專利名稱：一種連作障礙自毒物質(zhì)降解菌及其制備的復(fù)合微生物肥料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種連作障礙土壤中自毒物質(zhì)降解菌改良作物品質(zhì)的應(yīng)用，屬于微生物肥料，更具體的說(shuō)，是涉及一種連作障礙自毒物質(zhì)降解菌及其制備的復(fù)合微生物肥料。
背景技術(shù)：
隨著栽培年限的增加，土壤自毒物質(zhì)累計(jì)、次生鹽潰化現(xiàn)象不斷出現(xiàn)并日益加重，嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，阻礙作物生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。此外，土壤中自毒物質(zhì)的連年累計(jì)使得土壤微生態(tài)環(huán)境趨于惡性循環(huán)?？傊?，一種可以改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，營(yíng)造有益菌群的連作障礙自毒物質(zhì)降解菌及其制備的復(fù)合微生物肥料尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提供了一種連作障礙自毒物質(zhì)降解菌及其制備的復(fù)合微生物肥料。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種自毒物質(zhì)降解菌的保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6896，保藏日期為2012年11月28日，分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，所述自毒物質(zhì)降解菌的分離方法包括如下步驟(I)菌株的分離采用逐漸提高苯甲酸濃度的馴化方法，將連作10年的番茄根系土壤懸液按10%的接種量接種于含有IOOmg / L苯甲酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30°C下?lián)u床150r / min，培養(yǎng)3天后，以10%接種量轉(zhuǎn)至苯甲酸濃度為300mg / L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)。按此方式連續(xù)循環(huán)3次，三次所用的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，苯甲酸的濃度依次為300mg / L、600mg / L、IOOOmg / L，然后進(jìn)行平板涂布，將培養(yǎng)皿放于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入苯甲酸濃度為IOOOmg / L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，反復(fù)涂布，得到苯甲酸降解菌菌懸液；所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成為(NH4)2SO42g / L7KH2PO4 2g / L，Na2HPO41. 3g /L，苯甲酸100 IOOOmg / L，NaCl 5g / L，余量為水；培養(yǎng)基的ΡΗ=6· 8 7· 2 ;(2)菌株的篩選與鑒定a.初篩將5ml步驟(I)所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加到15mm X 150mm試管中，121 °C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml步驟(I)得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到試管中，每株菌重復(fù)2管，28°C下避光培養(yǎng)5天，每24h觀察記錄I次生長(zhǎng)情況；b、復(fù)篩將50ml步驟(I)所述的無(wú)機(jī)鹽 培養(yǎng)基加到250ml三角瓶中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml初篩得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到三角瓶中，加入Iml無(wú)菌水，每處理重復(fù)3次，28 V下避光培養(yǎng)10天，檢測(cè)苯甲酸殘留量，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，空白對(duì)照組中用水代替無(wú)菌水，計(jì)算降解率。
c.鑒定對(duì)復(fù)篩獲得的菌株進(jìn)行16SrDNA序列測(cè)定，采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為，取PCR產(chǎn)物Iul進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測(cè).用瓊脂糖凝膠純化試劑盒(購(gòu)自大連寶生物公司)切膠回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，菌株的16SrDNA序列測(cè)序結(jié)果登錄GenBank,并用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，將得到的相似菌株的16SrDNA，利MEGA4. O軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析各分離菌株的進(jìn)化地位。復(fù)合微生物肥料由重量比為2 3 :7 8的復(fù)合微生物菌劑和腐植酸氨組成。所述的復(fù)合微生物菌劑的制備方法為，將自毒物質(zhì)降解菌、固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌按照1:1:2的菌株比例置于培養(yǎng)基中，在pH=7. O 7. 2，溫度為35 39°C的條件下培養(yǎng)12-18小時(shí)，得到的產(chǎn)物復(fù)合微生物菌劑。所述肥料的制備方法為，(I)將自毒物質(zhì)降解菌、固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌按照1:1:2的菌株比例置于培養(yǎng)基中，在pH=7. O 7. 2，溫度為35 39°C的條件下培養(yǎng)12-18小時(shí)，得到的復(fù)合微生物菌劑；

(2)將有機(jī)質(zhì)大于45wt%的煤炭腐殖酸、硫酸銨、水按重量比為4 6 :0· 8 1. 2 :O. 4 O. 6混拌均勻后封閉起來(lái)，在25°C下進(jìn)行氨化螯合反應(yīng)，反應(yīng)5 10天得到腐植酸氨；(3)將復(fù)合微生物菌劑和腐植酸氨按照2 3 :7 8的重量比混合后得到終產(chǎn)物復(fù)合微生物肥料。步驟(I)中培養(yǎng)基的組成及重量配比為，豆餅粉2 3%，麥麩O. 5 1%，(NH4)2SO4O. 5 1%，K2HPO4 O. 07 O. 1%，KH2PO4 O. 03 O. 5%, MgSO4 · 7H20 O. 01 O. 05%，余量為水；步驟(I)中培養(yǎng)基的組成及重量配比為，豆餅粉2%，麥麩O. 5%, (NH4)2SO4 O. 5%，K2HPO4 O. 07%, KH2PO4 O. 03%, MgSO4 · 7Η200· 01%，余量為水。步驟(2)中煤炭腐殖酸、硫酸銨、水的重量比為5 1 0. 5。步驟(2)中煤炭腐殖酸的細(xì)度為100 120目。步驟(3)中，復(fù)合微生物菌劑和腐植酸氨的重量比為3:7。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明通過(guò)降解土壤中自毒物質(zhì)，改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，營(yíng)造有益菌群優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，極大地改善了土壤的微生態(tài)系統(tǒng)，增強(qiáng)了土壤透氣性，提高了土壤保水保肥能力。2、本發(fā)明使土壤有了可持續(xù)增產(chǎn)增收的發(fā)展?jié)摿?。并且有效轉(zhuǎn)化底肥，釋出小分子養(yǎng)份與活性因子，改良土壤肥力，解除化肥、農(nóng)藥及有害因子對(duì)土壤的破壞，克服連作障礙。3、本發(fā)明生產(chǎn)的肥料產(chǎn)品離子活性較強(qiáng)，具有調(diào)酸堿能力、緩釋、長(zhǎng)效的特點(diǎn)，成本低廉，施用后可以有效改善改良土壤理化性狀，提高種子出苗率，增強(qiáng)秧苗的抗旱、抗寒、病蟲(chóng)害的能力，可以顯著提高農(nóng)產(chǎn)品中微量元素的含量，滿足人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的需求。4、本發(fā)明可單獨(dú)使用，也可按照一定的比例加入到單元素和多元素的大量肥料中。加入到復(fù)合肥料中制成高端多元素復(fù)合肥料；加入到單元素的肥料中，能提高單元素的利用率和有效性。5、本發(fā)明以豆餅粉、麥麩等有機(jī)物料為培養(yǎng)基主要成分，以分離篩選到的自毒物質(zhì)降解菌、PGPR菌株為原始菌種，發(fā)酵培養(yǎng)后形成具有調(diào)節(jié)作物營(yíng)養(yǎng)平衡及生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，增強(qiáng)抗病性，降低病蟲(chóng)害的發(fā)生率，減少農(nóng)藥用量的作用。促進(jìn)有益菌大量繁殖，有效抑制土壤傳染性病害的發(fā)生，增強(qiáng)植株抗病能力，延緩植株老化多種天然抑菌酵素強(qiáng)效防治土壤傳染性病蟲(chóng)害的發(fā)生。6、本發(fā)明將微生物和腐殖酸熬合劑相結(jié)合。本發(fā)明生產(chǎn)的復(fù)合微生物肥料，適用于各種農(nóng)作物，提高肥料利用率15%以上，增產(chǎn)10%?？勺鳛榈追室淮涡允┤?，省工省時(shí)省力省錢(qián)。7、本發(fā)明生產(chǎn)工藝極其簡(jiǎn)單。本發(fā)明所提到的粒狀肥料，生產(chǎn)工藝極易于現(xiàn)代的復(fù)合肥生產(chǎn)工藝相結(jié)合，在原有的復(fù)合肥生產(chǎn)設(shè)備基礎(chǔ)上進(jìn)行生產(chǎn)造粒。工藝方法簡(jiǎn)單，有利于在肥料工業(yè)生產(chǎn)中推廣使用。8、本發(fā)明制得的產(chǎn)物可提高作物的營(yíng)養(yǎng)成分如氨基酸、維生素C、糖類等成分的含量，促進(jìn)植株根系旺盛，降低硝酸鹽含量，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。9、本發(fā)明制得的產(chǎn)物可調(diào)節(jié)作物營(yíng)養(yǎng)平衡及生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，增強(qiáng)抗病性，降低病蟲(chóng)害的發(fā)生率，減少農(nóng)藥用量。促進(jìn)有益菌大量繁殖，有效抑制土壤傳染性病害的發(fā)生，增強(qiáng)植株抗病能力，延緩植株老化多種天然抑菌酵素強(qiáng)效防治土壤傳染性病蟲(chóng)害的發(fā)生，如猝倒病、枯萎病、青枯病、線蟲(chóng)、根腐病等。
具體實(shí)施例方式一種自毒物質(zhì)降解菌的保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6896，保藏日期為2012年11月28日，所述自毒物質(zhì)降解 菌的分離方法包括如下步驟(I)菌株的分離采用逐漸提高苯甲酸濃度的馴化方法，將連作10年的番茄根系土壤懸液按10%的接種量接種于含有IOOmg / L苯甲酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30°C下?lián)u床150r / min，培養(yǎng)3天后，以10%接種量轉(zhuǎn)至苯甲酸濃度為300mg / L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)。按此方式連續(xù)循環(huán)3次，三次所用的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，苯甲酸的濃度依次為300mg / L、600mg / L、IOOOmg / L，然后進(jìn)行平板涂布，將培養(yǎng)皿放于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入苯甲酸濃度為IOOOmg / L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，反復(fù)涂布，得到苯甲酸降解菌菌懸液；所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成為(NH4)2SO42g / L，KH2PO4 2g / L，Na2HPO41. 3g /L，苯甲酸100 IOOOmg / L，NaCl 5g / L，余量為水；培養(yǎng)基的ΡΗ=6· 8 7· 2 ;(2)菌株的篩選與鑒定a.初篩將5ml步驟(I)所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加到15mmX 150mm試管中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml步驟(I)得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到試管中，每株菌重復(fù)2管，28°C下避光培養(yǎng)5天，每24h觀察記錄I次生長(zhǎng)情況；b、復(fù)篩將50ml步驟(I)所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加到250ml三角瓶中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml初篩得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到三角瓶中，加入Iml無(wú)菌水，每處理重復(fù)3次，28 V下避光培養(yǎng)10天，檢測(cè)苯甲酸殘留量，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，空白對(duì)照組中用水代替無(wú)菌水，計(jì)算降解率。c.鑒定對(duì)復(fù)篩獲得的菌株進(jìn)行16SrDNA序列測(cè)定，采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為，取PCR產(chǎn)物Iul進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測(cè).用瓊脂糖凝膠純化試劑盒(購(gòu)自大連寶生物公司)切膠回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，菌株的16SrDNA序列測(cè)序結(jié)果登錄GenBank,并用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，將得到的相似菌株的16SrDNA，利MEGA4. O軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析各分離菌株的進(jìn)化地位。實(shí)施例1將自毒物質(zhì)降解菌、固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌按照1:1:2的菌株比例置于培養(yǎng)基中，在pH=7. O,溫度為39°C的條件下培養(yǎng)16小時(shí)，得到的復(fù)合微生物菌劑；培養(yǎng)基的組成及重量配比為，豆餅粉 2%，麥麩 O. 5%, (NH4)2SO4 O. 5%, K2HPO4 O. 07%, KH2PO4 O. 03%, MgSO4 · 7H20O. 01%，余量為水。接著將有機(jī)質(zhì)大于45wt%的煤炭腐殖酸、硫酸銨、水按重量比為5 1 0. 5混拌均勻后封閉起來(lái)，在25°C下進(jìn)行氨化螯合反應(yīng)，反應(yīng)10天得到腐植酸氨。最后，將復(fù)合微生物菌劑和腐植酸氨按照3 7的重量比混合后得到終產(chǎn)物復(fù)合微生物肥料。肥料的PH=I 3、腐殖酸含量為5_10wt%，有效活菌數(shù)達(dá)到108。實(shí)施例2將10公斤實(shí)施例1制得的復(fù)合微生物肥料加入到40公斤的復(fù)合肥15-15-15(即氮、磷和鉀的質(zhì)量含量各為15%)中，混均并基施到I畝番茄大棚中，對(duì)照組為復(fù)合肥15-15-15,同樣的施用量、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間，本發(fā)明產(chǎn)品的番爺總產(chǎn)量比對(duì)照組增產(chǎn)17. 8%，經(jīng)濟(jì)效益也相應(yīng)提高了，詳見(jiàn)表I。表I不同處理對(duì)番爺產(chǎn)量的影響
權(quán)利要求
1.一種自毒物質(zhì)降解菌，其特征在于，其保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6896，保藏日期為2012年11月30日。
2.—種自毒物質(zhì)降解菌的分離篩選方法，其特征在于， 所述自毒物質(zhì)降解菌的分離方法包括如下步驟， (1)菌株的分離 采用逐漸提高苯甲酸濃度的馴化方法，將連作10年的番茄根系土壤懸液按10%的接種量接種于含有IOOmg / L苯甲酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30°C下?lián)u床150r / min，培養(yǎng)3天后，以10%接種量轉(zhuǎn)至苯甲酸濃度為300mg / L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)； 按此方式連續(xù)循環(huán)3次，三次所用的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，苯甲酸的濃度依次為300mg / L、600mg / LUOOOmg / L，然后進(jìn)行平板涂布，將培養(yǎng)皿放于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入苯甲酸濃度為IOOOmg / L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，反復(fù)涂布，得到苯甲酸降解菌菌懸液； 所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組成為(NH4)2SO4 2g / LjKH2PO4 2g / LjNa2HPO4L 3 g /L，苯甲酸100 1000m g / L，NaCl 5 g / L，余量為水；培養(yǎng)基的PH=6. 8 7. 2 ; (2)菌株的篩選與鑒定 a.初篩將5ml步驟(I)所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加到15mmX150mm試管中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將I ml步驟(I)得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到試管中，每株菌重復(fù)2管，28°C下避光培養(yǎng)5天，每24h觀察記錄I次生長(zhǎng)情況； b.復(fù)篩將50ml步驟(I)所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加到250ml三角瓶中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml初篩得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到三角瓶中，加入Iml無(wú)菌水，每處理重復(fù)3次，28 V下避光培養(yǎng)10天，檢測(cè)苯甲酸殘留量，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，空白對(duì)照組中用水代替無(wú)菌水，計(jì)算降解率； c.鑒定對(duì)復(fù)篩獲得的菌株進(jìn)行16SrDNA序列測(cè)定， 采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為，取PCR產(chǎn)物Iul進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測(cè).用瓊脂糖凝膠純化試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析； 菌株的16SrDNA序列測(cè)序結(jié)果登錄GenBank,并用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，將得到的相似菌株的16SrDNA，利MEGA4. 0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析各分離菌株的進(jìn)化地位。
3.一種復(fù)合微生物肥料，其特征在于，其由重量比為2 3 :7 8的復(fù)合微生物菌劑和腐植酸氨組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)合微生物肥料，其特征在于，所述的復(fù)合微生物菌劑的制備方法為，將自毒物質(zhì)降解菌、固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌按照1:1:2的菌株比例置于培養(yǎng)基中，在pH=7. 0 7. 2，溫度為35 39°C的條件下培養(yǎng)12-18小時(shí)，得到的產(chǎn)物復(fù)合微生物菌劑。
5.一種復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，所述肥料的制備方法為， (1)將自毒物質(zhì)降解菌、固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌按照1:1:2的菌株比例置于培養(yǎng)基中，在pH=7. 0 7. 2，溫度為35 39°C的條件下培養(yǎng)12-18小時(shí)，得到的復(fù)合微生物菌劑； (2)將有機(jī)質(zhì)大于45wt%的煤炭腐殖酸、硫酸銨、水按重量比為4 6:0. 8 1. 2 :0.4 0. 6混拌均勻后封閉起來(lái)，在25°C下進(jìn)行氨化螯合反應(yīng)，反應(yīng)5 10天得到腐植酸氨； (3)將復(fù)合微生物菌劑和腐植酸氨按照2 3 :7 8的重量比混合后得到終產(chǎn)物復(fù)合微生物肥料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(I)中培養(yǎng)基的組成及重量配比為，豆餅粉2 3%，麥麩0. 5 1%, (NH4)2SO4 0. 5 1%, K2HPO4 0. 07 0.1%，KH2PO4 0. 03 0. 5%, MgSO4 7H20 0. 01 0. 05%,余量為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于 步驟(I)中，培養(yǎng)基的組成及重量配比為，豆餅粉2%，麥麩0.5%，(NH4)2SO4 0.5%，K2HPO4 0. 07%, KH2PO4 0. 03%, MgSO4 7H20 0. 01%,余量為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，煤炭腐殖酸、硫酸銨、水的重量比為5 1 :0. 5。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，煤炭腐殖酸的細(xì)度為100 120目。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合微生物肥料的制備方法，其特征在于步驟(3)中，復(fù)合微生物菌劑和腐植酸氨的重量比為3:7。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種連作障礙自毒物質(zhì)降解菌及其制備的復(fù)合微生物肥料。自毒物質(zhì)降解菌其保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No.6896，保藏日期為2012年11月28日，分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。一種復(fù)合微生物肥料由重量比為2～3∶7～8的復(fù)合微生物菌劑和腐植酸氨組成。本發(fā)明通過(guò)降解土壤中自毒物質(zhì)，改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，營(yíng)造有益菌群優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，極大地改善了土壤的微生態(tài)系統(tǒng)，增強(qiáng)了土壤透氣性，提高了土壤保水保肥能力。本發(fā)明使土壤有了可持續(xù)增產(chǎn)增收的發(fā)展?jié)摿?。并且有效轉(zhuǎn)化底肥，釋出小分子養(yǎng)份與活性因子，改良土壤肥力，解除化肥、農(nóng)藥及有害因子對(duì)土壤的破壞，克服連作障礙。
文檔編號(hào)C12R1/125GK103045506SQ201210532558
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者何志剛, 婁春榮, 安景文 申請(qǐng)人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院