一種針對(duì)miR?103?3p反義寡聚核苷酸及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物制備領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)miR?103?3p反義寡聚核苷酸。所述的針對(duì)miR?103?3p反義寡聚核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的針對(duì)miR?103?3p反義寡聚核苷酸可以用于制備治療蛛網(wǎng)膜下腔出血的藥物。本發(fā)明所提供的針對(duì)miR?103?3p反義寡聚核苷酸毒性小，能夠改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷。
【專利說(shuō)明】
一種針對(duì)m i R-103-3p反義寡聚核苷酸及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于小分子生物藥物領(lǐng)域，涉及一種針對(duì)miR-103-3p反義寡聚核苷酸及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH)是指腦底部或腦表面血管破裂后，血液流入蛛網(wǎng)膜下腔引 起相應(yīng)臨床癥狀的一種腦卒中，又稱原發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血。SAH約占全部腦卒中的5%-10%，年發(fā)病率約6-20/10萬(wàn)人。
[0003] SAH的常見(jiàn)原因有先天性動(dòng)脈瘤、腦血管畸形、腦底異常血管網(wǎng)病(moyamoya?。┮?及夾層動(dòng)脈瘤、血管炎、高血壓動(dòng)脈硬化等。血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，通過(guò)圍繞在腦和脊髓周 圍的腦脊液迅速播散，刺激腦膜引起腦膜刺激征。顱內(nèi)容量增加引起顱內(nèi)壓升高，甚至腦 疝。在腦室和腦地凝固的血液可阻塞腦脊液循環(huán)通路，使其吸收和回流受阻引起梗阻性腦 積水，或引起蛛網(wǎng)膜粘連，后交通動(dòng)脈瘤的擴(kuò)張或破裂出血可壓迫鄰近的動(dòng)眼神經(jīng)，產(chǎn)生不 同程度的動(dòng)眼神經(jīng)麻痹。血細(xì)胞釋放的血管活性物質(zhì)可引起血管痙攣，嚴(yán)重者發(fā)生腦梗死。 血液刺激下丘腦可引起血糖升高、發(fā)熱等內(nèi)分泌和自主神經(jīng)紊亂。SAH在30天內(nèi)病死率約為 25%或更高。再出血的病死率為50%，2周內(nèi)再出血率為20%-25%。影響SAH患者預(yù)后的的 主要因素是早期腦損傷和血管痙攣導(dǎo)致的遲發(fā)型腦損傷等并發(fā)癥。目前臨床上SAH的治療 手段十分有限，僅有一般處理和對(duì)癥治療、降低顱內(nèi)壓、防治再出血。對(duì)于早期腦損傷，尚缺 乏有效的治療策略。
[0004] MicroRNAs(miRNAs)為一類長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA，在體內(nèi)可與 目的基因 mRNA的3'UTR互補(bǔ)結(jié)合從而抑制目的基因的表達(dá)。從藥物開(kāi)發(fā)的角度來(lái)看， MicroRNAs具有序列已知且短小，通常在物種間完全保守等顯著優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)越來(lái)越多的動(dòng) 物實(shí)驗(yàn)甚至臨床試驗(yàn)表明疾病相關(guān)microRNAs的抑制劑反義寡聚核苷酸有望成為一種全新 的藥物。反義寡聚核苷酸是人工合成的一小段寡核苷酸，其可以與成熟的microRNAs互補(bǔ)結(jié) 合從而阻止microRNAs與目的基因 mRNA相互作用。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病相關(guān)microRNAs進(jìn)行有效 抑制，反義寡聚核苷酸需經(jīng)過(guò)一系列的化學(xué)修飾其中包括硫代磷酸骨架修飾，高親和力二 糖修飾以及膽固醇修飾。這些化學(xué)修飾使得反義寡聚核苷酸的核酸酶抵抗力，細(xì)胞攝取力 及其與目的基因的親和力均大大提高了，從而能有效的在體內(nèi)發(fā)揮抑制作用。反義寡聚核 苷酸也有可能綁定其他相似序列造成脫祀現(xiàn)象(off-target effects)，從而引起無(wú)法預(yù)料 的后果。其真實(shí)藥效情況如何，既往并無(wú)研究證據(jù)。
[0005] miR-103_3p又稱低氧誘導(dǎo)microRNA，屬于miR-15/107家族成員。多種芯片信息表 明miR-103-3p在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)且在卒中后表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，預(yù)示著其對(duì)于中樞 神經(jīng)系統(tǒng)基因表達(dá)調(diào)控有著重要的作用。有研究顯示，miR-103-3p與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中將近 20%的mRNA有著高度重疊。目前已報(bào)道抑制miR-103-3p表達(dá)的慢病毒載體對(duì)胰腺癌細(xì)胞的 表達(dá)有抑制作用。但尚未見(jiàn)抑制miR-103-3p表達(dá)對(duì)腦血管病變有療效的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種針對(duì)miR-103-3p反 義寡聚核苷酸。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述miR-103-3p反義寡聚核苷酸的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種針對(duì)m i R - 1 〇 3 - 3 p反義寡聚核苷酸的核苷酸序列如下：5'_ TCATAGCCCTGTACAATGCTGCT-3'（SEQ ID N0.1)。
[0010] 所述的針對(duì)miR-103-3p的反義寡聚核苷酸優(yōu)選經(jīng)過(guò)5'端膽固醇修飾和3'端甲基 化修飾。
[0011]本發(fā)明所述的針對(duì)miR-103-3p的反義寡聚核苷酸在制備治療腦血管病的藥物中 的應(yīng)用。
[0012] 所述的腦血管病優(yōu)選治療蛛網(wǎng)膜下腔出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷。
[0013] 一種用于治療腦血管病的藥物，包括藥理學(xué)有效劑量的本發(fā)明所述的針對(duì)miR-l〇3-3p的反義寡聚核苷酸以及藥理學(xué)可接受的載體。
[0014] 所述的腦血管病優(yōu)選蛛網(wǎng)膜下腔出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷。
[0015] 所述的載體描述了對(duì)有機(jī)體不造成明顯刺激并且不消弱miR-103-3p反義寡聚核 苷酸生物活性和性能的物質(zhì)。載體必須有足夠的純度和足夠低的毒性，以使其適合施用至 正在治療的對(duì)象。載體可以是惰性的，或它可以具有藥學(xué)益處。
[0016] miR-103-3p反義寡聚核苷酸和所述的載體可被制備成脂質(zhì)體、納米材料、微乳液、 微球、凝膠或囊泡等劑型。這些劑型的制備方法和所用的輔料均為現(xiàn)有技術(shù)。
[0017] 有益效果：
[0018]本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的miR-103-3p反義寡聚核苷酸能夠改善蛛網(wǎng)膜下 腔出血后的早期腦損傷，包括改善血腦屏障的破壞，降低神經(jīng)元的死亡和凋亡，進(jìn)而對(duì)腦組 織起到保護(hù)作用，可用于制備治療蛛網(wǎng)膜下腔出血的藥物。
[0019] 相對(duì)于其他miRNAs抑制劑，本發(fā)明提供的針對(duì)miR-103-3p反義寡聚核苷酸具有分 子量小，毒性小，穩(wěn)定性及細(xì)胞攝取率高等優(yōu)點(diǎn)，可用于腦血管疾病的實(shí)驗(yàn)治療研究，有一 定的藥物開(kāi)發(fā)前景。
【附圖說(shuō)明】
[0020]
[0021] 圖1為假手術(shù)組、反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱陰性對(duì)照組，下同）、miR-103_ 3p反義寡聚核苷酸組(簡(jiǎn)稱反義寡聚核苷酸組，下同）建模后miR-103-3p表達(dá)情況的比較。 圖2為在出血量嚴(yán)重程度評(píng)分時(shí)對(duì)腦底基底池的具體分區(qū)。
[0022] 圖3為假手術(shù)組、反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組、miR-103_3p反義寡聚核苷酸組建模 后腦基底池出血量嚴(yán)重程度評(píng)分的比較。
[0023] 圖4為假手術(shù)組、反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組、miR-103_3p反義寡聚核苷酸組建模 后24h血腦屏障破壞程度比較結(jié)果。
[0024] 圖5為假手術(shù)組、反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組、miR-103_3p反義寡聚核苷酸組建模 后1，3,7，14,28天的行為學(xué)的比較。
【具體實(shí)施方式】 [0025] 實(shí)施例1
[0026] 1 方法
[0027] 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0028] 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠300_350g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí) 驗(yàn)中心提供，術(shù)前單籠飼養(yǎng)3天，以避免非特異性因素的影響，飼養(yǎng)于室溫20±2°C，12小時(shí) 光照/12小時(shí)黑暗環(huán)境中，保證自由飲食飲水。
[0029] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0030] 1.2.1動(dòng)物分組
[0031] 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham)、反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組、miR-103-3p反 義寡聚核苷酸組。
[0032] (1)假手術(shù)組:線栓插入顱內(nèi)，但并不刺破血管；
[0033] (2)反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組：SAH建模前24h，按照0.2nmo 1/uL(總共5uL)，以 luL/10min經(jīng)側(cè)腦室給予反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照， 3'（SEQ ID NO.2)同樣經(jīng)過(guò)5'端膽固醇修飾和3'端甲基化修飾的寡聚核苷酸，但是不具有 抑制miR-103-3p的功能。
[0034] (3)miR-103-3p反義寡聚核苷酸組：SAH建模前24h，按照0.2nmol/uL(總5uL)，以 luL/10min經(jīng)側(cè)腦室給予miR-103-3p反義寡聚核苷酸。
[0035] 1.2.2 SAH模型制備
[0036] 用10%水合氯醛將大鼠麻醉達(dá)適宜狀態(tài)后，仰臥位固定于鼠板，以顱內(nèi)血管穿刺 法建立大鼠 SAH模型。大鼠頸部備皮并消毒，解剖并充分暴露出右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈， 結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總近心端，并在頸內(nèi)動(dòng)脈起始處預(yù)留一根線，在兩個(gè)結(jié)之間的頸總動(dòng)脈 上用顯微手術(shù)剪剪一個(gè)小口，用手術(shù)鑷持帶有尖端的4-0線栓通過(guò)頸總上的小口緩慢插入， 經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，直到感覺(jué)到阻力后再將線栓向前3mm以刺破大腦前和中動(dòng)脈的分支處。刺 破后立即將線栓抽出，將頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎，即成功建造大鼠 SAH模型。假手術(shù)組的大鼠，在線栓 緩慢入顱后感覺(jué)到阻力即撤出，并不刺破血管。術(shù)中、術(shù)后都注意大鼠的保溫以及隨后能自 由飲食飲水，直到取腦安樂(lè)死。
[0037] 1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定miR-103-3p的表達(dá)量
[0038]引物由上海杰瑞公司合成，m i R - 1 〇 3 - 3 P逆轉(zhuǎn)錄引物：5 ' CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATAG 3'（SEQ ID 腸.3)，上游引物：5' ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACAGGGC 3 ' ( SEQ ID NO · 4 )，下游弓| 物^-TGGTGTCGTGGAGTCG-3 '（ SEQ ID NO · 5);內(nèi)參U6:上游引物：5 ' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 '（ SEQ IDN0·6)，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'（SEQIDN0·7)。取正?；騍AH術(shù)后大鼠 右側(cè)半球腦組織，用TRIzol提取組織總RNA并測(cè)定RNA濃度。取200-400ng的RNA為模板，使用 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)體系為25ul，cDNA 2ul，上游引物0.5ul，下 游引物0.5ul，SYBR混合液12.5ul，采用兩步法PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:預(yù)變性95度X 30s，1個(gè)循 環(huán);變性95度X 15s，退火加延伸60度X 30s，46個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)結(jié)算結(jié)果，結(jié) 果以表示。
[0039] 1.4 SAH嚴(yán)重程度評(píng)分測(cè)定
[0040] 各組大鼠造模后24h取腦，將腦底拍照，在照片中，將基底池分為6個(gè)部分（圖1)，然 后按照表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。
[0041 ] 表1 SAH后出血嚴(yán)重程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
[0042]
[0043] 1.5大鼠神經(jīng)功能評(píng)分
[0044] 在建模1，3，7，14，28天后進(jìn)行大鼠運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能評(píng)分(如表2)。
[0045] 表2大鼠運(yùn)動(dòng)感覺(jué)神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
[0046]
[0047] 1.6 Evans Blue法檢測(cè)血腦屏障通透性
[0048] 各組大鼠建模后24h，按5ml/kg的劑量經(jīng)尾靜脈注射2%Evans blue生理鹽水溶 液，循環(huán)60分鐘后，進(jìn)行心臟灌注，取腦后將腦組織分為左右半球，并分別稱量左右半球的 重量(g)，分別加入3ml甲酰胺，然后置于60°C水浴箱中24h后取出，在620nm下測(cè)吸光度值， 計(jì)算出左右半球的EB含量(ug)，EB的含量/腦組織重量(ug/g)即代表血腦屏障被破壞程度。
[0049] 2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0050] 本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均使用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，行單因素方 差分析或t檢驗(yàn)，P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0051 ] 3 結(jié)果
[0052] 3.1 miR-103-3p反義寡聚核苷酸能夠明顯抑制SAH術(shù)后miR-103-3p表達(dá)。
[0053] 如圖1所示miR-103-3p反義寡聚核苷酸組相對(duì)于反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組，SAH 術(shù)后24h miR-103-3p表達(dá)顯著下調(diào)（P〈0.01) AAH術(shù)前24h側(cè)腦室給予0.2nmol/uL(總共 5uL)的miR-103-3p反義寡聚核苷酸可顯著抑制miR-103-3p的表達(dá)。
[0054] 3.2 SAH嚴(yán)重程度情況
[0055] 假手術(shù)組腦基底池并無(wú)出血，而反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組、miR-103_3p反義寡 聚核苷酸組腦基底池出血嚴(yán)重程度之間并沒(méi)有顯著差異(P>〇.〇5)(如圖3)。
[0056] 3.3血腦屏障通透性改變
[0057] 伊文思藍(lán)染料滲透試驗(yàn)可顯示血腦屏障的通透性，伊文思藍(lán)滲出越多說(shuō)明血腦屏 障損傷越嚴(yán)重。相對(duì)于假手術(shù)組，反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組、miR-103-3p反義寡聚核苷酸 組血腦屏障的均有不同程度的破壞，但是相比于反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組，miR-103-3p 反義寡聚核苷酸組伊文思藍(lán)染料的滲出明顯減少(P〈〇.01)。（如圖4)
[0058] 3.4神經(jīng)行為學(xué)改變
[0059] 大鼠的改良Garcia評(píng)分在SAH術(shù)后1，3，7，14，28天進(jìn)行，主要從運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和前庭 功能等方面對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估。每組大鼠行為學(xué)評(píng)分顯示如圖5,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)假手 術(shù)組大鼠之間行為學(xué)均無(wú)明顯差異(Ρ>〇.〇5)ΑΑΗ術(shù)后1天miR-103-3p反義寡聚核苷酸組大 鼠的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)及前庭功能評(píng)分較反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組有明顯改善(P〈〇.05)，隨后 評(píng)分略有上升，但是3,7，14天miR-103-3p反義寡聚核苷酸組與反義寡聚核苷酸陰性對(duì)照組 相比差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 05)。
[0060]上述結(jié)果證實(shí):miR-103-3p反義寡聚核苷酸能夠改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦 損傷，包括降低神經(jīng)元的死亡和凋亡，改善血腦屏障的破壞，進(jìn)而對(duì)腦組織起到保護(hù)作用， 可用于制備治療蛛網(wǎng)膜下腔出血的藥物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種針對(duì)miR-103-3p的反義寡聚核苷酸，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO.l 所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)miR-103-3p的反義寡聚核苷酸，其特征在于:所述的針對(duì) miR-103_3p的反義寡聚核苷酸經(jīng)過(guò)5 '端膽固醇修飾和3 '端甲基化修飾。3. 權(quán)利要求1或2所述的針對(duì)miR-103-3p的反義寡聚核苷酸在制備治療腦血管病的藥 物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腦血管病為蛛網(wǎng)膜下腔出血、蛛網(wǎng)膜 下腔出血后的早期腦損傷。5. -種用于治療腦血管病的藥物，其特征在于包括藥理學(xué)有效劑量的權(quán)利要求1或2所 述的針對(duì)miR-103-3p的反義寡聚核苷酸以及藥理學(xué)可接受的載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于所述的腦血管病為蛛網(wǎng)膜下腔出血、蛛網(wǎng)膜 下腔出血后的早期腦損傷。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK106086026SQ201610489433
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】葉瑞東, 王劉敏, 劉新峰
【申請(qǐng)人】葉瑞東