一種具有霉菌毒素靶向作用的磁性-熒光功能納米生物復(fù)合物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明材料學(xué)、光譜化學(xué)、納米生物傳感等領(lǐng)域，特指一種具有霉菌毒素靶向作用的磁性-熒光功能納米生物復(fù)合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)產(chǎn)品在生長(zhǎng)、收割、貯運(yùn)及加工過程中都易滋生或接觸到產(chǎn)毒霉菌，從而導(dǎo)致霉菌毒素(mycotoxins)進(jìn)入食物鏈。攝入被霉菌毒素污染嚴(yán)重的農(nóng)產(chǎn)品和由其加工的食品會(huì)產(chǎn)生多種急性中毒癥狀，如急性嘔吐、出血癥、多發(fā)性神經(jīng)炎、雌激素亢進(jìn)等，死亡率極高。需要指出的是，與被細(xì)菌毒素污染的食物顏色會(huì)變深或散發(fā)出難聞的氣味不同，被霉菌毒素污染的農(nóng)產(chǎn)品，在外觀及氣味上往往沒有明顯異樣，不易被察覺。同時(shí)，霉菌毒素是小分子物質(zhì)，極耐熱，毒性不因通常的加熱而被破壞，因此可以通過每餐的進(jìn)食在人體內(nèi)不斷累積而產(chǎn)生慢性中毒，直接促發(fā)膽管、食管、胃、腸、肺、腎、肝等臟器腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，人類癌癥的65%以上是因食物被污染引起的，而霉菌毒素正是推高這一比例的“始作俑者”，其中黃曲霉毒素是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一，毒性是氰化鉀的10倍。因此，研制對(duì)霉菌毒素具有靶向識(shí)別作用的多功能探針，并探索其在復(fù)雜實(shí)際樣品高靈敏靶向富集檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)，在食品安全與食品質(zhì)量監(jiān)測(cè)等方面具有十分重要的意義。核酸適配體(Aptamer)是一類具有特異性識(shí)別功能的單鏈核酸分子，具有與單克隆抗體相媲美的親和力與特異性。與單克隆抗體相比，apt還具有以下優(yōu)點(diǎn):可在體外篩選，分子量較低，靶分子范圍廣，沒有免疫源性和毒性，可通過化學(xué)合成制備、改造與標(biāo)記，化學(xué)穩(wěn)定性好，能可逆變性與復(fù)性，具有較高的純度和加工精確性。近年來，一些典型的霉菌毒素，如郝曲霉毒素A(OTA)，黃曲霉毒素BI (AFBI)，黃曲霉毒素Ml (AFM1)，伏馬毒素BI (FBI)已經(jīng)成功篩選出了可以對(duì)其高特異識(shí)別的Aptamer ο
[0003]量子點(diǎn)(QDs)又稱半導(dǎo)體納米晶，粒徑一般在1nm以下，由于其電子和空穴被量子限域，受激后可以發(fā)射熒光。同熒光染料相比，量子點(diǎn)的激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布、發(fā)射光譜窄而對(duì)稱，光化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，是一類理想的熒光探針。更重要的是，單一種類的量子點(diǎn)就能夠按照尺寸變化，產(chǎn)生一個(gè)發(fā)光波長(zhǎng)不同的、顏色分明的標(biāo)記物家族，已被應(yīng)用于DNA、疾病標(biāo)志物、腫瘤細(xì)胞等的多組分聯(lián)合檢測(cè)。當(dāng)然，我們也注意到，由于生物樣品的復(fù)雜性以及待測(cè)樣品所涉及物質(zhì)的多樣性，量子點(diǎn)熒光探針在實(shí)際應(yīng)用中還受到功能單一性的限制，無法滿足目前生物傳感體系多任務(wù)化的要求。因此，無論是納米材料基礎(chǔ)研究，還是食品安全監(jiān)管、臨床診斷、藥物篩選等實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域，都迫切需要將量子點(diǎn)的出色熒光性能與其他功能元素進(jìn)行有效耦合，發(fā)展新型多功能納米生物探針來打破束縛，拓展和深化納米科技在適配體傳感領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。通常多組分是實(shí)現(xiàn)多功能的有效途徑，將具有各自功能的不同的單一組分通過某種方式集成在一起，新構(gòu)建的多組分納米結(jié)構(gòu)不但可以表現(xiàn)出其各個(gè)組分的性質(zhì)和功能，而且往往可以由于其性質(zhì)相互作用而表現(xiàn)出單一組分材料所不具備的新功能。磁性-熒光多功能納米探針在復(fù)雜生物樣品中特定組分的快速識(shí)別、富集、分離及高靈敏檢測(cè)等領(lǐng)域具有巨大的潛在優(yōu)勢(shì)。
[0004]目前已報(bào)道的熒光-磁性多功能納米材料，大多存在穩(wěn)定性差、不易于修飾、生物相容性差等問題，并且很少用于構(gòu)建多功能探針并實(shí)現(xiàn)食源性霉菌毒素靶向識(shí)別。本發(fā)明旨在發(fā)明一種穩(wěn)定性好、容易修飾、生物相容性好的磁性-熒光-分子靶向多功能納米生物復(fù)合物，為復(fù)雜食品樣品中霉菌毒素的高靈敏靶向富集檢測(cè)提供簡(jiǎn)便、快捷、可靠的偵檢工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明已經(jīng)考慮到現(xiàn)有技術(shù)中出現(xiàn)的問題，旨在發(fā)明一種穩(wěn)定性好、容易修飾、生物相容性好的磁性-熒光-分子靶向多功能納米生物復(fù)合物，為復(fù)雜食品樣品中霉菌毒素的高靈敏靶向富集檢測(cè)提供簡(jiǎn)便、快捷、可靠的偵檢工具。解決現(xiàn)有多功能探針?biāo)嬖诘姆€(wěn)定性差、不易于修飾、生物相容性差、不具有霉菌毒素靶向識(shí)別作用等難題。
[0006]所采用的方案概括為:首先制備了S12包覆的Fe3O4磁性納米球，提高Fe3O4納米球的穩(wěn)定性和生物相容性；再在S12殼層表面吸附陽離子聚合物，將荷負(fù)電的的組裝CdTeQDs組裝在S12殼層表面制備磁性-熒光雙功能納米球;進(jìn)一步，將氨基末端的霉菌毒素的aptamer在偶聯(lián)劑的作用下連接在納米球制備具有霉菌毒素靶向作用的磁性-熒光功能納米生物復(fù)合物。
[0007]本發(fā)明是通過如下具體技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種具有霉菌毒素靶向作用的磁性-熒光功能納米生物復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟:
[0009]步驟1、水溶性CdTe量子點(diǎn)(簡(jiǎn)稱為CdTeQDs)水溶液的制備；
[0010]步驟2、Fe304磁性納米球分散液的制備；
[0011 ] 步驟3、S12包覆Fe304(簡(jiǎn)稱為Fe3O4OS12)磁性納米球分散液的制備；
[0012]步驟4、CdTe QDs包覆Fe3O4OS12雙功能納米球Fe3O4OS12OCdTe QDs分散液的制備:取用步驟3中制備的Fe3O4OS12磁性納米球，向其中加入0.02M NaCl溶解的聚二烯丙基二甲基氯化銨PDDA溶液，進(jìn)行機(jī)械攪拌反應(yīng)A;將產(chǎn)物磁性分離，水洗，避光自然干燥，將干燥后的產(chǎn)物重新分散在水中，制得I3DDA修飾的Fe3O4OS12納米球Fe3O4OS12-PDDA分散液;最后，向I3DDA修飾的Fe3O4OS12納米球Fe3O4OS12-PDDA分散液中加入CdTe QDs水溶液，進(jìn)行機(jī)械攪拌反應(yīng)B，經(jīng)磁性分離，二次水洗后，避光自然干燥，將干燥后制得的Fe304@Si02@CdTeQDs重新分散在水中，得到Fe3O4OS12OCdTe QDs分散液，備用；
[0013]步驟5、Fe304@Si02@CdTe QDs標(biāo)記的具有霉菌毒素靶向功能的納米生物復(fù)合物分散液的制備:取步驟4制備的Fe3O4OS12OCdTe QDs水分散液，加入1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC水溶液和N-羥基丁二酰亞胺NHS水溶液，振蕩反應(yīng)，隨后加入Aptamer儲(chǔ)備液，振蕩孵育過夜，反應(yīng)完畢后，離心洗滌，將產(chǎn)物重新分散在Tris-HCl溶液中，制得具有霉菌毒素靶向功能的磁性-熒光功能納米生物復(fù)合物Fe304@Si02@CdTe QDs-Aptamer分散液，備用。
[0014]所述步驟I中，水溶性CdTe QDs水溶液的制備方法為:稱取0.0638g碲粉和0.0449g硼氫化鈉置入1mL比色管中，加入4mL超純水，通N2除氧15min后置于4°C冰箱中反應(yīng)得到碲氫化鈉(NaHTe)溶液;將0.1142g CdCl2.2.5H20和75yL巰基丙酸加入到含50mL二次水的三頸燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下磁力攪拌5min，用2M NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至8.5，迅速加入上述制備的NaHTe溶液2mL，繼續(xù)攪拌30min，100°C下回流0.5?12h，可分別得到不同粒徑的CdTe QDs ；停止反應(yīng)恢復(fù)至室溫，加入10mL乙醇攪拌然后靜置15min，離心后，避光自然干燥，將沉淀物重新分散得到1mg mL—M^CdTe QDs水溶液，4°C避光保存，備用。
[0015]所述步驟2中，F(xiàn)e304磁性納米球分散液的制備方法為:將1mL乙二醇，1mL—縮乙二醇，和0.5536g FeCl3.6H20加入到燒杯中，攪拌30min后，向其中加入1.5g醋酸鈉和Ig聚乙二醇并使其分散均勻，隨后將其轉(zhuǎn)移至25mL的反應(yīng)釜中，200 °C下反應(yīng)2h;冷卻后，將混合物移至小燒杯中，磁性分離、乙醇洗滌5次，避光自然干燥，制得濃度為20mg mL—
米球分散液。
[0016]所述步驟3中，F(xiàn)e3O4OS12磁性納米球分散液的制備方法為:取步驟2制備的5mLFe3O4納米球分散液加入到10mL的檸檬酸鈉溶液(1M)中，室溫下攪拌反應(yīng)3h，隨后70°C下回流2h，磁分離去除清液，得到檸檬酸根修飾的Fe304(C-Fe3O4)；向制得的C-Fe3O4加入0.5mL3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，攪拌反應(yīng)3h，磁分離去除清液后，加入0.15mL正硅酸四乙酯(TEOS)，1mL氨水(28wt % )和80mL乙醇，機(jī)械攪拌12h，磁性分離、水洗，避光自然干燥，將制得的Fe3O4OS12重新分散在二次水中，其質(zhì)量濃度為1mg mL一、
[0017]所述步驟4中，制備Fe3O4OS12OCdTe QDs分散液時(shí)，所用的Fe3O4OS12分散液、PDDA溶液、CdTe QDs水溶液的體積比為5:50:2;所用的I3DDA溶液的質(zhì)量濃度為0.4wt%,所制得的Fe3O4OS12OCdTe QDs分散液的濃度為1mg mL—S所述機(jī)械攪拌反應(yīng)A的時(shí)間為lh，機(jī)械攪拌反應(yīng)B的時(shí)間為3h。
[0018]所述