專利名稱：非洲菊離體高頻再生繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的組織培養(yǎng)培養(yǎng)繁殖技術(shù)，具體地說，涉及以非洲菊葉柄為材料進(jìn)行非 洲菊高瀕快速繁殖而進(jìn)行種苗生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
非洲菊(fer&ra》朋^/n7 )俗稱扶郎花，國際著名的五大鮮切花品種之一，市場需求量 大。非洲菊的繁殖可采用播種、分株和組織培養(yǎng)。種子繁殖后代性狀易產(chǎn)生分離，分株繁殖 速度慢，商業(yè)種苗生產(chǎn)中均很少使用。自上世紀(jì)七十年代，國內(nèi)外就開始將組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng) 用于非洲菊種苗生產(chǎn)各和遺傳轉(zhuǎn)化，但是再生效果不理想，特別是以花蕾直接出芽的方式嚴(yán) 重制約了植物基因工程技術(shù)在非洲菊中的應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種基于葉柄的非洲菊離體高頻再生繁殖方法，以便利用非洲菊試 管苗葉柄為材料進(jìn)行非洲菊高瀕快速繁殖而進(jìn)行種苗生產(chǎn)，并應(yīng)用于非洲菊的遺傳轉(zhuǎn)化，滿 足非洲菊種苗市場和進(jìn)行遺傳工程育種的需要。本發(fā)明所提出的非洲菊離體高頻再生繁殖方法，包括下述培養(yǎng)步驟-(1) 花托初代培養(yǎng)在生長季節(jié)選取生長健壯的非洲菊的幼嫩花托為外植體，先在70%-75%酒精中浸泡10-30秒，再用0.1%升汞溶液消毒5-10分鐘，無菌水沖洗4 5次，接 種到花托初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26 30。C，光照度1500 2000 lx，光照8 12 h/天， 培養(yǎng)50-70天至形成完整小植株；所述的花托初代培養(yǎng)基每升中含有6-節(jié)基嘌呤(6-BA ) 5.0 10.0 mg ，萘乙酸(NAA ) 0. 5 1.0 mg，蔗糖20 30g和瓊脂5 7g，其余為MS， pH 5. 5 5. 8;(2) 愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和繼代增殖取上述花托初代培養(yǎng)育成的小植株的葉片 的葉柄接種到愈傷初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)13-17天，所述的愈傷初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升中含有 1-苯基-3- (1,2, 3-噻二唑-5-基)脲(TDZ) 0.2-1.0 mg，萘乙酸(NAA ) 0.05-0.2 mg，蔗 糖20 30g，瓊脂5 7g，其余為MS， pH5.5 5.8;再轉(zhuǎn)到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn) 生愈傷組織，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升中含有6-芐基嘌呤(6-BA ) 1.0-3.0 mg，萘 乙酸(NAA ) 0.05-0.2 mg，蔗糖20 30g，瓊脂5 7g，其余為MS， pH 5. 5 5. 8;再將所 產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織增殖和分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，使愈傷組織的增殖和分化不定芽， 所述的愈傷組織增殖和分化培養(yǎng)基每升中含有6-芐基嘌呤(6-BA ) 0.5-2.0 mg，萘乙酸(NAA ) 0.2-1.0 mg，蔗糖20 30g，瓊脂5 7g，其余為MS， pH5. 5 5. 8;上述各階段的 培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度26 3(TC,光照度1500 2000 lx，光照8 12 h/天；(3)生根培養(yǎng)和試管苗移栽將上述所產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 30天至每株苗生根4 8條，所述的生根培養(yǎng)基每升中含有吲哚丁酸(IBA) 0.5-0.8 mg，蔗糖20 30g，瓊脂5 7g，其余為MS， pH5.5 5.8;再使生根苗在自然光照下煉苗7-10天后，移 栽到泥炭和蛭石按l:l (重量)混配的混合基質(zhì)中。本發(fā)明利用非洲菊試管苗葉柄為材料進(jìn)行非洲菊高瀕快速繁殖而進(jìn)行種苗生產(chǎn)，同時(shí)其 體系能應(yīng)用于非洲菊的遺傳轉(zhuǎn)化，具有投入少，產(chǎn)出高的特點(diǎn)。是利用植物組織細(xì)胞的全能 性和植物組織培養(yǎng)等技術(shù)進(jìn)行種苗的規(guī)?；a(chǎn)的高新生物技術(shù)。實(shí)施該發(fā)明只需有簡單的植物組織培養(yǎng)設(shè)備即可進(jìn)行。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一1. 豐才料非洲菊((？er/ ara Ja/ e5W7力'"Sunanda，，)。2. 培養(yǎng)步驟(1) 花托初代培養(yǎng)在生長季節(jié)選取生長健壯的非洲菊的幼嫩花托為外植體，先在70%酒精中浸泡10秒，再用0.1%升汞溶液消毒5分鐘，無菌水沖洗4次，接種到MS+6-BA 5.0 mg'U1 +NAA 0.5 mg丄"+蔗糖20 g'L" +瓊月旨5g.L"的花托初代培養(yǎng)基(pH 5. 5)中，50天 能形成完整小植株。培養(yǎng)溫度26。C，光照度1500 lx，光照8 h/天。(2) 愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和繼代增殖取試管內(nèi)小植株的葉片的葉柄接種到MS + TDZ 0.2 mg丄"+NAA 0.05 mg丄-1 +蔗糖20 g丄"+瓊脂5g.U1的愈傷初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH 5. 5)對(duì)葉柄進(jìn)行17天的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)到MS + 6-BA1.0 mg'L"+NAA 0.05 mg'L" +蔗糖20 g-L" +瓊脂5g丄"的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH 5.5)上培養(yǎng)，愈傷分化頻率可達(dá)60%。再將 愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS+6-BA 0. 5 mg丄-1 +NAA 0.2 mg丄"+蔗糖20 g七"+瓊月旨5g.U1的愈傷 組織增殖和分化培養(yǎng)基(pH 5.5)上培養(yǎng)，8天能見到愈傷組織的增殖和不定芽的分化，25 天時(shí)分化率達(dá)90%，每個(gè)葉柄的平均不定芽數(shù)可達(dá)IO個(gè)。上述各階段的培養(yǎng)條件均為培養(yǎng) 溫度26。C，光照度1500 lx，光照12 h/天。(3) 生根培養(yǎng)和試管苗移栽將不定芽轉(zhuǎn)移到MS +吲哚丁酸(IBA) 0.5mg丄"+蔗糖20 g-L" +瓊脂5g乇"的生根培養(yǎng)基(pH 5.5)上培養(yǎng)30天時(shí)生根率可達(dá)100%，每株苗有根數(shù) 4條。生根苗在自然光照下煉苗7天，移栽到泥炭和蛭石(l:l)的混合基質(zhì)中，成活率95%。實(shí)施例二1. 禾才茅斗非洲，(Ger6ers 7's/ e5Y /LZ'i "Sunanda，，)。2. 培養(yǎng)步驟(1)花托初代培養(yǎng)在生長季節(jié)選取生長健壯的非洲菊的幼嫩花托為外植體，先在70%酒精中浸泡30秒，再用0.1%升汞溶液消毒8分鐘，無菌水沖洗5次，接種到MS+6-BA 8.0 mg丄—1+NAA0 8mg L-1 +蔗糖25 g丄"+瓊脂6g'U1的花托初代培養(yǎng)基(pH 5.7)中，60天 能形成完整小植株。培養(yǎng)溫度28T，光照度1600 lx，光照IO h/天。(2) 愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和繼代增殖取試管內(nèi)小植株的葉片的葉柄接種到MS +TDZ 0.5mg.L"+NAA 0.1 mg.U1 +蔗糖25 g.L" +瓊脂6g.U1的愈傷初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH 5. 6) 對(duì)葉柄進(jìn)行15天的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)到MS+6-BA 2.0 mg丄"+NAA 0.1 mg'L"+蔗糖25 g-U1 +瓊脂6g七—1的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH 5.6)上培養(yǎng)，愈傷分化頻率可達(dá)70%。再將愈傷 組織轉(zhuǎn)移到MS + 6-BA 1. 0 mg七-1 +NAA 0.5 mg七"+蔗糖25 g.L" +瓊脂6g.L—1的愈傷組織 增殖和分化培養(yǎng)基(pH5.6)上培養(yǎng)，IO天能見到愈傷組織的增殖和不定芽的分化，20天時(shí) 分化率達(dá)95%，每個(gè)葉柄的平均不定芽數(shù)可達(dá)20個(gè)。上述各階段的培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度 28°C，光照度1600 lx，光照IO h/天。(3) 生根培養(yǎng)和試管苗移栽將不定芽轉(zhuǎn)移到MS +吲哚丁酸(IBA) 0.6 mg.I^+蔗糖 25 g丄"+瓊脂6g'L"的生根培養(yǎng)基(pH5.6)上培養(yǎng)30天時(shí)生根率可達(dá)100%，每株苗有根 數(shù)7條。生根苗在自然光照下煉苗10天，移栽到泥炭和蛭石(l:l)的混合基質(zhì)中，成活率 100% 。實(shí)施例三1. 材料非洲菊雜交種(6"erZ era力j^r^a)2. 培養(yǎng)步驟(1) 花托初代培養(yǎng)在生長季節(jié)選取生長健壯的非洲菊的幼嫩花托為外植體，先在75% 酒精中浸泡30秒，再用0.1%升汞溶液消毒10分鐘，無菌水沖洗5次，接種到MS+6-BA 10.0 mg'L"+NAA 1.0mg丄"+蔗糖30 g'L"+瓊脂7g'L—1的花托初代培養(yǎng)基(pH 5.8)中，70天 能形成完整小植株。培養(yǎng)溫度3(TC，光照度2000 lx，光照12 h/天。(2) 愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和繼代增殖取試管內(nèi)小植株的葉片的葉柄接種到MS + TDZ 1.0mg七"+NAA 0.2mg丄—1 +蔗糖30 g七"+瓊脂7g丄"的愈傷初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH 5. 8) 對(duì)葉柄進(jìn)行17天的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)到MS+6-BA3.0mg丄"+NAA0.2mg丄"+蔗糖30 g丄"屮 瓊脂7g丄"的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH 5.8)上培養(yǎng)，愈傷分化頻率可達(dá)65%。再將愈傷組 織轉(zhuǎn)移到MS+6-BA 2. 0 nig.!/1 +NAA 1.0 mg七"+蔗糖30 g.L" +瓊月旨7g.L"的愈傷組織增 殖和分化培養(yǎng)基(pH5.8)上培養(yǎng)，12天能見到愈傷組織的增殖和不定芽的分化，25天時(shí)分 化率達(dá)90%,每個(gè)葉柄的平均不定芽數(shù)可達(dá)20個(gè)。上述各階段的培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度30°C, 光照度2000 lx，光照12 h/天。(3) 生根培養(yǎng)和試管苗移栽將不定芽轉(zhuǎn)移到MS +吲哚丁酸(IBA) 0.8 mg七"+蔗糖 30 g丄"+瓊脂7g七"的生根培養(yǎng)基(pH 5. 8)上培養(yǎng)30天時(shí)生根率可達(dá)100%，每株苗有根 數(shù)8條。生根苗在自然光照下煉苗10天，移栽到泥炭和蛭石(1:1)的混合基質(zhì)中，成活率98% 。
權(quán)利要求
1.非洲菊離體高頻再生繁殖方法，其特征在于包括下述培養(yǎng)步驟(1)花托初代培養(yǎng)在生長季節(jié)選取生長健壯的非洲菊的幼嫩花托為外植體，先在70％-75％酒精中浸泡10-30秒，再用0.1％升汞溶液消毒5-10分鐘，無菌水沖洗4～5次，接種到花托初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26～30℃，光照度1500～2000lx，光照8～12h/天，培養(yǎng)50-70天至形成完整小植株；所述的花托初代培養(yǎng)基每升中含有6-芐基嘌呤5.0～10.0mg，萘乙酸0.5～1.0mg，蔗糖20～30g和瓊脂5～7g，其余為MS，pH5.5～5.8；(2)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和繼代增殖取上述花托初代培養(yǎng)育成的小植株的葉片的葉柄接種到愈傷初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)13-17天，所述的愈傷初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升中含有1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲0.2-1.0mg，萘乙酸0.05-0.2mg，蔗糖20～30g，瓊脂5～7g，其余為MS，pH5.5～5.8；再轉(zhuǎn)到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)生愈傷組織，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升中含有6-芐基嘌呤1.0-3.0mg，萘乙酸0.05-0.2mg，蔗糖20～30g，瓊脂5～7g，其余為MS，pH5.5～5.8；再將所產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織增殖和分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使愈傷組織的增殖和分化不定芽，所述的愈傷組織增殖和分化培養(yǎng)基每升中含有6-芐基嘌呤0.5-2.0mg，萘乙酸0.2-1.0mg，蔗糖20～30g，瓊脂5～7g，其余為MS，pH 5.5～5.8；上述各階段的培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度26～30℃，光照度1500～2000lx，光照8～12h/天；(3)生根培養(yǎng)和試管苗移栽將上述所產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20～30天至每株苗生根4～8條，所述的生根培養(yǎng)基每升中含有吲哚丁酸0.5-0.8mg，蔗糖20～30g，瓊脂5～7g，其余為MS，pH5.5～5.8；再使生根苗在自然光照下煉苗7-10天后，移栽到泥炭和蛭石按重量1∶1混配的混合基質(zhì)中。
全文摘要
一種非洲菊離體高頻再生繁殖方法，本發(fā)明以非洲菊試管苗葉柄作為高頻離體再生的材料，經(jīng)過花托初代培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和繼代增殖，生根培養(yǎng)和試管苗移栽等培養(yǎng)步驟，在培養(yǎng)繁殖的各階段調(diào)配優(yōu)選的培養(yǎng)基，包括花托初代培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷組織增殖和分化培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基和移栽培養(yǎng)基，提供合適的溫度和光照控制條件，使非洲菊能基于葉柄進(jìn)行離體高瀕快速繁殖而進(jìn)行種苗生產(chǎn)，并能應(yīng)用于非洲菊的遺傳轉(zhuǎn)化，滿足非洲菊種苗市場和進(jìn)行遺傳工程育種的需要。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101213939SQ20081002577
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日
發(fā)明者吳坤林, 俊 周, 美 張, 曾宋君, 俊 段, 楓 鄭, 陳之林 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院華南植物園