一種預(yù)測(cè)小麥苗期紋枯病抗性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小麥植物保護(hù)和育種領(lǐng)域，特別是一種預(yù)測(cè)小麥苗期紋枯病抗性的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥紋枯?。╓heat sharp eyespot)主要由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis Vander hoeven)引起，是危害性較大的世界性土傳真菌小麥病害（Hamada MS，Yin YN，Chen HG, Ma Z. The escalating threat of Rhizoctonia cereal is, the causal agent of sharp eyespot in wheat.《Pest Managgment Science》，2011，67:P. 1411-1419)，現(xiàn)已成為我國(guó) 長(zhǎng)江流域的主要病害，并逐漸蔓延到黃淮麥區(qū)，每年造成小麥產(chǎn)量損失嚴(yán)重。
[0003] 培育和使用紋枯病抗性品種無(wú)疑是控制該病害最有效和最經(jīng)濟(jì)的途徑，其中最為 關(guān)鍵的是小紋枯病抗性鑒定方法的建立，目前，報(bào)道的小麥紋枯病抗性鑒定方法多樣，鑒定 標(biāo)準(zhǔn)不一，主要分為自然病圃鑒定和人工接種鑒定，人工接種鑒定根據(jù)接種方法的不同，又 有玉米砂混法、菌絲外貼法、嵌入法、土表接種法和溝帶接種法。這些鑒定方法由于受環(huán)境 影響較大，并且采用的接種菌株不同，病害調(diào)查和采樣方法也不一致，因而病害鑒定結(jié)果存 在差異，一定程度影響了對(duì)小麥材料抗性評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。另外，小麥根部和莖基部其他病 害，如小麥根腐病、小麥全蝕病以及小麥莖腐病等，由于與紋枯病早期病癥相似，也對(duì)小麥 紋枯病抗性的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)造成干擾。因此，建立準(zhǔn)確、穩(wěn)定和可靠的小麥苗期紋枯病抗性鑒定 方法非常必要。
[0004] 小麥的一生中，紋枯病發(fā)生呈"S"型曲線，兩個(gè)發(fā)病高峰分別在苗期和拔節(jié)孕穗期 (《中國(guó)小麥紋枯病的研宄現(xiàn)狀與展望》，張會(huì)云等，麥類作物學(xué)報(bào)，2007)，苗期主要造成爛 芽和病苗死苗，拔節(jié)孕穗期主要造成花桿爛莖，直至枯白穗（《小麥紋枯病的研宄進(jìn)展（綜 述）》，檀根甲等，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998)，研宄發(fā)現(xiàn)，小麥產(chǎn)量損失與紋枯病病情嚴(yán)重度 呈顯著線性相關(guān)，嚴(yán)重度每提高一級(jí)，產(chǎn)量損失增加約10-20%左右。始病愈早，發(fā)病愈重， 相應(yīng)的產(chǎn)量損失愈大。孕穗期以前發(fā)病，產(chǎn)量損失25-40%，始穗后發(fā)病，產(chǎn)量損失一般小于 20% (《中國(guó)小麥紋枯病的研宄現(xiàn)狀與展望》，張會(huì)云等，麥類作物學(xué)報(bào)，2007)，然而目前的 抗性鑒定方法多針對(duì)拔節(jié)孕穗期的小麥，對(duì)苗期的抗性和鑒定方法重視不夠。目前，只有專 利號(hào)為：201110234958. 3,發(fā)明名稱為"小麥幼苗的紋枯病抗性鑒定方法"的中國(guó)專利公開 了一種小麥幼苗的紋枯病抗性鑒定方法，但該鑒定方法使用目測(cè)病癥的鑒定方法，需要鑒 定者具有一定的紋枯病鑒定經(jīng)驗(yàn)，難以消除小麥根部和莖基部其他病害的病癥干擾，預(yù)測(cè) 結(jié)果難以排除人為影響，難以做到統(tǒng)一、客觀；專利號(hào)為：200810196380. 5,發(fā)明名稱"小麥 紋枯病抗性苗期鑒定的方法"的中國(guó)專利，雖然名稱是苗期鑒定，實(shí)際鑒定的是拔節(jié)孕穗期 的紋枯病抗性，因此，如何通過(guò)建立規(guī)范的儀器定量測(cè)定方法預(yù)測(cè)小麥苗期的紋枯病抗性 一直是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)難題。
[0005] 實(shí)時(shí)焚光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以 熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，其通過(guò)在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利 用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行總量分析或通 過(guò)CP值對(duì)模板進(jìn)行相對(duì)定量分析，與普通PCR相比，其特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，目前，該技 術(shù)已經(jīng)成功運(yùn)用于土壤中紋枯病菌DNA的定量檢測(cè)（Guo Y, Li W, Sun H, Wang N, Yu H, Chen H. Detection and quantification of Rhizoctonia cerealis in soil using real-time PCR.《J Gen Plant Pathol》，2012, 78:P. 247-254)。然而，小麥莖桿中紋枯病菌的DNA含 量與小麥自身的紋枯病抗性的關(guān)系尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，也未見將熒光定量PCR應(yīng)用于預(yù)測(cè)小 麥苗期紋枯病抗性的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種通過(guò)對(duì)苗期小麥基部莖桿禾谷絲核菌DNA含量的 PCR定量測(cè)定，預(yù)測(cè)小麥幼苗紋枯病抗性的方法，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種預(yù)測(cè)小麥苗期紋枯病抗性的方法，其特征在于，取待測(cè)小麥幼苗基部包括葉 鞘的莖桿lcm，稱重并提取DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，再通過(guò)公式計(jì)算小麥基部莖桿禾 谷絲核菌的DNA含量，以淮麥18作為對(duì)照，預(yù)測(cè)小麥苗期紋枯病抗性，具體步驟如下：
[0008] A)將待測(cè)小麥品種或品系的麥粒于20°C浸種、使麥粒萌發(fā)4-6mm的幼芽，將萌發(fā) 幼芽的麥粒置于20°C的禾谷絲核菌菌絲懸浮液中浸泡5min接種；接種后繼續(xù)培養(yǎng)12d ;
[0009] B)取待測(cè)小麥幼苗基部包括葉鞘的1cm莖桿，稱重，記為A，單位為mg ;以CTAB法 提取莖桿總DNA，將濃度調(diào)整為25ng/ y L,作為待測(cè)DNA樣品，體積記為B，單位為y L ;
[0010] C)以步驟B獲得的待測(cè)DNA樣品為模板，以SEQ. IDN0:1為正向引物，SEQ. IDN0:2 為反向引物，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，獲得CP值；重復(fù)再檢測(cè)兩次，獲得三次檢測(cè)的CP平均 值C ;
[0011] D)根據(jù)公式E = [BX10(31K)/3_562]/A計(jì)算待檢測(cè)小麥幼苗基部莖桿禾谷絲核菌 的DNA含量E ;
[0012] E)以上述相同的A-D步驟獲得對(duì)照樣品淮麥18幼苗的基部莖桿禾谷絲核菌的 DNA含量E 1;
[0013] F)通過(guò)E和Ei的比值來(lái)預(yù)測(cè)小麥幼苗期的紋枯病抗性，若E > E ' 130%，則待 測(cè)小麥品種或品系為感??；若E < EiXSO%，則待測(cè)小麥品種或品系為抗病；gEiXSO% < E < EiXUO%，則待測(cè)小麥品種或品系為中抗。
[0014] 進(jìn)一步，本發(fā)明中，步驟C熒光定量PCR檢測(cè)反應(yīng)體系為：2XSYBR@ PremixExTaq?5yL，5yM正向引物和反向引物各1 yL，模板DNA3yL ;反應(yīng)步驟為：95°C預(yù) 變性30s ;95°C變性5s，60°C退火10s，72°C延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：對(duì)小麥幼苗的紋枯病抗性鑒定不受生長(zhǎng)季節(jié)的限制，隨時(shí)可 以進(jìn)行；鑒定在室內(nèi)控溫控濕的條件下進(jìn)行，減少了環(huán)境條件對(duì)紋枯病抗性鑒定結(jié)果的影 響；相對(duì)于現(xiàn)有人工目測(cè)的鑒定方式，本發(fā)明采用鑒定采用儀器定量測(cè)定，減少了人為目測(cè) 誤差的影響，同時(shí)鑒定不受根部以及莖基部其他病害的干擾，結(jié)果更準(zhǔn)確。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例涉及的核苷酸序列：
[0018] SEQ ID NO:15, -CCTAAATGAGTCTGGAGTAAGTC-3,；
[0019] SEQ ID NO:25' -GCTAGTGCGGTCAATGTATAG-3'；
[0020] 實(shí)施例中所涉及材料：
[0021] 寧麥13由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；
[0022] 淮麥18由江蘇省徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研宄所提供，其審定編號(hào)為國(guó)審麥 2001005；
[0023] 紋枯病菌采用致病力強(qiáng)的禾谷絲核菌R0301由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研宄 所麥類病害室提供，該菌株已在《不同施肥處理對(duì)小麥紋枯病發(fā)生及根際微生物的影響》 (熊桂林等，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008, 24(4) : 414-418)中公開；
[0024] SYBROGreenl試劑由寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；
[0025] 熒光定量PCR儀由Roche生產(chǎn)。
[0026] 實(shí)施例中禾谷絲核菌R0301懸浮液制備方法、小麥的培養(yǎng)方法以及PDA培養(yǎng)基的 制備方法，均參照Z(yǔ)L201110234958. 3中所公開的方法。
[0027] 實(shí)施例1小麥基部莖桿禾谷絲核菌DNA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和應(yīng)用
[0028] 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0029] (a)未感染禾谷絲核菌小麥寧麥13麥粒于20°C浸種、萌發(fā)并培養(yǎng)15天，取其幼苗 基部包括葉鞘的莖桿lcm，采用常規(guī)CTAB法提取其總DNA，將其濃度調(diào)整為50ng/ y L;
[0030] (b)取PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的禾谷絲核菌R0301的菌絲，采用常規(guī)CTAB法提取其總 DNA，將其濃度調(diào)整為8ng/ y L;
[0031] (c)將提取的禾谷絲核菌DNA按濃度梯度分別摻入小麥寧麥13DNA溶液中，使混 合溶液中小麥寧麥13DNA終濃度為25ng/ y L、紋枯病菌DNA最終濃度分別為40000、4000、 400、40、4pg/y L;
[0032] (d)以上步獲得混合DNA為模板，采用SYBROGreenl試劑以及正向引物SEQ ID NO: 1和反向引物SEQ ID NO: 2,在熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)：
[0033] 反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積10 y L，包括2 X SYBR@PremixExTaq?5 yL，5yM正反向引物 各