專利名稱：：適應(yīng)小麥玉米秸稈還田的土傳病害生防菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物制劑，具體說是一種適用于小麥玉米秸稈還ffl地塊，既能有效控制作物土傳病害，又能加速秸稈分解的生防菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：(一)秸稈還田后土傳病害和耕作質(zhì)量問題急需解決小麥玉米兩熟種植是中國北方糧食生產(chǎn)的土要形式，生產(chǎn)中廣泛采用的秸稈還田對改良土壤發(fā)揮了重要作用。但近年來發(fā)現(xiàn)秸稈還田地塊小麥土傳病害呈加重發(fā)生趨勢，例如2006年河北、山東、河南省小麥紋枯病發(fā)生面積分別達62、67、181.3萬hnr';小麥全蝕病在河北、河南、山東、江蘇等省發(fā)生面積也有所擴大，輕者減產(chǎn)10%-20%，重者減產(chǎn)50°/。以上；2008年冀魯豫冬麥區(qū)根腐病大面積發(fā)生，導(dǎo)致葉片枯黃，產(chǎn)量下降。專家認為秸稈還FH為土傳病菌營造了適宜的環(huán)境條件，使其數(shù)量不斷積累，導(dǎo)致病害加重。小麥、玉米秸稈主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，自然條件下腐爛分解速度很慢。尤其是玉米秸稈量大，還ffl后至小麥返青期土壤溫度較低，春季又丁旱少雨，腐解更慢。加之現(xiàn)有機械難以將秸稈充分粉碎和深翻，影響整地質(zhì)量和播種質(zhì)量，形成的虛空苗床對小麥生根和幼苗生長極為不利，還導(dǎo)致旱、凍災(zāi)害加重。(二)生產(chǎn)中急需通過合理利用秸稈趨利避害的植保技術(shù)和產(chǎn)品土傳病害防治是植保領(lǐng)域的一大難題，利用生物防治控制土傳病害是當(dāng)前研究的熱點。生防菌劑具有選擇性強、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，雖然大量具有生防潛力的微生物被研究報道，但只有少數(shù)生防菌株用于商業(yè)化制劑生產(chǎn)，這是因為實驗室中篩選到的生防菌株以活體形式進入土壤后，由于缺乏有利T迅速定植和增殖的基質(zhì)，而難以形成優(yōu)勢種群。生防菌在土壤中的適應(yīng)能力和產(chǎn)生拮抗物質(zhì)能力的穩(wěn)定性也會受到不利影響。篩選能利用分解秸桿產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)快速繁殖的生防菌株，研制菌劑，可實現(xiàn)加速秸稈分解、補充土壤有機質(zhì)和多種養(yǎng)分、快速壯大牛防菌種群、控制土傳病害等多重功效。(三)合理利用還田秸稈可提高生防菌劑對土傳病害的防治效果我國每年產(chǎn)生的作物秸稈量約6億噸。目前黃淮海平原冬小麥秸稈由于各地大型收割機的普及，基本上實現(xiàn)了直接覆蓋還田，而玉米秸稈還ffl主要采用粉碎翻耕還田的方式，在很3多地區(qū)由于農(nóng)機粉碎和翻埋秸稈作業(yè)效能差，加之玉米秸稈翻耕還w后分解速度緩慢，對耕層土壤結(jié)構(gòu)和小麥播種、生長均造成不利影響。利用高效纖維素分解菌加速秸稈分解的研究已取得一些進展，但在農(nóng)ffl土壤中的應(yīng)用效果，同樣面臨因受諸多環(huán)境因素影響而大幅下降的問題。大量秸桿還田使土壤生態(tài)環(huán)境發(fā)生了很大改變，結(jié)合該耕作栽培措施篩選對秸稈適應(yīng)強、拮抗性廣譜的功能菌株，開發(fā)有關(guān)產(chǎn)品和制劑，使拮抗微生物在利用秸稈獲取營養(yǎng)的同時，加速秸稈分解、補充土壤養(yǎng)分、改善土壤環(huán)境、增強抑菌效果。進一歩對施用方法進行系統(tǒng)研究，充分利用還ffl秸稈使之成為有益微生物在土壤中的營養(yǎng)來源和發(fā)揮生防作用的載體，將有利于生防菌劑在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容針對我國北方小麥玉米兩熟秸稈還ra生產(chǎn)實際情況，篩選出對土傳病菌具有較強拮抗作用，可加快秸稈分解，同時能利用分解秸稈產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)快速繁殖的多功能菌株。以資源廣泛且廉價的有機材料為基質(zhì)，以適量礦物營養(yǎng)元素為增效劑，確定多功能菌株的高效固態(tài)發(fā)酵工藝，制成多功能土傳病害生防菌劑。通過大田試驗測試菌劑在對土傳病害的防治效果、對作物秸稈的分解能力，以及菌株在秸稈還w土壤中的增范能力，確定多功能土傳病害生防菌劑m間使用方法。最終達到通過使用該菌劑加速還田秸稈分解、改善土壤性狀，生防菌在土壤中的定植、增殖能力得到提高，生防菌發(fā)揮群體優(yōu)勢有效控制土傳病害的多重效果。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何有關(guān)具有上述多重功效生防菌劑的報道，本發(fā)明的發(fā)明人通過深入研究和實踐，以最大限度減少因秸稈還田造成的不利影響為立足點，充分利用還田秸稈，快速壯大有益菌種群，達到控制作物土傳病害的目的。發(fā)明人通過對有關(guān)作物的試驗，研究開發(fā)出了適應(yīng)小麥玉米秸稈還Fi的土傳病害生防菌劑，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明目的是提供種適用于小麥玉米秸稈還田地塊，既能有效控制作物土傳病害，又能加速秸稈分解的牛:防菌劑。本發(fā)明的另一個目的是提供該生防菌劑的制備方法。本發(fā)明的發(fā)明人分別從河北、遼寧、江蘇、山東、河南等地采集小麥、玉米秸稈還田土樣50份，土壤取自10-20cm土層。經(jīng)選擇性培養(yǎng)和分離純化，得到土傳病菌拮抗菌株3250株，按照同時達到對全蝕病菌抑菌率大于90%、根(莖基)腐病菌抑菌率大于80%，紋枯病菌抑菌率大于80%的標(biāo)準(zhǔn)，初步確定了79個菌株。進一歩采用秸稈粉失重法對拮抗作用強的菌株進行復(fù)篩，并測定了秸稈分解率和菌株增殖率。最終得到細菌菌株B1514，對全蝕病菌、紋枯病菌、根腐病菌、莖基腐病菌抑制率分別達到95.00%、80.53%、90.81%、92.45%;實驗室測試24h4對小麥、玉米秸稈的分解率分別為19.12%和10.79%，并對秸稈有很強的適應(yīng)能力，菌株增殖率為14.6-18.2倍。經(jīng)菌落形態(tài)、革蘭氏染色和芽孢染色等形態(tài)學(xué)鑒定及比較16SrDNA序列的分子鑒定，菌株B1514為芽孢桿菌(fec/WiASsp.)。該菌株己于2008年11月20日送至CGMCC(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所)保存，保存編號為No.2752。本發(fā)明的發(fā)明人綜合考慮培養(yǎng)基成本和培養(yǎng)基成分獲得的難易度，同時參考文獻和傳統(tǒng)固體發(fā)酵的經(jīng)驗培養(yǎng)基，經(jīng)過大量試驗，得到菌株B1514最優(yōu)固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下1、采用玉米秸稈粉，麥麩，玉米粉為固體原料，各組分最優(yōu)用量(按重量)為秸稈粉4份、麥麩3份、玉米粉2份。2、營養(yǎng)液與固體原料比例為2:1(容積重量)。營養(yǎng)液配方為葡萄糖10g，MgS(Xlg，CaCl2lg,(NH4)2S(X15g，蒸餾水lOOOmL。3、固體發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)pH值為8。本發(fā)明生防菌劑的生產(chǎn)工藝流程見說明書附圖。本發(fā)明的重要特點是本生防菌劑非常適應(yīng)小麥玉米秸稈還田地塊，施入秸稈還田土壤后在快速分解秸稈的同吋，能利用分解秸稈產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)穩(wěn)定定植和快速增殖，短時間內(nèi)在土壤中形成優(yōu)勢菌群，通過群體優(yōu)勢實現(xiàn)對土傳病害的有效控制。本發(fā)明產(chǎn)品的另一個特點是有利于改善秸稈還田地塊的土壤性狀，對作物無殘留，對環(huán)境無污染，對人畜安全，成本低，施用方便。本發(fā)明中生防菌劑對小麥玉米主要七傳病害的控制效果，通過以下試驗結(jié)果加以說明試驗例1:本發(fā)明的生防菌劑用于玉米秸稈還田后控制冬小麥土傳病害試驗試驗作物冬小麥(品種為石麥14)地點河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)林教學(xué)基地試驗田試驗設(shè)計1、小區(qū)設(shè)置每小區(qū)面積33.3m2。小區(qū)之間用雙層油氈隔開，油氈埋深50cm，玉米秸稈還田量為7500kg/hm2,秸稈粉碎后均勻翻埋至30cm深土層。2、土傳病害防治效果測定5采用人工接種病原菌，菌種分別為3種小麥土傳病原菌(未谷絲核菌i^i加"W7/""""fcVanderHoeven、禾頂囊殼小麥變禾中Gaewra""o附y(tǒng)cesgra/n/ra、va"n力'cZ、平擠螺抱菌B/po/on'srarofo'w'a"a(Sacc.)Shoem.)，小麥播種前將本發(fā)明的生防菌劑與還田玉米秸稈一起均勻翻埋至耕層土壤。以只接種3種病原菌地塊為對照，隨機區(qū)組設(shè)計，每處理4次重復(fù)。分別于拔節(jié)期和灌漿中期在每小區(qū)5點取樣，每點調(diào)查20株小麥發(fā)病情況，計算病情指數(shù)、防效(見表1)。于小麥成熟期測定不同處理產(chǎn)量(見表2)。3、田間分解秸稈能力測定將粉碎的玉米秸稈經(jīng)8(TC烘干48h。稱取100g均勻拌入土壤后裝入網(wǎng)袋，埋于不同處理0-20cm土層，每小區(qū)埋7袋。小麥生長季収樣4次，玉米生長季取樣3次，每次每小區(qū)取1袋，采用烘干法測定秸稈殘留量，計算玉米秸稈分解率(見表3)。4、菌株B1514田間增殖情況測定在小麥生長期內(nèi)在不同處理小區(qū)，采用5點取樣，從5-20cm土層取土。用選擇性培養(yǎng)基和稀釋平板法分離菌株B1514，計數(shù)并計算菌株增殖率(見表4)。試驗結(jié)果本發(fā)明的生防菌劑對全蝕病、紋枯病和根腐病的防治效果為68.04%-79.98%。經(jīng)菌劑處理地塊與對照相比產(chǎn)量明顯增加，全蝕病地塊、紋枯病地塊和根腐病地塊用菌劑處理后產(chǎn)量損失分別減少11.7%、9.40%和10,35%。本發(fā)明生防菌劑可以顯著提高的玉米秸稈還田后的分解速度，用生防菌劑處理地塊小麥全生育期玉米秸稈分解率比對照地塊分別提高了18.94%、20.89°/。和16.29%。在小麥全生育期，不同處理中菌株B1514增殖率均在350倍以上，說明菌株B1514能充分利用分解秸稈產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)快速繁殖。表1生防菌劑對小麥土傳病害的田間防治效果生育期處理全蝕病紋枯病根腐病病情指數(shù)防效病情指數(shù)防效(％)病情指數(shù)防效(％)拔節(jié)期菌劑處理3.9073.112.0364.6010.3663.24對照14.23-28.40-28.19-灌漿中期菌劑處理5.2479.988.6368.048.2070.52對照26.19-26.99-27.81—6表2生防菌劑對小麥產(chǎn)量的影響地塊處理穗數(shù)穗粒數(shù)小麥千粒重理論產(chǎn)呈折實產(chǎn)量減損率(萬穗z公頃)(個)(克)(公斤/公頃)(公斤/公頃)(%)紋枯病地塊齒劑處理708.1134.8141.4210198.808668.959.40對照612.0033.5844.819201.757821.45一根腐病地塊齒劑處理643.7435.5143.319889.958406.4510.35對照638.563丄8239.598793.007474.05-全蝕病地塊菌劑處理652.9135.8241.629724.058265.4511.70對照630.3435.0538.448484.457211.85一正常地塊未處理720.8136.6840.0810598.259008.55-*注正常地塊未進行任何處理。減損率=(B1514處理折實產(chǎn)量-對照折實產(chǎn)量)/正常地塊實際產(chǎn)量表3生防菌劑對玉米秸稈的分解率地塊處理不同時期玉米秸稈分解率(％)今生育期玉米播種至越冬期返青期至拔節(jié)期至秸桿分解率冬前拔節(jié)期成熟期(%)紋枯病地塊菌劑處理11.973.8811.7614.7742.38對照6.722.325.936.5221.49根腐病地塊菌劑處理12.723.8710.8716.0643.52對照5.952.616.479.5524.58全蝕病地塊菌劑處理12.563.0212.3611.卵39.93對照6.832.057.437.3323.64表4不同時期菌株B1514的增殖率地塊__不同時期菌株增殖率(倍)_小麥全生育期描種至冬前期越冬期返青期至拔節(jié)期拔'l期至成熟朋菌株增殖率(倍)紋枯病地塊102.3827.46112.20122.36364.40根腐病地塊98.9619.82103.34132.46354.58全蝕病地塊104.■8832.49110.02128.94376.337本發(fā)明生防菌劑用于小麥秸稈覆蓋還田、免耕播種玉米地塊控制土傳病害的試驗試驗作物玉米(鄭單958)地點河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)林教學(xué)基地試驗ffl試驗設(shè)計1、小區(qū)設(shè)置在試驗例1的小區(qū)內(nèi)繼續(xù)播種玉米。上茬冬小麥秸稈全量均勻覆蓋還ffl。2、土傳病害防治效果測定病原菌采用人工接種方法，菌種為玉米紋枯病、莖基腐病的病原菌(未谷絲核菌7/w'zcic/:on/aceres//,1VanderHoeven、禾谷鐮刀菌F〃,？ari〃fflgra/s/nesi""/)。生防菌齊U于玉米出苗后丌溝施入行間。以只接種2種病原菌地塊為對照。于玉米成熟期在小區(qū)五點取樣，調(diào)査植株發(fā)病情況，計算病情指數(shù)、防效，并測定產(chǎn)暈，結(jié)果見表5。3、m問分解秸稈能力測定將粉碎的小麥秸稈經(jīng)過8(TC烘干48h。準(zhǔn)確稱取100g裝入網(wǎng)袋，埋于不同處理5-20cm土層，每小區(qū)埋3袋。玉米生長季取樣3次，每次每小區(qū)取1袋，同時取試驗例1中埋設(shè)的玉米秸稈1袋，測定小麥、玉米秸稈分解率。測定力'法同時試驗例l，結(jié)果見表6。4、菌株B1514田間增殖情況測定測定方法同試驗例l，結(jié)果見表7。試驗結(jié)果本發(fā)明生防菌劑對玉米紋枯病和莖基腐病防效均達到70%以上。經(jīng)菌劑處理地塊與對照相比產(chǎn)量明顯增加，紋枯病、莖基腐病地塊減損率分別為29.2%、35.2%。用生防菌劑處理地塊小麥秸稈分解率提高了23.13%和25.68%，玉米秸稈全年分解率達到了93.01%和93.73%，分別比對照提高了47.44%和48.27%。在玉米全生育期不同處理地塊中菌株B1514增殖率均在700倍以上。8表5生防菌劑對玉米土傳病害的田間防治效果和減少產(chǎn)量損失效果處理紋枯病地塊莖基腐病地塊<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*注正常地塊未進行任何處理，實收產(chǎn)量為8758.95公斤/公頃。減損率=(B1514處理實收產(chǎn)量-對照實收產(chǎn)量)/正常地塊實收產(chǎn)量。表6生防菌劑處理后不同時期小麥、玉米秸稈的分解率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表7生防菌劑處理地塊中不同時期菌株B1514的增殖率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>附圖是本發(fā)明生防菌劑的生產(chǎn)工藝流程圖具體實施例方式通過以下實施例進一步闡述本發(fā)明生物制劑的生產(chǎn)工藝流程(見附圖)。將玉米秸稈烘干，經(jīng)機器粉碎至粉末狀，加入固定比例(重量比)的麥麩和玉米粉(秸稈粉:麥鼓玉米粉=4:3:2),再加入營養(yǎng)液(葡萄糖10g，MgS04lg，CaCl2lg，(NH4)2S0415g，蒸餾水1000mL)充分攪拌均勻，使含水量達到200%(容積重量)。裝袋后，經(jīng)高壓濕熱滅菌(12rC滅菌60min)，制成無菌固體培養(yǎng)料。將B1514原菌種活化，LB培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)，28'C培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，每培養(yǎng)皿加入5ml無菌水，涂勻，制成菌懸液，按2W接種量接入液體LB培養(yǎng)基，進行搖床培養(yǎng),200rpm培養(yǎng)24h即成接種液。將制好的接種液接入pH為8的無菌固體培養(yǎng)料中，接種量為15%(容積重量)。固體培養(yǎng)料接種后放入發(fā)酵室，28'C培養(yǎng)，經(jīng)檢驗每克固體培養(yǎng)料中菌株B1514數(shù)量達到2X108個的菌劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，包裝標(biāo)記得本發(fā)明菌劑成品。10權(quán)利要求1、一種適用于小麥玉米秸稈還田地塊，既能有效控制小麥玉米土傳病害，又能加速小麥玉米秸稈分解的生防菌劑及其制備方法，其特征是包括菌株B1514，菌株B1514固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，固體發(fā)酵工藝。2、權(quán)利要求1所述多功能生防菌B1514為芽孢桿菌屬細菌(Baa7/wsp.)。3、權(quán)利要求l所述生防菌劑所用最優(yōu)固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下采用玉米秸稈粉，麥麩，玉米粉為固體原料，各組分最優(yōu)用量(按重量)為秸稈粉4份、麥麩3份、玉米粉2份；營養(yǎng)液與固體原料比例為2:1(容積重量)，營養(yǎng)液配方為葡萄糖10g，MgS04lg，CaCl2lg，(NH4)2S0415g，蒸餾水lOOOmL;固體發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)pH值為8。4、權(quán)利要求1所述固體發(fā)酵工藝特點為將玉米秸稈烘干，經(jīng)機器粉碎至粉末狀，加入麥麩和玉米粉，攪拌均勻，加入營養(yǎng)液再次充分混勻；再裝袋，送入高溫滅菌(12rC滅菌60min)，制成無菌固體培養(yǎng)料；將配制好的接種液接入無菌固體培養(yǎng)料中，接種量為15%(容積重量)；固體培養(yǎng)料接種后送入培養(yǎng)室，28'C下培養(yǎng)，經(jīng)檢驗每克固體培養(yǎng)料中菌株B1514數(shù)量達到2X108個的菌劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，包裝標(biāo)記得本發(fā)明菌劑成品。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生防菌劑防治小麥玉米秸稈還田地塊的小麥根腐病、小麥全蝕病、小麥紋枯病、玉米紋枯病和玉米莖基腐病的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種適應(yīng)小麥玉米秸稈還田的土傳病害生防菌劑及其制備方法。目前秸稈還田地塊土傳病害發(fā)生呈加重趨勢，并且秸稈還田后耕作質(zhì)量受到嚴重影響。本發(fā)明生防菌劑充分解決了以上問題，具有較強的分解秸稈和土傳病害防治特性，施入到秸稈還田地塊后，能夠在短時間內(nèi)快速分解秸稈，能充分利用分解秸稈產(chǎn)生的營養(yǎng)快速繁殖，在土壤中形成優(yōu)勢菌群，充分利用群體優(yōu)勢抑制土傳病原菌。達到了既加速秸稈分解、改善土壤性狀，促進生防菌在土壤中的定植和增殖，又能最大限度預(yù)防和控制土傳病害發(fā)生的目的。適用于防治小麥根腐病、小麥全蝕病、小麥紋枯病、玉米紋枯病和玉米莖基腐病等土傳病害。文檔編號A01N63/00GK101485333SQ200810180290公開日2009年7月22日申請日期2008年12月4日優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日發(fā)明者張承胤,梁春啟,甄文超,趙緒生,馬峙英申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)