞍踪|(zhì)、特別是修飾蛋白質(zhì)的水平，所述修飾蛋白質(zhì)具有改進(jìn)的能提高植物營養(yǎng)價(jià)值的氨基酸分布。這可通過表達(dá)這類氨基酸含量提高的蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。可參照下列非限制性實(shí)施例來更好地理解本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可以實(shí)施本發(fā)明的其它實(shí)施方案但不偏離本文所公開及要求保護(hù)的本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例實(shí)施例1ERECTA序列的分離采用確定基因家族所有成員的常規(guī)方法以檢索目標(biāo)ERECTA基因。準(zhǔn)備一組各式的所有基因家族已知成員作為蛋白質(zhì)序列。該數(shù)據(jù)包括來自其它品種的序列。對照專有玉米序列數(shù)據(jù)集對這些品種進(jìn)行>險(xiǎn)索，確定出一組非冗余(nonredundant)的重疊命中數(shù)(hits)。分別對任何目標(biāo)基因的核苷酸序列進(jìn)行處理，并對照數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，重新得到一組非冗余的所有重疊命中數(shù)。然后將蛋白質(zhì)命中數(shù)組與核香酸命中數(shù)相比較。如果基因家族是完整的，則所有蛋白質(zhì)命中數(shù)都包含在核苷酸命中數(shù)內(nèi)。ERECTA家族的基因由2個(gè)擬南芥基因、2個(gè)水稻基因、2個(gè)玉米基因、3個(gè)高粱基因和4個(gè)大豆基因組成。圖4提供表示由這些基因編碼的蛋白質(zhì)的相互關(guān)系的系統(tǒng)樹圖。實(shí)施例2ERECTA序列分析本發(fā)明的ZmERECTA多肽與多種植物品種的ERECTA基因有共同特征。比對分析顯示得自多個(gè)植物品種的基因、保守區(qū)和共有序列間之間的關(guān)系，參見圖2。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化和再生用質(zhì)粒轟擊得自溫室供體植物的未成熟玉米胚，該質(zhì)粒含有與干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RAB17啟動(dòng)子有效連接的ZmERECTA序列(Vilardell等(1990)P/a"Mo/所o/14:423-432)和賦予除草劑雙丙氨膦抗性的選擇標(biāo)記基因PAT?；蛘?，選擇標(biāo)記基因用單獨(dú)的質(zhì)粒提供。轉(zhuǎn)化如下進(jìn)行。培養(yǎng)基配方見下。把組織的制備剝開玉米穗的苞葉，在30%Clorox⑧漂白劑加上0.5%Micro洗滌劑中進(jìn)行表面滅菌20分鐘，用無菌水漂洗2次。切取未成熟胚，將胚軸端向下(盾蓋端向上)，按25個(gè)胚/板接種到560Y培養(yǎng)基中4小時(shí)，然后排列在2.5cm耙區(qū)內(nèi)以備轟擊。DNA的制備:應(yīng)用CaCl2沉淀法將該質(zhì)粒DNA加上含有PAT選擇標(biāo)記的質(zhì)粒DNA沉淀在1.1iLim(平均直徑)鎢沉淀上100pl在水中制備的鎢顆粒10pi含(lpg)DNA的TrisEDTA緩沖液(總DNA1嗎)100nl2.5MCaCl210^10.1M亞精胺依次將每種試劑加到鶴顆粒懸液中，同時(shí)保持在多管渦旋^f義中。對最終的混合物進(jìn)行短時(shí)超聲處理后，使之在恒定渦旋下溫育10分鐘。在沉淀期之后，各管進(jìn)行短時(shí)離心，棄去液體，用500ml100%乙醇洗滌后，離心30秒鐘。再次棄去液體，將105iil100%乙醇加到最終的鴒顆粒沉淀。對于基因槍轟擊，對鎢/DNA顆粒進(jìn)行短時(shí)超聲處理，將10(al點(diǎn)到每個(gè)巨載體的中心，轟擊前使之干燥約2分鐘?；驑屘幚碛没驑屰虷E34-1或弁HE34-2按4號水平對樣品板進(jìn)行轟擊。所有樣品受到單次射擊(650PSI)，從每管制備的顆粒/DNA中取等分量，共10份。64后續(xù)處理:轟擊后，使胚在560Y培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)移到含有3mg/升雙丙氨膦的560R選擇培養(yǎng)基中，每2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在大約10周選擇后，將選擇-抗性愈傷組織克隆轉(zhuǎn)移到288J培養(yǎng)基以開始使植物再生。在體細(xì)胞胚成熟后(2-4周)，將發(fā)育良好體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基以便出芽，并轉(zhuǎn)移到有照明的培養(yǎng)室。大約7-10天后，將發(fā)育中的小植抹轉(zhuǎn)移到管中的272V無激素培養(yǎng)基內(nèi)達(dá)7-10天，直到小植林完全形成。然后將植物移栽到裝有盆栽土的平臺的插入物(inserts)中(等同于2.5"花盆)，并在生長室中生長l周，隨后在溫室中再生長l-2周，然后移載到典型600盆(1.6加侖)中，生長至成熟。對植物進(jìn)行監(jiān)測，并對耐旱性的提高進(jìn)行評分。測定耐旱性改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，包括例如當(dāng)與在相同環(huán)境條件下的對照玉米植物相比時(shí)，在干旱條件下玉米粒-抽穗能力產(chǎn)量(kemel-earringcapacityyield)增加?；蛘撸杀O(jiān)測轉(zhuǎn)化植物對分生組織發(fā)育的調(diào)節(jié)(即玉米穗上小穗形成減少)。參見例如Bruce等(2002)JoM/7za/o/￡!x;er/me"^z/53:1-13。轟擊和培養(yǎng)基轟擊培養(yǎng)基(560Y)含有4.0g/1N6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸硫胺、120.0g/1蔗糖、1.0mg/12,4-D和2.88g/1L-脯氨酸(用D-IH20調(diào)整體積后，用KOH調(diào)節(jié)至pH5.8);2.0g/1脫乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)(用D-IH20調(diào)整體積后加入)；以及8.5mg/l硝酸銀(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后加入)。選擇培養(yǎng)基(560R)含有4.0g/1N6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/1Eriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/1鹽酸硫胺、30.0g/1蔗糖和2.0mg/12,4-D(用D-1H20調(diào)整體積后用KOH調(diào)節(jié)至pH5.8);3.0g/1脫乙酰吉蘭糖膠(用D-IH20調(diào)整體積后加入)；以及0.85mg/1賄酸銀和3.0mg/1雙丙氨膦(兩者均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后加入)。植物再生培養(yǎng)基(288J)含有4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/1MS維生素母液(0.100g煙酸、0.02g/1鹽酸硫胺、0.10g/1鹽酸吡多醇和0.40g/1甘氨酸，用精制D-I1120調(diào)整體積)(Murashige和Skoog(1962)尸/jw'o/.尸/fl",.15:473)、100mg/1肌醇、0.5mg/1玉米素、60g/1蔗糖和1.0ml/10.1mM脫落酸(調(diào)節(jié)至pH5.6后，用精制D-IH20調(diào)整體積)；3.0g/1脫乙酰吉蘭糖膠(用D-IH20調(diào)整體積后加入)；以及1.0mg/1p5l咮乙酸和3.0mg/1雙丙氨膦(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至60。C后加入)。無激素培養(yǎng)基(272V)含有4.3g/1MS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/1MS維生素母液(0.100g/1煙酸、0.02g/1鹽酸硫胺、0.10g/1鹽酸吡多醇和0.40g/1甘氨酸，用精制D-IH20調(diào)整體積)、0.1g/1肌醇和40.0g/1蔗糖(調(diào)節(jié)pH至5.6后，用精制D-IH20調(diào)整體積)；以及6g/1細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(bacto-agar)(用精制D-IH20調(diào)整體積后加入)，滅菌后冷卻至60。C。實(shí)施例4土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化對于用本發(fā)明ZmERECTA序列的反義序列的土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，優(yōu)選采用Zhao的方法(美國專利第5,981,840號和PCT專利公布號W098/32326;所述專利的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。簡單地講，從玉米中分離出未成熟胚，使胚與土壤桿菌懸液接觸，其中該細(xì)菌能夠?qū)RECTA序列轉(zhuǎn)移到至少一個(gè)未成熟胚的至少一個(gè)細(xì)胞中(步驟1:感染步驟)。在這一步驟中，優(yōu)選將未成熟胚浸入用于開始接種的土壤桿菌懸液。使胚與土壤桿菌共同培養(yǎng)一段時(shí)間(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選使未成熟胚在感染步驟后在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在該共培養(yǎng)期后，包括了任選的"靜息"步驟。在該靜息步驟中，在至少一種已知抑制土壤桿菌生長的抗生素存在下無需加入植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑，使胚孵育(步驟3:靜息步驟)。優(yōu)選將未成熟胚在有抗生素但無選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，為感染細(xì)胞清除土壤桿菌，并提供靜息階段。隨后，將經(jīng)接種的胚在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，回收生長中的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4:選擇步驟)。優(yōu)選將未成熟胚在有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述選擇劑可引起轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行選擇性生長。然后使愈傷組織再生成植物(步驟5:再生步驟)，優(yōu)選將在選擇性培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)以再生出植物。對植物進(jìn)行監(jiān)測，并對在分生組織發(fā)育中的調(diào)節(jié)進(jìn)行評分。例如，大小的改變、莖干和花分生組織出現(xiàn)和/或葉、花和/或果實(shí)產(chǎn)量的提高。實(shí)施例5ZmERECTA的過量表達(dá)影響植物生長率、花序發(fā)育、器官大小和耐旱性。ZmERECTA基因在其中細(xì)胞分裂活躍的莖端分生組織和玉米穗特異性分生組織中表達(dá)(圖1)。該基因的功能與細(xì)胞增殖有關(guān)。我們通過在組成型啟動(dòng)子控制下使ZmERECTA基因過量表達(dá)來測試此基因的功能。將產(chǎn)生出轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因同胞，并對轉(zhuǎn)基因效果進(jìn)行比較。可通過轉(zhuǎn)基因特異性RT-PCR證實(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物。預(yù)期ZmERECTA基因影響植物生長率。與轉(zhuǎn)基因陰性同胞相比，預(yù)期轉(zhuǎn)基因陽性植物顯示生長率提高、植物和器官大小增大和生物量累積增加。有研究表明ERECTA基因控制擬南芥的花發(fā)育。如圖1所示，ZmERECTA基因無疑優(yōu)先在玉米穗花序分生組織(earinflorescencemeristem)中表達(dá)，并在莖端分生組織以略低的水平表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物過量表達(dá)ZmERECTA基因，預(yù)期對花序發(fā)育產(chǎn)生影響。與非轉(zhuǎn)基因同胞相比，預(yù)期轉(zhuǎn)基因植物的玉米穗和玉米粒生長加快，總玉米粒產(chǎn)量提高。ERECTA基因調(diào)節(jié)擬南芥的蒸騰效率，并影響耐旱性。通過用組成型或脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子使ZmERECTA基因過量表達(dá)，來測試轉(zhuǎn)基因植物中ZmERECTA基因的這個(gè)功能?？蓪D(zhuǎn)基因植物及其非轉(zhuǎn)基因同胞進(jìn)行干旱脅迫處理，通過測量脅迫環(huán)境下的植物生長、生物量累積和產(chǎn)量，來測定其耐受性。預(yù)期轉(zhuǎn)基因植物通過影響蒸it效率而改善了耐旱性，并在脅迫或非脅迫生長條件下促進(jìn)植物生長，提高谷粒產(chǎn)量。實(shí)施例6大豆胚轉(zhuǎn)化如下用含有與泛素啟動(dòng)子有效連接的ERECTA序列的質(zhì)粒轟擊大豆胚。為了誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，從經(jīng)表面滅菌的大豆栽培種A2872未成熟種子中剖出長度3-5mm的子葉，在26。C、光或暗中，在合適的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-10周。然后切取體細(xì)胞胚產(chǎn)生的次生胚，接種到合適的液體培養(yǎng)基中。在對繁殖成早期球形期胚的體細(xì)胞胚聚簇進(jìn)行重復(fù)選擇后，按下述方法維持懸液。將大豆胚胎發(fā)生懸浮培養(yǎng)物維持在旋轉(zhuǎn)振蕩器(150rpm)上的35ml液體培養(yǎng)基中，26。C，焚光燈16:8小時(shí)晝/夜周期。將約35mg組織接種到35ml液體培養(yǎng)基中，每兩周對培養(yǎng)物進(jìn)行繼代培養(yǎng)。然后，可通過基因槍轟擊方法轉(zhuǎn)化大豆胚胎發(fā)生懸浮培養(yǎng)物(Klein等(1987)A^we(London)327:70-73;美國專利第4,945,050號)。DuPont生物射彈PDS1000/HE儀(heliumretrofit)可用于這些轉(zhuǎn)化?？捎脕泶龠M(jìn)大豆轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因是由以下元件組成的轉(zhuǎn)基因得自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(Odell等(1985)A^/we313:810-812)、得自質(zhì)粒pJR225(得自大腸桿菌；Gritz等(1983)25:179-188)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和得自根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA的胭脂堿合酶可被分離成限制片段。然后，可將該片段插入攜帶標(biāo)記基因的載體的獨(dú)特限制位點(diǎn)。向50pi的60mg/ml1jam金顆粒懸液中加入(依次)5(ilDNA(1|ag/|il)、20^亞精胺(O.lM)和50|ilCaCl2(2.5M)。然后攪拌顆粒制備物683分鐘，在臺式微量離心機(jī)中離心10秒鐘，棄去上清液。然后將DNA包被的顆粒在400(il70%乙醇中洗滌一次后，重新懸浮于40|il無水乙醇中?？蓪NA/顆粒懸液進(jìn)行超聲處理三次，每次一秒鐘。然后將5微升DNA包被的金顆粒加到每個(gè)巨載體盤中。將約300-400mg生長兩周的懸浮培養(yǎng)物接種到60x15mm空培養(yǎng)皿中，用移液槍從組織中棄去殘余液體。對于每次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，通常對約5-10塊板的組織進(jìn)行轟擊。破膜壓力設(shè)定為1100psi,將室(chamber)抽真空至28英寸汞柱。將組織置于距阻擋網(wǎng)(retainingscreen)約3.5英寸處，轟擊三次。轟擊后，可將組織分成兩半，如上所述，接種回液體中后按上述方法培養(yǎng)。轟擊后5-7天，液體培養(yǎng)基可用新鮮培養(yǎng)基更換，轟擊后11-12天用含有50mg/ml潮霉素的新鮮培養(yǎng)基更換?？梢悦恐芨鼡Q該選擇性培養(yǎng)基。轟擊后7-8周，可以觀察到從未轉(zhuǎn)化的壞死胚胎發(fā)生聚簇中生長出綠色的轉(zhuǎn)化組織。取出分離的綠色組織，并接種到各個(gè)培養(yǎng)瓶中以產(chǎn)生新的無性繁殖的轉(zhuǎn)化胚胎發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。每個(gè)新抹系可作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件來處理。然后，可將這些懸液進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并作為未成熟胚聚簇維持，或者隨每個(gè)體細(xì)胞胚的成熟和出芽再生出整4朱植物。實(shí)施例7向日葵分生組織的轉(zhuǎn)化如下用含有與泛素啟動(dòng)子有效連接的ERECTA序列的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化向日葵分生組織(另參見歐洲專利號EP0486233，該專利通過引用結(jié)合到本文中，以及Malone-Schoneberg等(1994)尸/a"ZSc/e"ce103:199-207)。成熟向日葵種子(向日葵(/^//朋^^a朋wwL.))用單麥穗脫粒機(jī)(singlewheatheadthresher)去殼。用每50ml溶液2滴吐溫(Tween)20的20%01(^(^@漂白溶液中進(jìn)行表面滅菌種子30分鐘。用無菌蒸餾水漂洗種子兩次。69用Schrammeijer等人所述方法的改進(jìn)方法制備剖開的胚軸外植體(8。1^1111116^1"等(1990)/>/""(^〃/卬.9:55-60)。在表面滅菌步驟后，使種子在蒸餾水中吸脹60分鐘。然后折斷每粒種子的子葉，在胚的軸線平面產(chǎn)生平滑的斷面。切除根尖后，將外植體在初葉之間縱切成兩半。將兩半(切面向上)接種到GBA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基由Murashige和Skoog礦物元素(Murashige等(1962)尸A;w'o/,尸/aw"15:473-497)、Shepard維生素添力口物(Shepard(1980),載于五,rgewf!Tec/m々wes》r/AeGeweft'c7mpraveme"fCra/w(UniversityofMinnesotaPress，St.Paul,Minnesota))、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/l蔗糖、0.5mg/16-千基-氨基噤呤(BAP)、0.25mg/1吲咮-3-乙酸(IAA)、0.1mg/1赤霉酸(GAO(pH5.6)和8g/1植物瓊脂(Phytagar)組成。在土壤桿菌處理之前，對外植體進(jìn)行微粒轟擊(Bidney等(1992)組腺.18:301-313)。將30-40個(gè)外植體成環(huán)形置于60X20mm板的中心以進(jìn)行該處理。將大約4.7mg的1.8mm鴒微彈重新懸浮于25ml無菌TE緩沖液(lOmMTrisHCl、lmMEDTA，pH8.0)中，每次轟擊使用1.5ml的等分量。在PDSlOO(f顆粒加速裝置中，通過置于樣品上方2cm的150mmnytex網(wǎng)(nytexscreen)轟擊各^反兩;欠。在所有轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用卸曱根癌土壤桿菌菌林EHA105。按照Holsters等人所述方法(Holsters等(1978)Mo/.Ge".163:181-187),將包含表達(dá)盒的雙元質(zhì)粒載體(binaryplasmidvector)通過凍融導(dǎo)入土壤桿菌菌林EHA105,所述表達(dá)盒含有與泛素啟動(dòng)子有效連接的ERECTA基因。該質(zhì)粒還包含卡那霉素選擇標(biāo)記基因(即w^//)。使用于植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌在液體YEP培養(yǎng)基(IOgm/1酵母提取物、10gm/1細(xì)菌用蛋白胨(Bactopeptone)和5gm/lNaCl，pH7.0)與細(xì)菌菌林和雙元質(zhì)粒維持所需要的合適抗生素中生長過夜(28。C,100RPM連續(xù)攪拌)。當(dāng)懸液OD60Q達(dá)到約0.4-0.8時(shí)便可使用。使土壤桿菌細(xì)胞沉淀，并按最終OD6oo為0.5重新懸浮于接種培養(yǎng)基中，所述接種培養(yǎng)基由12.5mMMES(pH5.7)、1gm/1NH4C1和0.3gm/1MgS04組成。將新鮮轟擊的外植體接種到土壤桿菌懸液中，混合，靜置30分鐘。然后將外植體轉(zhuǎn)移到GBA培養(yǎng)基上，切面向下，在26。C和18小時(shí)白晝下共培養(yǎng)。共培養(yǎng)3天后，將外植體轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了250mg/1頭孢噻肟和50mg/1硫酸卡那霉素的374B(缺乏生長調(diào)節(jié)劑且蔗糖水平降低1%的GBA培養(yǎng)基)中。外植體培養(yǎng)2-5周進(jìn)行選擇后，轉(zhuǎn)移到缺乏卡那霉素的新鮮374B培養(yǎng)基上繼續(xù)發(fā)育l-2周。將具有分化的、尚未出苗適于切割的抗生素抗性生長區(qū)的外植體轉(zhuǎn)移到GBA培養(yǎng)基(含有250mg/1頭孢噻肟)進(jìn)行第二次為期3天的植物激素處理。通過ELISA，分析得自卡那霉素抗性綠色苗的葉樣品中存在的NPTII,并通過分析對分生組織發(fā)育的調(diào)節(jié)(即大小改變以及莖干和花分生組織出現(xiàn))，分析存在轉(zhuǎn)基因表達(dá)。將NPTII陽性苗嫁接到Pionee^雜合6440體外生長的向日葵幼苗砧木上。使經(jīng)表面滅菌的種子在48-0培養(yǎng)基(一半濃度的Murashige和Skoog鹽、0.5%蔗糖、0.3%脫乙酰吉蘭糖膠，pH5.6)中萌發(fā)，并在用于外植體培養(yǎng)的所述條件下生長。摘除幼苗上部分，將下胚軸縱切開1cm,將轉(zhuǎn)化苗插入切口。整個(gè)部位用石蠟?zāi)ぐ员Ｗo(hù)苗。體外培養(yǎng)一周后，可將嫁接的植物移栽到土壤中將土壤中的嫁接體維持在高濕度條件下，隨后慢慢適應(yīng)溫室環(huán)境。通過NPTIIELISA和/或通過葉提取物的ERECTA活性分析來鑒定在溫室中成熟的T。植物(親代)的轉(zhuǎn)化區(qū)(transformedsector),而通過少部分干種子子葉的ERECTA活性分析來鑒定由NPTII陽性To植物收獲的轉(zhuǎn)基因種子。向曰葵轉(zhuǎn)化的替代方案可供回收轉(zhuǎn)基因子代而無需使用化學(xué)選擇壓力。將種子去殼，在每100ml溶液加入2-3滴吐溫20的20%Clorox⑧漂白溶液中，進(jìn)行表面滅菌20分鐘，然后用蒸餾水漂洗3次。在26。C下，使滅菌種子在用水濕潤的濾紙上避光吸脹20小時(shí)。去除子葉和根，將分71生組織外植體在374E(由MS鹽、Shepard維生素、40mg/1硫酸腺。票呤、3%蔗糖、0.5mg/16-BAP、0.25mg/1IAA、0.1mg/1GA和0.8%植物瓊脂組成的GBA培養(yǎng)基(pH為5.6))上避光培養(yǎng)24小時(shí)。摘除初生葉暴露出頂端分生組織，將大約40個(gè)外植體頂端圓頂面向上接種到374M(具有1.2%植物瓊脂的GBA培養(yǎng)基)中部2cm的環(huán)上，然后在培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)24小時(shí)。將約18.8mg的1.8iim鴿顆粒重新懸浮于150pl無水乙醇中。超聲處理之后，將其中8ial滴到巨載體表面中心。每板用650psi可裂圓片(rupturediscs)在第一擱板(shelf)中按26mmHg氦槍真空(heliumgunvacuum)下轟擊兩次。按上述方法通過凍融將目標(biāo)質(zhì)粒導(dǎo)入根癌土壤桿菌菌抹EHA105。將在50卡那霉素存在下的液體YEP培養(yǎng)基(IOg/1酵母提取物，10g/l細(xì)菌用蛋白胨，和5g/lNaCl，pH7.0)中于28。C過夜生長的細(xì)菌沉淀重新懸浮于接種培養(yǎng)基(12.5mM2-mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸、MES、1g/1NH4C1和0.3g/1MgS04(pH5.7))中,以達(dá)到OD600下終濃度為4.0。將顆粒轟擊的外植體轉(zhuǎn)移到GBA培養(yǎng)基(374E)上，將細(xì)菌懸液滴直接接種到分生組織頂端。使外植體在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)4天，之后將外植體轉(zhuǎn)移到374C培養(yǎng)基(具有1%蔗糖，無BAP、IAA、GA3，并補(bǔ)充250嗎/ml頭孢瘞肝的GBA)上。在16小時(shí)白晝和26。C孵育條件下，將小植林在培養(yǎng)基上培養(yǎng)約2周。根據(jù)分生組織發(fā)育的調(diào)節(jié)情況(即大小改變及苗和花分生組織出現(xiàn))，對得自在374C培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周的外植體(長約2cm)進(jìn)行篩選。鑒定陽性(即ERECTA表達(dá)改變)外植體，棄去沒有顯示ERECTA活性變化的苗，將每個(gè)陽性外植體再分成結(jié)節(jié)外植體(nodalexplant)。一個(gè)結(jié)節(jié)外植體含有至少一個(gè)潛在結(jié)節(jié)。將該成結(jié)區(qū)段在GBA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-4天以促進(jìn)從每結(jié)節(jié)中形成副芽(auxiliarybud)。然后將它們轉(zhuǎn)移到374C培養(yǎng)基上，使之再發(fā)育4周。分離出發(fā)育中的芽，在374C培養(yǎng)基上再培養(yǎng)4周。通過合適的蛋白質(zhì)活性測定法，再次對得自每個(gè)重獲的新苗的合并葉樣品進(jìn)行篩選。此時(shí)，從一個(gè)單節(jié)重獲的陽性苗一般都富含在結(jié)節(jié)培養(yǎng)之前的最初測定中所檢測到的轉(zhuǎn)基因區(qū)。將對于ERECTA表達(dá)改變?yōu)殛栃缘脑偕缂藿拥絇ioneer雜合6440體外生長的向日葵幼苗砧木上。砧木按以下方式制備。將種子去殼，并在每100ml溶液加入2-3滴吐溫20的20%Cloiro^漂白溶液中進(jìn)行表面滅菌20分鐘，用蒸餾水漂洗3次。使滅菌種子在用水濕潤的濾紙上萌發(fā)3天，然后將它們轉(zhuǎn)移到48培養(yǎng)基(一半濃度的MS鹽、0.5%蔗糖、0.3%脫乙酰吉蘭糖膠，pH5.0)上，在26。C下避光生長3天，然后在16小時(shí)白晝培養(yǎng)條件下培育。摘除選出小植林的上部分，縱切開各下胚軸，將轉(zhuǎn)化苗插入V型切口。切口部位用石蠟?zāi)ぐ?。在培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，將嫁接植物移栽到土壤中。在頭兩周內(nèi)，維持在高濕度條件下以適應(yīng)溫室環(huán)境。實(shí)施例8干旱脅迫下玉米營養(yǎng)性能的測定方案可以利用生長條件、脅迫處理和確定的診斷方法，以高通量方式在FAST-玉米(參見美國專利申請?zhí)?0/367,417)背景中鑒定出賦予轉(zhuǎn)基因玉米耐旱性的基因。處理與材料采用2個(gè)處理組，一個(gè)是充分澆水處理(對照)，另一個(gè)是干旱脅迫處理。植物材料由Tl期的轉(zhuǎn)基因玉米幼苗組成。處理詳述可以自10-14天或移栽后7天開始施以脅迫，并在穗絲生長(silking)整個(gè)過程中持續(xù)?？赏ㄟ^安裝定時(shí)器的自動(dòng)系統(tǒng)給花盆澆水，以便在整個(gè)干旱脅迫處理期間按田間持水量的25%或50%澆水。該脅迫可供鑒定對植物生長以及雌雄穗開花間隔的影響。盆栽混合物建議使用1/3Tw《faceMPT5(ProfileProductsLLC，IL，USA)、1/3沙和1/3t/"/vera"/(SunGroHorticulture,WA,USA)的混合物。SS300t/m'veraa/可用Fa/aW特級萌發(fā)混合物(5^e^weGenrn'"a""gM紅)(ConradFafard，Inc.,MA,USA)替換。同樣，可以降低混合物中沙的比例。因此，最終的盆栽混合物可以是3/8(37.5%)turface、3/8(37.5%)Fa/art/和1/4(25%)沙。田間持水量測定測定用在一個(gè)S200花盆中的土壤混合物重量(wl)(減去花盆重量)。在測定wl之前，可以將土壤在100。C下干燥至恒重(如果土壤混合物的所有組分已經(jīng)變干的，則不再將其干燥)。給花盆中的土壤澆水至完全飽和，使所有重力水排干。在所有重力水滲出后，測定土壤重量(w2)(減去花盆重量)。田間持水量是保持在土壤中的水份重量，按w2-wl得到。技術(shù)上可寫作烘干土壤重量的百分比。對于我們的目的，w2-wl便足夠。脅迫處理在植物生長早期(10天至21天)，給充分澆水對照每天澆水75%田間持水量和給干旱脅迫處理每天澆水25%田間持水量，兩者都在每天上午IO點(diǎn)按一次日澆水量澆水。當(dāng)植物長得較大時(shí)，增加充分澆水對照的每天澆水量至最大田間持水量，增加干旱脅迫處理的至50%田間持水量。這種增加以對代表性花盆的重量測量為基礎(chǔ)，以確定當(dāng)植物長得較大時(shí)植物的排水程度。營養(yǎng)液使用改進(jìn)的Hoagand溶液，用灌溉用自來水按1/16稀釋。用下列配方配制20L改進(jìn)的Hoagland溶液74IOX微量營養(yǎng)液16mlKH2P04(分子量136.02)22gMgS04(分子量120.36)77gKN03(分子量101.2)129.5gCa(N03)2.4H20(分子量236.15)151gNH4N03(分子量80.04)Sprint330(鐵螯合物)32g用下列配方配制1L10X微量營養(yǎng)液:iox微量營養(yǎng)液ml/LH3BO3-30mM1854MnCl2.4H20-10mM1980ZnS04.7H20-10mM2874CuS04.5H20-lmM250H2Mo04.H20-1mM242使用肥料級KN03。注意在移栽時(shí)或在出苗后，將半茶匙奧綠肥(OymocWe)(NPK15:9:12)加到花盆是有益的(ScottsMiracle-GroCompany,OH,USA)。邊界植物在溫室玻璃壁附近或者微環(huán)境變化潛在因素(例如冷卻風(fēng)扇)附近的育苗臺邊緣有一排邊界植物是十分關(guān)鍵的。自動(dòng)化自動(dòng)化可如下進(jìn)行采用虹吸裝置，利用有鉆孔的PVC管向系統(tǒng)性擺放的花盆供水。灌溉時(shí)間安排可用定時(shí)器控制。統(tǒng)計(jì)分析可采用因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)(用事件或構(gòu)建方法和脅迫處理作為因素)，將數(shù)據(jù)輸入Spotfire(Spotfire，Inc.,MA，USA),最終用于每個(gè)干旱轉(zhuǎn)基因程序組內(nèi)的ANOVA。重復(fù)每事件每次處理8-10抹單抹植物?；ㄅ璐笮200觀察結(jié)果(1)在整個(gè)生長期內(nèi)一周三次進(jìn)行LemnaTec測量以獲取#_物生長率(LemnaTecGmbH,Wurselen，Germany)。(2)在整個(gè)脅迫期用Lemnatec—周三次測定葉色。(3)使用HansatechFMS2儀，一周兩次自上午11點(diǎn)開始記錄葉綠素焚光為PhiPSII。在脅迫處理第0天開始測定直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，記錄最嫩最完全伸展葉的溯'J量值(HansatechInstruments,Norfolk,England)。(4)記錄各4朱植物抽穗和長出穗絲的日期，并計(jì)算雌雄穗開花間隔(ASI)。通過確定脫落的生長度日(GDU)至與長出穗絲的生長度日之差，計(jì)算出ASI。脫落時(shí)間是當(dāng)觀察到第一次脫落的天數(shù)，其中第一次脫落定義為至少一個(gè)花藥脫落。穗絲生長時(shí)間是當(dāng)觀察到第一條穗絲長出的天數(shù)，其中第一條穗絲長出定義為出現(xiàn)至少1毫米的一根穂絲。實(shí)施例9ERECTA的表達(dá)及與耐旱性和農(nóng)藝性能的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)(l)已公布的有關(guān)直向同源物的信息，所述直向同源物可表示在脅迫感受或耐受性中的作用，以及(2)表示脅迫相關(guān)基因表達(dá)的內(nèi)部譜型分析(profilingstudy)，鑒定出一組蛋白質(zhì)激酶。它們包括2個(gè)組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的基因，以及根據(jù)脅迫相關(guān)表達(dá)模式鑒定出的基因-包括ERECTA陽A。背景信息:ERECTA是對農(nóng)業(yè)、尤其是對耐旱性和農(nóng)藝性能領(lǐng)域具有意義的推定的富含亮氨酸重復(fù)序列受體樣激酶(LRR-RLK)。擬南芥中，已知該基因通過包括氣孔密度、表皮細(xì)胞膨脹、葉肉細(xì)胞增殖和細(xì)胞間接觸在內(nèi)的機(jī)制對植物蒸騰效率產(chǎn)生影響。另還了解到該基因影響花序發(fā)育。對于該蛋白質(zhì)，還沒有激酶活性實(shí)驗(yàn)的報(bào)告。序列信息:克隆出全長CDS。該基因作圖位于染色體箱(chromosome-bin)位置6.04,已知大致在其附近出現(xiàn)干旱QTL。該基因優(yōu)選在分生組織、未成熟穗中表達(dá)，在如圖3中所述的多種組織中進(jìn)行表達(dá)。實(shí)施例10ERECTA序列的變體A.不改變編碼氨基酸序列的ERECTA的變體核普酸序列用ERECTA核苷酸序列來產(chǎn)生當(dāng)與相應(yīng)SEQIDNO的起始未改變的ORF核苦S臾序列相比時(shí)，可讀框的核苷酸序列具有約70%、75%、80%、85%、90%和95%核普酸序列同一性的變體核苷酸序列。用標(biāo)準(zhǔn)密碼子表可產(chǎn)生這些功能性變體。雖然變體核苷酸序列改變，但是由可讀框編碼的氨基酸序列不改變。B.ERECTA多肽的變體氨基酸序列制備ERECTA多肽的變體氨基酸序列。在本實(shí)施例中，一個(gè)氨基酸發(fā)生了改變。具體地講，檢查可讀框以確定合適的氨基酸變化。通過查閱蛋白質(zhì)比對(與得自不同品種的其它直向同源物和其它基因家族成員)，選出待改變的氨基酸。選出一般認(rèn)為不在高選擇壓力下(不是高度保守的)且更易于被化學(xué)特征相似(即相似的官能側(cè)鏈)的氨基酸取代的氨基酸。用圖2中所列的蛋白質(zhì)比對，可改變合適的氨基酸。一旦鑒定出靶氨基酸，則隨后進(jìn)行以下C部分中所述方法。用該方法產(chǎn)生具有約70%、75%、80%、85%、90%和95%核酸序列同一性的變體。C.ERECTA多肽的其它變體氨基^列在本實(shí)施例中，制備相對于參比蛋白質(zhì)序列具有80%、85%、90%和95%同一性的人工蛋白序列。這一最新努力需要鑒定得自圖2中所列比對的保守區(qū)和可變區(qū)，然后審慎應(yīng)用氨基酸取代表。下面將更詳細(xì)論77述這些部分。很大程度上，根據(jù)ERECTA蛋白之中或根據(jù)其它ERECTA多肽之中的保守區(qū)來測定被改變的氨基酸序列。根據(jù)序列比對，很可能被改變的ERECTA多肽各個(gè)區(qū)用小寫字母表示，而保守區(qū)則用大寫字母表示。要了解的是，下列保守區(qū)可進(jìn)行保守取代但不改變功能。另外，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，本發(fā)明ERECTA序列的功能性變體在保守結(jié)構(gòu)域中可具有較少的非保守氨基酸變化。因此產(chǎn)生以80-85%、85-90%、90-95%和95-100%同一性為區(qū)間不同于源蛋白序列的人工蛋白序列。以這些區(qū)間的中點(diǎn)為目標(biāo)，具有例如十或-1%的自由范圍?？赏ㄟ^自定義Perlscript實(shí)現(xiàn)氨基酸取代。取代表參見下表2。表2.取代表<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>首先，鑒定出蛋白質(zhì)中不能改變的任何保守氨基酸，"標(biāo)出"以便與取代隔離開。起始曱硫氨酸當(dāng)然被自動(dòng)加到該列表中。然后，進(jìn)行改變。H、C和P在任何情況下都不得改變。改變先由異亮氨酸開始，從N端掃描到C端。然后是亮氨酸，如此沿列表進(jìn)行直到達(dá)到所需目標(biāo)?？蛇M(jìn)行中數(shù)耳又代(Interimnumbersubstitution),從而不引起改變逆轉(zhuǎn)。歹寸表順序?yàn)?-17,因此，從按與需要一樣多的異亮氨酸開始，之后是亮氨酸，并如此進(jìn)行到甲硫氨酸。顯然按這種方式許多氨基酸不必改變。L、I和V將包括兩種替代性最佳取代的50:50取代。書面輸出變體氨基S臾序列。運(yùn)用Perlscript計(jì)算百分比同一性。采采該方法，將產(chǎn)生ERECTA多肽的變體，其與起始未改變的SEQIDNO:27-390RF核苦酸序列的氨基酸同一性約為80%、85%、90%和95%。實(shí)施例11表達(dá)ZmERECTAA的轉(zhuǎn)基因植物證實(shí)生長加快在田間，對過量表達(dá)ZmERECTAA基因的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行了評價(jià)。對轉(zhuǎn)基因陽性事件及其無效對照與植物和器官生長有關(guān)的性狀進(jìn)行了表征。在早期生長季節(jié)，轉(zhuǎn)基因陽性植物顯示生長加快，特別是生長率較高。轉(zhuǎn)基因植物比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ赵缂s2天到達(dá)開花期。轉(zhuǎn)基因植物還顯示抹冠加大，這與葉尺寸增大有關(guān)。葉長度和寬度兩者都有加大，這是引起轉(zhuǎn)基因植物葉面積顯著增加的原因。發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，葉面積增加高達(dá)34%。ZmERECTAA對生長率和器官大小的轉(zhuǎn)基因作用與其所預(yù)計(jì)的在控制植物和器官大小及促進(jìn)細(xì)胞增殖中的作用一致(Shpak,E.D.等，尸/""Ce〃(2003)15:1095-1110;Z)eve/c^we"f(2004)131:1491-501)。這些數(shù)據(jù)支持這樣的見解，即ZmERECTAA可用于控制玉米或其它作物整抹植物或特定器官的大小。測定氣孔密度(氣孔數(shù)/mm2),收集數(shù)據(jù)。在每葉3個(gè)區(qū)域且每事件2片葉(植物)的基礎(chǔ)上，觀察到與陰性對照相比，在所有5項(xiàng)事件中，轉(zhuǎn)基因陽性植物的氣孔密度都降低。與轉(zhuǎn)基因陰性對照相比，降低幅度為5-22%。轉(zhuǎn)基因?qū)饪酌芏鹊淖饔门c該基因在擬南芥中的作用一致，擬南芥中該基因顯示可降低氣孔密度和改善蒸騰效率，從而改善耐旱性(Masle,Gilmore和Farquhar,(2005)7Va&re436:866)。該轉(zhuǎn)基因在玉米80氣孔密度中的作用的一致性提高了賦予農(nóng)作物品種耐旱性的潛力。轉(zhuǎn)基因陽性植物中，葉片毛狀體(tricome)生長受到影響，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因陽性植物具有更多的毛狀體或更濃密分布的毛狀體。如各項(xiàng)事件所測一樣，發(fā)現(xiàn)毛狀體生長提高高達(dá)28%。一般認(rèn)為毛狀體生長通過提供阻水性(hydro-repellency)和葉的反射性質(zhì)以及對昆蟲攝食的物理和化學(xué)阻礙，而與植物耐旱性和抗蟲性有關(guān)(Esau,K.(1977)J"ato^yo/尸/awte,第2版)。轉(zhuǎn)基因ERECTA的這種表型作用可對耐旱性和抗蟲性產(chǎn)生影響。本說明書中的所有出版物和專利申請可表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的基本技術(shù)水平。所有出版物和專利申請均通過引用結(jié)合到本文中，其程度與每個(gè)獨(dú)立出版物或?qū)＠暾埦唧w而單獨(dú)指明通過引用結(jié)合到本文中一樣。參照各個(gè)具體和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)對本發(fā)明進(jìn)行了描述。然而，應(yīng)當(dāng)了解的是，可進(jìn)行多種更改和修飾而仍保持在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種分離的多核苷酸，選自a.與選自SEQIDNO5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的多核苷酸全長序列有至少70％序列同一性的多核苷酸，序列同一性用GAP算法默認(rèn)參數(shù)計(jì)算得出；其中所述多核苷酸編碼起器官大小調(diào)節(jié)物作用的多肽；b.編碼選自SEQIDNO6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26多肽的多核苷酸，和c.選自SEQIDNO5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的多核苷酸；和d.與(a)、(b)或(c)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。2.—種重組表達(dá)盒，所述重組表達(dá)盒包含權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸按有義或反義方向與啟動(dòng)子有效連接。3.—種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求2的表達(dá)盒。4.一種轉(zhuǎn)基因植物，所述植物包含權(quán)利要求2的重組表達(dá)盒。5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物。6.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。7.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向曰葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、栗、花生和可可。8.—種轉(zhuǎn)基因種子，所述種子得自權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物。9.一種調(diào)節(jié)植物器官大小的方法，該方法包括a.將包含與啟動(dòng)子有效連接的權(quán)利要求1的多核苷酸的重組表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞；和b.在植物細(xì)胞生長條件下培育植物；其中所述植物細(xì)胞中的器官大小受到調(diào)節(jié)。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物細(xì)胞選自以下植物玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、粟、花生和可可。11.一種調(diào)節(jié)植物的整林植物或器官大小的方法，該方法包括a.將包含與啟動(dòng)子有效連接的權(quán)利要求1的多核苷酸的重組表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞；b.在植物細(xì)胞生長條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞；和c.由所述植物細(xì)胞再生出植物；其中所述植物的器官大小受到調(diào)節(jié)。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥、粟、花生和可可。13.—種由轉(zhuǎn)基因植物組織加工方法得到的產(chǎn)物，所述植物組織表達(dá)編碼ERECTA基因的分離多核苷酸，該方法包括a.用重組表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述表達(dá)盒包含與選自SEQIDNO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的多核苷酸全長序列有至少90%序列同一性的多核苦酸，所述多核苷酸與啟動(dòng)子有效連接；和b.在植物細(xì)胞生長條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；其中所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的生長受到調(diào)節(jié)；c.使植物細(xì)胞在植物形成條件下生長從而在植物組織中表達(dá)所述多核苷酸；和d.加工所述植物組織以獲得產(chǎn)物。14.權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其中所述多核苷酸還編碼選自SEQIDNO:6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26的多肽。15.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物。16.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向曰葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥和粟。17.權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其通過所述多核苷酸的過量表達(dá)而改善植物的柄強(qiáng)度。18.權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其通過增加生物量而提高產(chǎn)量。19.權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其為乙醇(ethanol)組分。20.—種在干旱脅迫期間調(diào)節(jié)植物整林植物或器官大小的方法，該方法包4舌a.將包含與啟動(dòng)子有效連接的權(quán)利要求1的多核苷酸的重組表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞；b.在植物細(xì)胞生長條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞；和c.在干旱脅迫條件下由所述植物細(xì)胞再生出植物；其中所述植物的植物生長受到調(diào)節(jié)。全文摘要本發(fā)明提供ZmERECTA基因家族的多核苷酸和相關(guān)多肽。本發(fā)明提供ZmERECTA基因的核酸序列。ZmERECTA負(fù)責(zé)控制農(nóng)作物的植物生長、器官大小和產(chǎn)量。文檔編號A01H5/00GK101589147SQ200780043165公開日2009年11月25日申請日期2007年9月24日優(yōu)先權(quán)日2006年9月25日發(fā)明者C·西蒙斯,M·魯普,S·西瓦?？?梅郭申請人:先鋒高級育種國際公司