專利名稱：小麥紋枯病抗性苗期鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥紋枯病抗性的鑒定的方法，尤其是在環(huán)境可控條件下，通過在苗期對小麥品種或品系的小麥紋枯病抗性鑒定，快速有效地篩選小麥紋枯病抗源，提高小麥抗紋枯病育種的效率。本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
小麥紋枯病，又稱小麥尖眼點(diǎn)病(wheat sharp eyespot)，是由絲核菌中Rhizactonia cerealis或Rhizactonia solani所引起的一種土傳真菌病害(陳延熙，1986；夏正俊，1989)，幾乎遍及世界各小麥種植區(qū)。亞洲、歐洲、美洲、澳洲等10余個(gè)國家均有小麥紋枯病發(fā)生和危害的報(bào)道(Glynne，1934；Polley，1991；Pasquini，1996；Zoltanska，1997；周凱南，1982；陳世云，1992)，部分國家和地區(qū)的危害已較為嚴(yán)重(Richardson，1985；趙美琦，1997)。中國是小麥紋枯病發(fā)生和危害較為嚴(yán)重的國家，但在1975年，小麥紋枯病再次被認(rèn)識(shí)前(陳炳章，1975)，并未受到重視。近年來，由于耕作制度和氣候的變化，加上感病品種大面積使用和紋枯病菌累積，危害面積迅速擴(kuò)大，1992年發(fā)病面積達(dá)3.6×106hm2，約占全國麥播面積的1/8，2005年發(fā)病面積約為8.051×106hm2，占全國小麥種植面積的1/3以上(2005年中國農(nóng)業(yè)年鑒)。由此可見紋枯病已成為中國小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙之一。
篩選紋枯病抗源，選育和使用抗紋枯病小麥新品種無疑是解決這一問題最有效、最經(jīng)濟(jì)的途徑。而簡便有效的小麥紋枯病抗性鑒定技術(shù)體系的建立是進(jìn)行紋枯病抗病育種和分子遺傳研究的關(guān)鍵。由于紋枯病是一種土傳病害，因而容易受到環(huán)境影響。目前，對小麥紋枯病抗性鑒定，主要在成株期進(jìn)行，有自然病圃鑒定和人工接菌鑒定兩種。人工接菌鑒定法有牙簽接種法、表土接種法、播種溝撒病麥粒法三種。一般認(rèn)為牙簽接種法較后二種方法受環(huán)境影響小，發(fā)病率高，重復(fù)性好(顏偉，2007)。但目前的成株期小麥紋枯病抗性鑒定尚不能排除環(huán)境影響，且存在評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，鑒定時(shí)間長、工作量大等問題。紋枯病抗性的苗期鑒定目前應(yīng)用還不多，且結(jié)論不一。檀根甲(1998)在大田苗期紋枯病抗性鑒定中，各品種間也無感病差異，認(rèn)為不能在苗期對紋枯病抗性進(jìn)行鑒定。岳紅賓(1995)采用Lipps(1982)的病害評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對12個(gè)小麥品種進(jìn)行苗期人工接菌鑒定紋枯病抗性鑒定，結(jié)果顯示小麥品種間抗性有明顯差異，但是由于沒有成株期抗性鑒定數(shù)據(jù)，還不能認(rèn)為在苗期鑒定紋枯病抗性是可行的。陳厚德(2002)用一個(gè)小麥品種揚(yáng)麥158分別于小麥苗期和成株期，比較了兩種不同的小麥紋枯病菌接種方法的效果，結(jié)果表明，利用嵌入法接種的效果明顯優(yōu)于外貼法，但由于病害評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等問題，揚(yáng)麥158苗期和成株期的病情指數(shù)差異顯著(苗期，54.67％，成株期16.70％)，還不能用苗期鑒定代替成株期抗性鑒定。因此在苗期紋枯病抗性鑒定中，迫切需要開發(fā)、建立一套簡便、合理、有效的小麥紋枯病抗性苗期鑒定技術(shù)體系，在環(huán)境可控條件下，用同一種強(qiáng)致病菌株，合適的接種方法、合理的病情評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究品種抗性差異，為快速高效的紋枯病抗病育種奠定基礎(chǔ)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前小麥紋枯病抗性鑒定存在的容易受到環(huán)境影響，且評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，鑒定時(shí)間長、工作量大，以及目前使用的枯病病原菌不同及致病力有差異等一系列問題，提供一種新的小麥紋枯病抗性苗期鑒定的體系。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種小麥紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征在于 a)將小麥紋枯病菌(Rhizactonia cerealis)菌種在超凈工作臺(tái)上于PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，獲得菌絲。
b)將牙簽對折后直立整齊放入盒體中，浸泡24小時(shí)，將溶化的PDA固體培養(yǎng)基加入盒體使其將牙簽1/4處浸沒；常規(guī)高壓蒸氣滅菌后，將事先在平皿中培養(yǎng)好的小麥紋枯病菌菌株無菌操作移入含牙簽的PDA固體培養(yǎng)基中，再放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿牙簽后形成有菌牙簽備用； c)將待鑒定的小麥品種或品系的種子在培養(yǎng)皿中于25℃下萌發(fā)后播種于20cm營養(yǎng)缽中生長，每個(gè)營養(yǎng)缽中播種10～15粒種子，生長期溫度保持晝20～25℃，夜10～15℃； d)播種后30天，用消毒鑷子夾取有菌牙簽輕輕地嵌入麥苗莖桿與葉鞘內(nèi)，每個(gè)葉鞘嵌入一個(gè)有菌牙簽，接種處纏繞浸濕的醫(yī)用脫脂棉球，并用雙層遮陽網(wǎng)覆蓋，通過彌霧器使接種幼苗在近100％飽和的相對濕度下48h，然后去除遮陽網(wǎng)，幼苗正常生長管理，每天噴水一次； e)在接種后30d，對苗期單株小麥材料進(jìn)行紋枯病病害等級(jí)鑒定； f)根據(jù)病害評(píng)價(jià)等級(jí)計(jì)算病情指數(shù)，免疫的指數(shù)為0；高抗HR的指數(shù)為＜20％；抗R的指數(shù)為20.01～40.0％；中抗MR的指數(shù)為40.01～50.0％；中感MS的指數(shù)為50.01～60.0％；感S的指數(shù)為60.01～80.0％；高感HS的指數(shù)為80.01-100.0％。
在本發(fā)明中將待鑒定的小麥品種或品系的種子按照步驟c)～步驟f)至少再進(jìn)行一次重復(fù)鑒定，將分次鑒定的病情指數(shù)的平均值作為該小麥品種或品系的最終鑒定的病情指數(shù)。
在本發(fā)明中步驟1)中將小麥紋枯病菌(Rhizactonia cerealis)菌種在超凈工作臺(tái)上于PDA固體培養(yǎng)基的活化培養(yǎng)期為7天。
在本發(fā)明中所述的小麥紋枯病病害評(píng)價(jià)等級(jí)為0～5級(jí)，其中0級(jí)外層葉鞘無病斑；1級(jí)外層葉鞘有病斑；2級(jí)第二、第三葉鞘有病斑；3級(jí)第四、第五葉鞘有病斑；4級(jí)莖干上有病斑；5級(jí)整株枯死。
在本發(fā)明中計(jì)算病情指數(shù)的公式是
式中0、1、2、…5分別表示相應(yīng)病害等級(jí)； X0、X1、…X5分別表示對應(yīng)病害評(píng)價(jià)等級(jí)的小麥植株數(shù)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用同一個(gè)小麥紋枯病菌(Rhizactonia cerealis)菌株作為病原菌，消除病原菌致病力的差異；在環(huán)境可控條件下，通過在苗期對小麥品種或品系進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，可以快速鑒定篩選小麥抗紋枯病資源，提高小麥資源利用效率；本方法鑒定周期相對較短，工作量小，且不受到環(huán)境影響。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 紋枯病病原菌由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供的小麥紋枯病菌(Rhizactonia cerealis)菌種，菌種的植物保護(hù)研究所自編號(hào)為菌種R0301(下同)。
將菌種R0301在超凈工作臺(tái)上于PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，7天后待用。
將市場處購的牙簽對折后直立整齊放入盒體中，浸泡24小時(shí)，將溶化的PDA固體培養(yǎng)基加入盒體使其將牙簽1/4處浸沒；常規(guī)高壓蒸氣滅菌后，將事先在平皿中培養(yǎng)好的小麥紋枯病菌菌株無菌操作移入含牙簽的PDA固體培養(yǎng)基中，再放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿牙簽后形成有菌牙簽備用。
實(shí)施例2 被鑒定品種CI12633，從美國引進(jìn)，由江蘇省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所提供。
有菌牙簽通過實(shí)施例1獲得。
將小麥CI12633的種子在培養(yǎng)皿中于25℃下萌發(fā)后播種于20cm營養(yǎng)缽中生長，每個(gè)營養(yǎng)缽中播種14粒種子，生長期溫度保持晝20～25℃，夜10～15℃。
播種后30天，用消毒鑷子夾取有菌牙簽輕輕地嵌入麥苗莖桿與葉鞘內(nèi)，每個(gè)葉鞘嵌入一個(gè)有菌牙簽，接種處纏繞浸濕的醫(yī)用脫脂棉球，并用雙層遮陽網(wǎng)覆蓋，通過彌霧器使接種幼苗在近100％飽和的相對濕度下48h，然后去除遮陽網(wǎng)，幼苗正常生長管理，每天噴水一次； 在接種后30天，對苗期單株小麥材料進(jìn)行紋枯病病害等級(jí)鑒定，鑒定標(biāo)準(zhǔn)0級(jí)外層葉鞘無病斑；1級(jí)外層葉鞘有病斑；2級(jí)第二、第三葉鞘有病斑；3級(jí)第四、第五葉鞘有病斑；4級(jí)莖干上有病斑；5級(jí)整株枯死。單株小麥材料結(jié)果0級(jí)0株；1級(jí)0株；2級(jí)14株；3級(jí)0株；4級(jí)0株；5級(jí)0株。
根據(jù)公式
計(jì)算獲得小麥CI12633的病情指數(shù)為40.00。由于病情指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)是免疫的指數(shù)為0；高抗(HR)的指數(shù)為＜20％；抗(R)的指數(shù)為20.01-40.0％；中抗(MR)的指數(shù)為40.01-50.0％；中感(MS)的指數(shù)為50.01-60.0％；感(S)的指數(shù)為60.01-80.0％；高感(HS)的指數(shù)為80.01-100.0％，由此可見，病情指數(shù)為抗R。
重復(fù)上述過程，進(jìn)行第二次鑒定，獲得小麥CI12633的病情指數(shù)為46.81，根據(jù)病情指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)，病情指數(shù)為中抗MR。
將兩次鑒定的病情指數(shù)求平均，獲得小麥CI12633的鑒定病情指數(shù)43.41，屬于中抗。
實(shí)施例3 利用實(shí)施例1獲得的有菌牙簽，采用與實(shí)施例2相同的鑒定方法，對ARz、紅蚰子、紫桿子、Cooker983、麗麥16、華麥8號(hào)、揚(yáng)麥158、鎮(zhèn)74-95、野貓等九種小麥品種進(jìn)行紋枯病抗性苗期鑒定，鑒定結(jié)果記載于表1中。所述九種小麥品種均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。
實(shí)施例4 將小麥CI12633、小麥ARz、紅蚰子、紫桿子、Cooker983、麗麥16、華麥8號(hào)、揚(yáng)麥158、鎮(zhèn)74-95、野貓等十種小麥品種采用菌種R0301進(jìn)行成株期抗病鑒定，鑒定方法為 有菌牙簽的培養(yǎng)同實(shí)施例1，在小麥拔節(jié)期接種，用消毒鑷子夾取有菌的牙簽，輕輕地嵌入麥苗莖桿與葉鞘內(nèi)，每個(gè)葉鞘嵌入一個(gè)有菌牙簽，每個(gè)株系接種10～15個(gè)單株。在小麥乳熟期調(diào)查病級(jí)數(shù)，然后計(jì)算病情指數(shù)。
成期小麥紋枯病病級(jí)也分為0～5級(jí)，其中0級(jí)無?。?級(jí)葉鞘發(fā)病但不侵莖；2級(jí)病菌侵莖，病斑環(huán)莖不超過1/4；3級(jí)莖稈上病斑環(huán)莖1/4～2/4；4級(jí)病斑繞莖1/2～3/4；5級(jí)病斑繞莖3/4以上獲形成枯孕穗或白穗。
以病情指數(shù)作為病害評(píng)價(jià)指標(biāo)。

式中X0，X1，…，X5分別代表0，1，…，5級(jí)的植株數(shù)。病情指數(shù)為0為免疫；病情指數(shù)≤20％為高抗HR；病情指數(shù)20.01～40.0％為抗R；病情指數(shù)40.01～50.0％為中抗MR；病情指數(shù)50.01～60.0％為中感MS；病情指數(shù)60.01～80.0％為感S；病情指數(shù)80.01～100.0％為高感HS。
為了便于與紋枯病抗性苗期鑒定進(jìn)行比較，成株期鑒定的結(jié)果也記載在于表1中。
由表1可見，紋枯病抗性苗期鑒定與成株期鑒定的結(jié)果基本一致，證明通過紋枯病抗性苗期鑒定完全可以判斷被測小麥品種或品系的紋枯病抗性。
表110個(gè)小麥品種或品系苗期紋枯病抗件鑒定結(jié)果
以上各實(shí)施例不是對本發(fā)明的具體限制。
權(quán)利要求
1、一種小麥紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征在于
a)將小麥紋枯病菌(Rhizactonia cerealis)菌種在超凈工作臺(tái)上于PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，獲得菌絲待用。
b)將牙簽對折后直立整齊放入盒體中，浸泡24小時(shí)，將溶化的PDA固體培養(yǎng)基加入盒體使其將牙簽1/4處浸沒；常規(guī)高壓蒸氣滅菌后，將事先在平皿中培養(yǎng)好的小麥紋枯病菌菌株無菌操作移入含牙簽的PDA固體培養(yǎng)基中，再放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌絲長滿牙簽后形成有菌牙簽備用；
c)將待鑒定的小麥品種或品系的種子在培養(yǎng)皿中于25℃下萌發(fā)后播種于20cm營養(yǎng)缽中生長，每個(gè)營養(yǎng)缽中播種10～15粒種子，生長期溫度保持晝20～25℃，夜10～15℃；
d)播種后30天，用消毒鑷子夾取有菌牙簽輕輕地嵌入麥苗莖桿與葉鞘內(nèi)，每個(gè)葉鞘嵌入一個(gè)有菌牙簽，接種處纏繞浸濕的醫(yī)用脫脂棉球，并用雙層遮陽網(wǎng)覆蓋，通過彌霧器使接種幼苗在近100％飽和的相對濕度下48h，然后去除遮陽網(wǎng)，幼苗正常生長管理，每天噴水一次；
e)在接種后30d，對苗期單株小麥材料進(jìn)行紋枯病病害等級(jí)鑒定；
f)根據(jù)病害評(píng)價(jià)等級(jí)計(jì)算病情指數(shù)，免疫的指數(shù)為0；高抗HR的指數(shù)為＜20％；抗R的指數(shù)為20.01～40.0％；中抗MR的指數(shù)為40.01～50.0％；中感MS的指數(shù)為50.01～60.0％；感S的指數(shù)為60.01～80.0％；高感HS的指數(shù)為80.01-100.0％。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征在于將待鑒定的小麥品種或品系的種子按照c)步驟～f)步驟至少再進(jìn)行一次重復(fù)鑒定，將分次鑒定的病情指數(shù)的平均值作為該小麥品種或品系的最終鑒定的病情指數(shù)。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的小麥紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征在于步驟a)中將小麥紋枯病菌(Rhizactonia cerealis)菌種在超凈工作臺(tái)上于PDA固體培養(yǎng)基的活化培養(yǎng)期為7天。
4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的小麥紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征在于所述的小麥紋枯病病害評(píng)價(jià)等級(jí)為0～5級(jí)，其中0級(jí)外層葉鞘無病斑；1級(jí)外層葉鞘有病斑；2級(jí)第二、第三葉鞘有病斑；3級(jí)；第四、第五葉鞘有病斑；4級(jí)莖干上有病斑；5級(jí)整株枯死。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的小麥紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征在于
計(jì)算病情指數(shù)的公式是
式中0、1、2、...5分別表示相應(yīng)病害等級(jí)；
X0、X1、...X5分別表示對應(yīng)病害評(píng)價(jià)等級(jí)的小麥植株數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小麥紋枯病抗性苗期鑒定的方法，是將小麥紋枯病菌(Rhizactonia cerealis)菌種活化培養(yǎng)，獲得菌絲；通過培養(yǎng)基使菌絲長滿牙簽后形成有菌牙簽；將待鑒定的小麥品種或品系的種子在培養(yǎng)皿中于25℃下萌發(fā)后播種于20cm營養(yǎng)缽中生長，播種后30天，將有菌牙簽嵌入麥苗莖桿與葉鞘內(nèi)，接種處纏繞浸濕的醫(yī)用脫脂棉球，并用雙層遮陽網(wǎng)覆蓋，通過彌霧器使接種幼苗在近100％飽和的相對濕度下48h，然后去除遮陽網(wǎng)，幼苗正常生長管理，每天噴水一次；接種后30d，對苗期單株小麥材料進(jìn)行紋枯病病害等級(jí)鑒定；根據(jù)病害評(píng)價(jià)等級(jí)計(jì)算病情指數(shù)。
文檔編號(hào)A01H1/00GK101348825SQ200810196380
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月8日
發(fā)明者任麗娟, 周淼平, 旭 張, 余桂紅, 馬鴻翔 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院