專利名稱：：一種能對霉菌毒素降解的菌株及其制劑的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種能降解毒素的菌株及其制劑的制備方法，尤其是一種能對霉菌毒素降解的菌株及其應用。
背景技術：
：真菌毒素是由植物病原真菌侵染谷類作物后產(chǎn)生的一類具有廣泛化學結(jié)構(gòu)的有毒次級代謝產(chǎn)物，對人和動物具有廣泛的毒性作用，能引起人和動物癌癥、肝毒性等各種癥狀。目前已知能產(chǎn)生霉菌毒素的霉菌就有150余種，霉菌毒素約有300種。其中在詞料衛(wèi)生上比較重要的霉菌毒素大部分來源于曲霉菌屬(Apergz7ws)、鐮刀菌屬(i^sw/謂)、青霉菌屬(/^"&7//謂)等。而由這些霉菌可以產(chǎn)生包括黃曲霉素、棕曲霉素、赭曲霉素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、T-2毒素、伏馬菌素等許多霉菌毒素。據(jù)估計，每年全世界有25%的糧食作物受到霉菌毒素的污染。聯(lián)合國糧農(nóng)組織估算，全世界每年由此造成的經(jīng)濟損失可達數(shù)千億美元。因此，農(nóng)產(chǎn)品中霉菌毒素的污染問題己成為不可忽視的問題。而對于那些已被毒素污染的農(nóng)產(chǎn)品的處理主要采取的還是物理或者化學的方法，如分離霉變的谷物，加入未污染的產(chǎn)品進行混合以達到稀釋毒素的效果，加入吸附劑，如硅鋁酸鹽、沸石、膨潤土、活性炭、硅藻土等，或者是用一些堿性化合物，如氨水，氫氧化鈉和氫氧化鈣等來處理毒素。雖然所有的這些都在一定程度上對減輕毒素污染有一定的作用，但其最大的不足是去毒效果有限、可能造成重要營養(yǎng)物質(zhì)的丟失、成本較高等。因此該領域有關人士認為脫毒的最佳方法是生物脫毒，即在溫和條件下，不用有害的化學藥品，不會造成營養(yǎng)價值的丟失，也不會降低適口性，而使真菌毒素脫毒。由于微生物數(shù)量大、種類多，基因資源豐富，降解有機污染物的潛力很大，幾乎所有導致環(huán)境污染的有機物都能被微生物所分解，而且干凈徹底、無二次污染。因此，微生物去毒是目前消除毒素污染的最好辦法。我國是一個植物病害的重發(fā)區(qū)，而且在農(nóng)產(chǎn)品的晾曬和儲備方面的設備和技術還是比較落后，這就造成我國農(nóng)產(chǎn)品中的毒素含量偏高，毒素的存在除了嚴重危害糧食的產(chǎn)量和品質(zhì)，對人畜的健康，造成嚴重威脅以外，還限制著我國農(nóng)產(chǎn)品的出口貿(mào)易。對于毒素的處理國內(nèi)還沒有切實可行的方法，市場上一些去毒素產(chǎn)品如天然霉菌毒素吸附劑，微生物去毒劑等也是從國外進口的。進口產(chǎn)品的高昂價格阻礙了這些產(chǎn)品的廣泛應用。上世紀八十年代開始歐美等國家就開始研究用方便、快速、靈敏的免疫檢測技術來檢測農(nóng)產(chǎn)品中的毒素，而九十年代開始就研究用生物的方法對毒素進行處理，如用微生物和酶制劑處理毒素，從而降低或者是完全去除農(nóng)產(chǎn)品中毒素的危害。單端孢霉烯族真菌毒素(Trichothecenemycotoxins簡稱Ts)是由生長在植物上的半知真菌(FungiImperfecti)類多種產(chǎn)毒真菌，在特定條件下所產(chǎn)生的一類有相同基本化學結(jié)構(gòu)的毒性代謝產(chǎn)物。這類毒素共包括了近100種化合物，它們的基本結(jié)構(gòu)是具有四環(huán)狀12，13—環(huán)氧單端孢烯族化合物骨架結(jié)構(gòu)。恨據(jù)其化學結(jié)構(gòu)的不同，一般將這類毒素分為A,B，C,D四類，其中主要幾種毒素包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，T-2毒素，雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)，鐮刀菌烯酮等毒素。Ts在自然界中污染十分廣泛，對人畜健康危害較大。在糧食作物生長的任何地區(qū)，在一定的條件下，植物會遭到多種真菌的侵害。盡管真菌的存在不是決定Ts存在的唯一指標.但由于其與Ts的產(chǎn)生有關，因而真菌的存在是判斷毒素存在最常用的指標。另外，T-2毒素和4.15一二醋酸草鐮刀菌烯醇(DAS)被認為是所謂"黃雨"化學戰(zhàn)劑的組分，因而引起了國際間廣泛的注意。在天然農(nóng)產(chǎn)品中基本上都能檢測到Ts的存在，含量大多在010ppm之間。這些毒素的存在會引起人和動物產(chǎn)生頭疼，惡心，嘔吐，出血，白細胞缺乏，咽炎，皮膚壞死，嚴重的會引起休克和死亡。Ts之所以會產(chǎn)生如此嚴重的危害主要是因為Ts對機體各組織器官具有廣泛的生物效應，主要包括免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)。破壞分裂旺盛的組織器官，如淋巴結(jié)、胸腺、胃腸道、骨髓、脾臟、睪丸和卵巢。作用機制一般認為是抑制蛋白蛋和DNA的合成。蛋白質(zhì)合成效率高的細咆，如胃腸道和淋巴細胞對Ts更為敏感。Ts的次要細咆毒性應包括引起DNA斷裂，增加膜的脆性以及影響能量代謝等。Ts具有弱的致畸性和致癌性。免疫抑制和組織壞死比DNA損傷更為重要。Ts對胃腸道和淋巴器官的毒性效應類似于放射性損傷，但毒性效應范圍更為廣泛，心臟和胰臟也是耙器官。綜上所述，為了保障我國人們的食品安全和身體健康，并保證農(nóng)產(chǎn)品的順利出口，有必要分離篩選高效降解毒素的菌株，研究其生物學特性，降解特性以及對毒素的解毒機理，并且把降解菌株和適當?shù)牟牧辖Y(jié)合，選擇合適的劑型，制成霉菌毒素去毒劑，進一步研究霉菌毒素去毒劑作為詞料添加劑和植物抑菌去毒劑的去毒效果。最終為解決飼料中毒素污染問題，提高糧食的使用效率，保證畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)，并對糧食產(chǎn)量和食品質(zhì)量安全控制起到很大的推動作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對糧食生產(chǎn)和飼料加工和保存過程中霉菌毒素廣泛污染的問題，開發(fā)研制出能對霉菌毒素降解的菌株及其制劑。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種能對霉菌毒素降解的菌株，其特征在于該菌株的保藏號為CCTCCM208087，其生物學特性為細胞短桿狀，無芽孢，革蘭氏陰性，在TSA培養(yǎng)基上菌落呈象牙色，好氧；接觸酶陽性，氧化酶陰性，尿酶陽性，吲哚反應陰性，能水解七葉靈，不能雙水解精氨酸，不能水解酪素，不能水解淀粉，不能分解酪氨酸，不能液化明膠，該菌株能利用葡萄糖，不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露糖、麥芽糖；該菌株16SrDNA的Genbank登陸號為EU794908。在本發(fā)明中，所述的霉菌毒素包括單端孢霉烯族毒素，或黃曲霉毒素，或玉米赤霉烯酮。一種利用權(quán)利要求l所述菌株的制劑的制備方法，其特征在于a)將菌株原種在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上獲得試管種備用；b)將試管種置于搖瓶培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，獲得菌種；c)將上述培養(yǎng)好的菌種接種入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，獲得種子液；e)將獲得的種子液接種入生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)，出罐形成能對霉菌毒素降解的液體菌劑。在上述能對霉菌毒素降解的菌株的制備方法中，搖瓶、種子罐和生產(chǎn)罐所用的培養(yǎng)基為葡萄糖1.0%，(NHt)2SO40.1%，K2HPO40.2%，MgS040.02%，NaC10.01%，CaC030.3%，蛋白胨0.05°/。，蒸餾水適量；培養(yǎng)基的pH值7.27.5。在上述能對霉菌毒素降解的菌株的制備方法中所述的培養(yǎng)基需要12rC高壓濕熱滅菌后冷卻至30^35'C使用；所述的菌種按種子罐中培養(yǎng)基的10%接種量接種入種子罐；所述的種子液按生產(chǎn)罐中培養(yǎng)基的IO%接種量接種入生產(chǎn)罐。在上述能對霉菌毒素降解的菌株的制備方法中，在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為l:0.6~1.2,攪拌速度為180~240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為3035。C，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量至少達到10億個/ml。在上述能對霉菌毒素降解的菌株的制備方法中，將獲得的能對霉菌毒素降解的液體菌劑采用泥炭吸附形成固體菌劑劑型，或者將能對霉菌毒素降解的液體菌劑與粘土拌勻，制成霉菌毒素去毒劑。本發(fā)明的優(yōu)點在于利用A16降解霉菌毒素，在解決毒素污染的過程中，不存在二次污染，從而提高農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量，確保人畜的食用安全；A16具有較廣的降解譜，能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-Ac-DON)、雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol)，鐮刀菌烯酮-X(fosarenon-X)，黃曲霉毒素B1，其除毒效果均達90%以上，對玉米赤霉烯酮也有明顯的除毒效果；使用A16菌株生產(chǎn)降解真菌毒素的各種制劑，具有生產(chǎn)使用成本低，使用安全的優(yōu)勢。具體實施例方式實施例1A16的獲得從江蘇農(nóng)科院的小麥地里采集土樣，在實驗室中用脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行多次傳代富集培養(yǎng)(30°C，每周傳代一次)，得到能夠降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的菌懸液，把菌懸液在LB培養(yǎng)基上進行涂布培養(yǎng)(3tTC，7d)，在平板上挑取不同的菌落，一一驗證對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的降解效果，最終獲得能夠降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的菌株，加入甘油，在-7(TC冰箱保存。對于該菌株自定義為A16。通過測定A16的生理生化特性，克隆A16的16SrDNA序列并對該16SrDNA序列進行測序，把測序結(jié)果在Genbank進行BLAST比較，確定了A16的系統(tǒng)發(fā)育進化地位。通過A16的生理生化特征結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育進化地位的結(jié)果，最終把A16鑒定為德沃斯氏菌(Devow'a^w/m)，并于2008年6月我們首次將A16的16SrDNA登陸到Genbank，登陸號為EU794908。2008年6月10日我們將A16寄存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCCM208087，分類命名為Devow'aZmw/aeA16，主要生物學特性為為細胞短桿狀，無芽孢，革蘭氏陰性，在TSA培養(yǎng)基上菌落呈象牙色，好氧。接觸酶陽性，氧化酶陰性，尿酶陽性，n引哚反應陰性，能水解七葉靈，不能雙水解精氨酸，，不能水解酪素，不能水解淀粉，不能分解酪氨酸，不能液化明膠，該菌株能利用葡萄糖，不能利用L-阿拉伯實施例2液體菌劑的制備培養(yǎng)基為葡萄糖1.0%,(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.2%，MgS040.02%，NaC10.01%，CaCO30.3%，蛋白胨0.05%,其余為蒸餾水；培養(yǎng)基的pH值7.2~7.5。將A16菌株在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上獲得試管種備用。將試管種接種于含200mLLB的lOOOmL搖瓶中，3(TC恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，獲得菌種。釆用500升的種子罐，培養(yǎng)基投料量400升，投料完畢后12rc高壓濕熱滅菌，冷卻至35t:以下后，將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐中培養(yǎng)基的10%接種量接種入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，獲得種子液，期間攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為l:0.8，培養(yǎng)時間約4860小時。生產(chǎn)罐容量為5噸，培養(yǎng)基投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1kg/cm2的壓力下，12rc高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35r以下，將種子液按生產(chǎn)罐中培養(yǎng)基的10%接種量接種入生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達到10億個/ml以上，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0.8—1.0，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時間約4860小時，出罐后形成能對霉菌毒素降解的液體菌劑。實施例3固體菌劑的制備將實施例2生產(chǎn)出來的A16液體菌劑與曬干的泥炭混勻成固體狀，從而制成A16的固體菌劑。所述的泥炭由黑龍江樺美泥炭有限公司提供。實施例4霉菌毒素去毒劑的制備將實施例2獲得的液體菌劑與市場上購買的粘土按照1:5的重量比混合制成霉菌毒素去毒劑。實施例5A16制劑對部分單端孢霉烯族毒素降解效果培養(yǎng)基為(NH4)2S040.5g/L，KH2P040.5g/L，K2HP041.5g/L，MgS040.02g/L,NaC10.5g/L，毒素10mg/L，蒸餾水適量；培養(yǎng)基的pH值7.0。在培養(yǎng)基中分別加入的毒素是DON、3-AcDON、nivalenol和fosarenon-X(在本試驗中使用的DON、3-AcDON、nivalenol和fiisarenon-X均從Sigma公司購買)將含有毒素的培養(yǎng)基分成對照組和試驗組，將實施例2獲得的液體菌劑按照5%的接種量分別接入加入試驗組中含有不同種毒素的培養(yǎng)基中，對照組和試驗組置于30°C，180r/min，搖床培養(yǎng)48小時后分別取樣，采用高效液相色譜法進行毒素含量的檢測，并計算得出A16對不同毒素的降解率，結(jié)果如表l。表1:Z)evow》f附w/aeA16對不同單端孢霉烯族毒素的降解性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例6A16制劑對部分霉菌毒素降解效果將飼料分成對照組和試驗組，將實施方案4制成的霉菌毒素去毒劑按照5%的比例加入到試驗組詞料中，混勻，將對照組和試驗組均按l:1的比例加入蒸餾水，37。C作用2小時后，分別過濾，取上清液，用液相色譜方法檢測上清液中DON毒素，黃曲霉毒素B1，玉米赤霉烯酮的含量，并進行計算得出A16制劑對不同種毒素的去毒效果，結(jié)果如表2。表2:霉菌毒素去毒劑對霉菌毒素的去毒效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種能對霉菌毒素降解的菌株，其特征在于該菌株的保藏號為CCTCCM208087，其生物學特性為細胞短桿狀，無芽孢，革蘭氏陰性，在TSA培養(yǎng)基上菌落呈象牙色，好氧；接觸酶陽性，氧化酶陰性，尿酶陽性，吲哚反應陰性，能水解七葉靈，不能雙水解精氨酸，不能水解酪素，不能水解淀粉，不能分解酪氨酸，不能液化明膠，該菌株能利用葡萄糖，不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露糖、麥芽糖；該菌株16SrDNA的Genbank登陸號為EU794908。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的能對霉菌毒素降解的菌株，其特征在于所述的霉菌毒素包括單端孢霉烯族毒素，或黃曲霉毒素，或玉米赤霉烯酮。3、一種利用權(quán)利要求l所述菌株的制劑的制備方法，其特征在于a)將菌株原種在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上獲得試管種備用；b)將試管種置于含有培養(yǎng)基的搖瓶中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，獲得菌種；c)將上述培養(yǎng)好的菌種接種入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，獲得種子液；e)將獲得的種子液接入生產(chǎn)罐發(fā)酵培養(yǎng)，出罐形成能對霉菌毒素降解的液體菌劑。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述制劑的制備方法，其特征在于搖瓶培養(yǎng)基、種子罐和生產(chǎn)罐所用的培養(yǎng)基為葡萄糖1.0%，(NH4)2SO40.1%,K2HP040.2%，MgSO40.02%，NaC10.01%，CaC030.3°/。，蛋白胨0.05%，蒸餾水適量；培養(yǎng)基的pH值7.27.5。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述制劑的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基需要12rC高壓濕熱滅菌后冷卻至3035'C使用；所述的菌種按種子罐中培養(yǎng)基的10%接種量接種入種子罐；所述的種子液按生產(chǎn)罐中培養(yǎng)基的10%接種量接種入生產(chǎn)罐。6、根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述制劑的制備方法，其特征在于在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為l:0.6-1.2，攪拌速度為180~240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為3035"C，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量至少達到10億個/ml。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述制劑的制備方法，其特征在于將獲得的能對霉菌毒素降解的液體菌劑采用泥炭吸附，形成固體菌劑。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述制劑的制備方法，其特征在于將獲得的能對霉菌毒素降解的液體菌劑與吸附劑拌勻，制成霉菌毒素去毒劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種能對霉菌毒素降解的菌株及其制劑的制備方法，其特征在于該菌株的保藏號為CCTCCM208087，其生物學特性為細胞短桿狀，無芽孢，革蘭氏陰性，在TSA培養(yǎng)基上菌落呈象牙色，好氧；接觸酶陽性，氧化酶陰性，尿酶陽性，吲哚反應陰性，能水解七葉靈，不能雙水解精氨酸，不能水解酪素，不能水解淀粉，不能分解酪氨酸，不能液化明膠，該菌株能利用葡萄糖，不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露糖、麥芽糖；該菌株16SrDNA的Genbank登陸號為EU794908，以及利用所述菌株的制備液體菌劑、固體菌劑和霉菌毒素去毒劑的方法。文檔編號A23K1/16GK101381688SQ20081012267公開日2009年3月11日申請日期2008年6月18日優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日發(fā)明者史建榮,徐劍宏,芳祭,陸瓊嫻申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院