專(zhuān)利名稱(chēng)：大鼠硬脊膜外腔和蛛網(wǎng)膜下腔置管方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大鼠硬脊膜外腔和蛛網(wǎng)膜下腔置管方法。
背景技術(shù)：
從天然毒素中提取活性物質(zhì)尤其是活性多肽、蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，并開(kāi)發(fā)成藥物，是當(dāng)前 醫(yī)學(xué)和生物學(xué)界的研究熱點(diǎn)。但在天然活性多肽、蛋白質(zhì)類(lèi)新藥開(kāi)發(fā)研究中，需要對(duì)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物的硬脊膜外腔和蛛網(wǎng)膜下腔置管用藥，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的硬脊膜外腔和蛛網(wǎng)膜下腔置管 用藥(尤其是長(zhǎng)期置管用藥)問(wèn)題一直未得到有效解決。
本發(fā)明者在2002年參考人類(lèi)硬脊膜外腔和蛛網(wǎng)膜下腔臨床穿刺法和x線(xiàn)造影術(shù)定位， 并根據(jù)動(dòng)物的不同種類(lèi)和差異進(jìn)行適配和改進(jìn)，建立了大動(dòng)物(兔、犬、猴)脊髓硬膜外 腔和蛛網(wǎng)膜下腔短、長(zhǎng)期(>5個(gè)月)置管方法，保證了本單位擁有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的 國(guó)家I類(lèi)鎮(zhèn)痛新藥虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-I (HWTX-I )的藥效學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究圓滿(mǎn) 完成。
大白鼠是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，由于其具有與人類(lèi)較高的相似 性以及操作、飼養(yǎng)方便和價(jià)格較為經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。以往國(guó)內(nèi)外少 數(shù)實(shí)驗(yàn)室僅能進(jìn)行大白鼠蛛網(wǎng)膜下腔短期置管，采用的方法主要有兩種 一種是Yaksh等 人建立的枕骨大孔置管法，另一種為我國(guó)陳軍博士等人改進(jìn)的胸椎咬骨置管法。這些方法 操作較復(fù)雜，對(duì)動(dòng)物傷害較大，置管時(shí)間短且成功率不夠高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為天然活性多肽、蛋白質(zhì)類(lèi)新藥研究和開(kāi)發(fā)，提供一種損傷性小、 定位準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便的小動(dòng)物(大鼠)硬脊膜外和蛛網(wǎng)膜下腔置管方法。 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的小動(dòng)物類(lèi)，如大鼠的椎管結(jié)構(gòu)盡管細(xì)小， 其組織結(jié)構(gòu)和椎管的負(fù)壓特征均不明顯，但其硬脊膜外和蛛網(wǎng)膜下腔置管部位的定位仍然 可以像較大動(dòng)物一樣，采用臨床造影技術(shù)和X線(xiàn)監(jiān)測(cè)來(lái)確定；并且，在置管過(guò)程中可以利 用勾針將脊柱提起，從而可以不用剝離脊柱旁邊的肌肉和筋膜等組織就能充分暴露胸9與
胸H)之間的椎間隙，使置管過(guò)程傷害性更小，操作更簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性和成功率更高；此外， 本發(fā)明者利用胸8—9之間的椎板間天然小孔，用勾針將脊柱提起，從而不需要?jiǎng)冸x和剪 除脊柱兩旁的肌肉就能充分暴露椎間小孔，且不需要鉗咬椎骨就能準(zhǔn)確地較長(zhǎng)時(shí)間置管于 鼠硬脊膜外腔；在進(jìn)行鼠蛛網(wǎng)膜下腔置管時(shí)，也只需鉗咬掉天然椎間小孔周邊少許骨性組本發(fā)明包括胸椎插入和枕骨大孔插入法，前者適宜于短期置管法，后者適宜于長(zhǎng)期 置管法，現(xiàn)分述于下。
一、大鼠硬脊膜外腔置管法 (一)胸椎置管法
(l)使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)下，操作者用手指在麻醉動(dòng)物的背部沿頭端向尾部觸摸胸 椎的棘突，胸椎區(qū)域最突出的棘突為胸8。以此為中心，用毛剪將面積為8-12 cm、范圍內(nèi) 的鼠毛剪凈，用絡(luò)合碘棉簽擦拭消毒此皮膚區(qū)域2-3次；(2)在無(wú)菌條件下進(jìn)行以下操作 以胸8棘突為中心，平行于脊柱做一個(gè)約l-2厘米長(zhǎng)的皮膚切口，用開(kāi)口器依次張開(kāi)皮膚 和皮下脂肪，清楚地暴露大白鼠的背部肌肉、肌腱；(3)向大白鼠腰椎方向移動(dòng)張開(kāi)器，通 過(guò)辨認(rèn)肌腱連接點(diǎn)來(lái)確定胸u肋，然后從頭端方向上數(shù)找到胸9與胸u)之間的椎間隙；(4)
用勾針從脊柱側(cè)面扎進(jìn)胸K)棘突內(nèi)，向上提起脊柱，充分暴露胸9與胸H)之間的椎間隙;(5) 靠近胸jO棘突前沿，在胸9與胸W棘突之間，垂直于脊柱方向做一背部肌肉和肌腱的橫切 口，暴露椎管外側(cè)附著的白色骨膜；(6)用勾針輕輕挑開(kāi)骨膜，看到位于胸8與胸9椎間 隙之間的一個(gè)橢圓形小孔，通過(guò)該孔可看到乳白色的脊髓隨呼吸起伏；(7)用眼科鑷子夾 住專(zhuān)用PE-10聚乙烯管(總長(zhǎng)5-7cm)，先通過(guò)一肌肉隧道，然后順椎管腔使之插入硬脊膜 外腔，插入深度為1.5-2.0cm,至脊髓腰膨大處。PE-10管預(yù)先在1.5-2.0cm處用封口膜纏 成一個(gè)小結(jié)球以控制插入深度；(8)將小結(jié)球縫合固定在切口處肌肉上，絡(luò)合碘擦拭消毒 切口處肌肉、皮膚，依次縫合切開(kāi)的肌肉和皮膚層，用淋巴造影針將少量的0.9%NaCl注 射液通過(guò)PE-10管開(kāi)口端注入留置的PE-10管內(nèi)，以防PE-10管被組織液堵塞，加熱封閉 PE管開(kāi)口，并于大鼠腿部肌肉處注射抗感染藥物，以避免傷口感染。
藥物注射方法將受試藥品溶于生理鹽水中，用淋巴造影針通過(guò)留置的PE-10管注入 鼠脊髓硬脊膜外腔中，注射體積為lul/10g鼠體重，再用10ul0.9y。NaCl注射液沖洗PE-10 管。
置管部位的定位采用造影技術(shù)和x線(xiàn)監(jiān)測(cè)確定。將麻醉動(dòng)物固定于底板上，頭部朝上 置于x線(xiàn)機(jī)透視臺(tái)上。用玻璃微量注射器針尖插入留置的PE-10管內(nèi)，緩慢均勻注入造影 劑如碘必樂(lè)250tU。在x線(xiàn)監(jiān)控下，可見(jiàn)造影劑呈不典型的"圓錐形"沉積于硬脊膜外腔。
(二)枕骨大孔置管法
使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)下，于枕骨下沿背正中線(xiàn)切1.2-1.8cm長(zhǎng)的切口，暴露第一 頸椎，暴露寰枕后膜，將蛛網(wǎng)膜小心勾破一小孔，插入PE10管至蛛網(wǎng)膜下腔，PE10管進(jìn) 管深度6-8cm，至脊髓腰膨大處。外端留4-6cm長(zhǎng)，埋管，縫合切口 。其余操作步驟與(一) 胸椎置管法相同。二、大鼠蛛網(wǎng)膜下腔置管法
(一) 胸椎置管法
與硬脊膜外腔置管法基本相同。當(dāng)暴露位于胸8與胸9之間的橢圓形小孔后，用眼科 小剪刀通過(guò)該橢圓形小孔插入椎管中，小心剪去圓孔周邊骨性組織，略為擴(kuò)大該圓孔，以
充分暴露脊髓；用勾針勾破硬脊膜，此時(shí)可見(jiàn)少許清亮腦脊液流出；用眼科鑷夾住專(zhuān)用
PE-10管先通過(guò)一肌肉隧道，沿挑破的硬脊膜孔插入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，插入深度約為 1.5-2.0cm，直達(dá)脊髓腰膨大處；其余操作步驟與"一、大鼠硬脊膜外腔置管法(一)胸椎 置管法"相同。
將麻醉動(dòng)物固定于手術(shù)板，頭部朝上置于x線(xiàn)機(jī)透視臺(tái)上。用玻璃微量注射器插入留 置的PE-10管內(nèi)，緩慢均勻注入造影劑碘必樂(lè)250lU。在x線(xiàn)監(jiān)控下，可見(jiàn)到造影劑在推 管內(nèi)呈細(xì)柱狀分布于蛛網(wǎng)膜下腔。
(二) 枕骨大孔置管法
操作方法與所述"一、大鼠硬脊膜外腔置管法(二)枕骨大孔置管法"基本相同。只 是暴露寰枕后膜，不需將其勾一小孔，沿著寰枕膜插入PE-10管至蛛網(wǎng)膜下腔，PE-IO管 進(jìn)管深度6-8cm，至脊髓腰膨大處。外端留4-6cm長(zhǎng)，埋管，縫合切口。其余操作及造影 劑圖像同前述"一、大鼠硬脊膜外腔置管法(二)枕骨大孔置管法"。
本發(fā)明之大鼠硬脊膜外和蛛網(wǎng)膜下腔置管方法，具有操作簡(jiǎn)便、對(duì)動(dòng)物傷害性較小、 定位準(zhǔn)確和置管成功率高的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明置管方法，可解決活性多肽和蛋白質(zhì)新藥研究開(kāi)發(fā)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用藥途徑問(wèn)題。 可應(yīng)用于該類(lèi)新藥研發(fā)過(guò)程中，臨床前藥效學(xué)、藥理學(xué)及毒理學(xué)等各類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1:大白鼠硬脊膜外腔胸椎置管法實(shí)施例 . (l)使大白鼠于麻醉狀態(tài)下，操作者用手指在麻醉動(dòng)物的背部沿頭端向尾部觸摸胸椎 的棘突，胸椎區(qū)域最突出的棘突為胸8，以此為中心，用毛剪將直徑約5X2 cm范圍內(nèi)的 鼠毛剪凈，用絡(luò)合碘棉簽擦拭消毒此皮膚區(qū)域3次；(2)在無(wú)菌條件下，以胸s棘突為中心， 平行于脊柱做一個(gè)約1.5厘米長(zhǎng)的皮膚切口，用開(kāi)口器依次張開(kāi)皮膚和皮下脂肪，清楚地 暴露大白鼠的背部肌肉、肌腱；(3)向大白鼠腰椎方向移動(dòng)張開(kāi)器，通過(guò)辨認(rèn)肌腱連接點(diǎn)確 定胸13肋，然后從頭端方向上數(shù)找到胸9與胸K)之間的椎間隙；(4)用勾針從脊柱側(cè)面扎進(jìn)
胸H)棘突內(nèi)，向上提起脊柱，充分暴露胸9與胸H)之間的椎間隙；(5傳近胸H)棘突前沿， 在胸9與胸K)棘突之間，垂直于脊柱方向做一背部肌肉和肌腱的橫切口，暴露椎管外側(cè)附
著的白色骨膜；(6)用勾針輕輕挑開(kāi)骨膜，看到位于胸8與胸9椎間隙之間的一個(gè)橢圓形小孔；(7)用眼科鑷子夾住專(zhuān)用PE-10聚乙烯管(總長(zhǎng)6cm),先通過(guò)一肌肉隧道然后順 椎管腔使之插入硬脊膜外腔，插入深度為1.8cm，至脊髓腰膨大處，PE-10管預(yù)先在1.8cm 處用封口膜纏成一個(gè)小結(jié)球以控制插入深度；(8)將小結(jié)球縫合固定在切口處肌肉上，絡(luò) 合碘擦拭消毒切口處肌肉、皮膚，依次縫合切開(kāi)的肌肉和皮膚層，用淋巴造影針將少量 0.9%NaCl注射液通過(guò)PE-10管開(kāi)口端注入留置的PE-10管內(nèi)，以防PE-10管被組織液堵 塞，加熱封閉PE管開(kāi)口，并于大鼠腿部肌肉處注射16萬(wàn)單位青霉素。
使用本實(shí)施例置管法研究多肽類(lèi)神經(jīng)毒素HWTX-I經(jīng)大鼠脊髓硬脊膜外腔用藥對(duì)福爾 馬林結(jié)腸壁(c.w.)粘膜下注射誘導(dǎo)的大鼠急性炎性?xún)?nèi)臟疼痛的抑制性效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程為5% 福爾馬林溶液150ii I快速注入SD大鼠乙狀結(jié)腸壁粘膜下層，產(chǎn)生幾種可評(píng)估的反映內(nèi)臟 疼痛的固定性行為。在此傷害性刺激反應(yīng)前30分鐘，經(jīng)留置的PE-10導(dǎo)管向大白鼠硬脊膜 外腔分別注入各待測(cè)藥品和試劑，觀察其對(duì)該模型疼痛行為的影響。與生理鹽水陰性對(duì)照組 比較，美國(guó)同類(lèi)鎮(zhèn)痛新藥"-芋螺毒素CTX-MVHA (硬脊膜外腔給藥)和嗎啡(肌肉注射給 藥)兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組比較，10, 20， 50, 75和100iig/kg五個(gè)劑量組HWTX-I，進(jìn)行大鼠 硬脊膜外腔注藥，均能以劑量依賴(lài)方式明顯抑制福爾馬林c.w.注射誘導(dǎo)的傷害性行為反應(yīng)。 實(shí)施例2:大白鼠硬脊膜外腔枕骨大孔置管法實(shí)施例
使大白鼠處于麻醉狀態(tài)下，于枕骨下沿背正中線(xiàn)切約1.5cm長(zhǎng)的切口，暴露第一頸椎， 暴露寰枕后膜，將蛛網(wǎng)膜小心勾一小孔，插入PE10管至蛛網(wǎng)膜下腔，PE10管進(jìn)管深度約 7cm，至脊髓腰膨大處。外端約留5cm長(zhǎng)，埋管，縫合切口。其余操作步驟同實(shí)施例1。 實(shí)施例3:大白鼠蛛網(wǎng)膜下腔胸椎置管法實(shí)施例
當(dāng)暴露位于胸8與胸9之間的橢圓形小孔后，用眼科小剪刀通過(guò)該橢圓形小孔插入椎管 中，小心剪去圓孔周邊骨性組織，擴(kuò)大該圓孔，以充分暴露脊髓；用勾針勾破硬脊膜，此時(shí) 可見(jiàn)少許清亮腦脊液流出；用眼科鑷夾住專(zhuān)用PE-10管先通過(guò)一肌肉隧道，沿挑破的硬脊膜 孔插入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，插入深度約為1.8cm，直達(dá)脊髓腰膨大處；其余操作步驟同實(shí)施例1。 實(shí)施例4:大白鼠蛛網(wǎng)膜下腔枕骨大孔置管法實(shí)施例
暴露寰枕后膜(不需將其勾一小孔)，沿著寰枕膜插入PE-IO管至蛛網(wǎng)膜下腔，PE-10管 進(jìn)管深度7cm，至脊髓腰膨大處。外端約留5cm長(zhǎng)，埋管，縫合切口。其余操作步驟同實(shí)施 例l。
權(quán)利要求
1、一種大鼠硬脊膜外腔置管方法，其特征在于，包括大鼠胸椎置管法和枕骨大孔置管法，所述胸椎置管法包括以下步驟(1)使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)下，操作者用手指在麻醉動(dòng)物的背部沿頭端向尾部觸摸胸椎的棘突，胸椎區(qū)域最突出的棘突為胸8，以此為中心，用毛剪將面積為8-12cm2范圍內(nèi)的鼠毛剪凈，用絡(luò)合碘棉簽擦拭消毒此皮膚區(qū)域2-3次；(2)在無(wú)菌條件下進(jìn)行以下操作以胸8棘突為中心，平行于脊柱做一個(gè)約1-2厘米長(zhǎng)的皮膚切口，用開(kāi)口器依次張開(kāi)皮膚和皮下脂肪，清楚地暴露大白鼠的背部肌肉、肌腱；(3)向大白鼠腰椎方向移動(dòng)張開(kāi)器，通過(guò)辨認(rèn)肌腱連接點(diǎn)來(lái)確定胸13肋，然后從頭端方向上數(shù)找到胸9與胸10之間的椎間隙；(4)用勾針從脊柱側(cè)面扎進(jìn)胸10棘突內(nèi)，向上提起脊柱，充分暴露胸9與胸10之間的椎間隙；(5)靠近胸10棘突前沿，在胸9與胸10棘突之間，垂直于脊柱方向做一背部肌肉和肌腱的橫切口，暴露椎管外側(cè)附著的白色骨膜；(6)用勾針輕輕挑開(kāi)骨膜，看到位于胸8與胸9椎間隙之間的一個(gè)橢圓形小孔，通過(guò)該孔可看到乳白色的脊髓隨呼吸起伏；(7)用眼科鑷子夾住專(zhuān)用PE-10聚乙烯管(總長(zhǎng)5-7cm)，先通過(guò)一肌肉隧道，然后順椎管腔使之插入硬脊膜外腔，插入深度為1.5-2.0cm，至脊髓腰膨大處。PE-10管預(yù)先在1.5-2.0cm處用封口膜纏成一個(gè)小結(jié)球以控制插入深度；(8)將小結(jié)球縫合固定在切口處肌肉上，絡(luò)合碘擦拭消毒切口處肌肉、皮膚，依次縫合切開(kāi)的肌肉和皮膚層，用淋巴造影針將少量的0.9％NaCl注射液通過(guò)PE-10管開(kāi)口端注入留置的PE-10管內(nèi)，以防PE-10管被組織液堵塞，加熱封閉PE管開(kāi)口，并于大鼠腿部肌肉處注射抗感染藥物；所述枕骨大孔置管法為使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)下，于枕骨下沿背正中線(xiàn)切1.2-1.8cm長(zhǎng)的切口，暴露第一頸椎，暴露寰枕后膜，將蛛網(wǎng)膜小心勾破一小孔，插入PE10管至蛛網(wǎng)膜下腔，PE10管進(jìn)管深度6-8cm，至脊髓腰膨大處。外端留4-6cm長(zhǎng)，埋管，縫合切口；其余操作步驟與所述胸椎置管法相同。
2、 一種大鼠蛛網(wǎng)膜下腔置管方法，其特征在于，包括大鼠胸椎置管法和枕骨大孔置管法，所述胸椎置管法為當(dāng)暴露位于胸8與胸9之間的橢圓形小孔后，用眼科小剪刀通過(guò) 該橢圓形小孔插入椎管中，小心剪去圓孔周邊骨性組織，略為擴(kuò)大該圓孔，以充分暴露脊 髓；用勾針勾破硬脊膜，此時(shí)可見(jiàn)少許清亮腦脊液流出；用眼科鑷夾住專(zhuān)用PE-10管先通 過(guò)一肌肉隧道，沿挑破的硬脊膜孔插入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，插入深度約為1.5-2.0cm,直達(dá) 脊髓腰膨大處；其余操作步驟與權(quán)利要求1所述胸椎置管法相同；所述枕骨大孔置管法為暴露寰枕后膜，不需將其勾一小孔，沿著寰枕膜插入PE-IO 管至蛛網(wǎng)膜下腔，PE-10管進(jìn)管深度6-8cm，至脊髓腰膨大處；外端留4-6cm長(zhǎng)，埋管， 縫合切口 ；其余操作步驟與權(quán)利要求1所述枕骨大孔置管法相同。
全文摘要
大鼠硬脊膜外腔和蛛網(wǎng)膜下腔置管方法。本發(fā)明在置管過(guò)程中，利用勾針將脊柱提起，從而可以不必剝離脊柱旁邊的肌肉和筋膜等組織就能充分暴露胸₉與胸₁₀之間的椎間隙；利用胸8-9之間的椎板間天然小孔，用勾針將脊柱提起，從而不需要?jiǎng)冸x和剪除脊柱兩旁的肌肉就能充分暴露椎間小孔，且不需要鉗咬椎骨就能準(zhǔn)確地較長(zhǎng)時(shí)間置管于鼠硬脊膜外腔；在進(jìn)行鼠蛛網(wǎng)膜下腔置管時(shí)，也只需鉗咬掉天然椎間小孔周邊少許骨性組織。本發(fā)明之大鼠硬脊膜外和蛛網(wǎng)膜下腔置管方法，具有操作簡(jiǎn)便、對(duì)動(dòng)物傷害性較小、定位準(zhǔn)確和置管成功率高的優(yōu)點(diǎn)?？蓱?yīng)用于該類(lèi)新藥研發(fā)過(guò)程中，臨床前藥效學(xué)、藥理學(xué)及毒理學(xué)等各類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
文檔編號(hào)A61D7/00GK101301227SQ20081003164
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日
發(fā)明者張勇群, 梁宋平, 毛海峰, 羅學(xué)鋒, 鐘文濤, 陳嘉勤, 陳威華 申請(qǐng)人:湖南師范大學(xué)