專(zhuān)利名稱(chēng)：紋枯病抗性評(píng)估方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病害防治技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種紋枯病抗性評(píng)估方法。
背景技術(shù)：
紋枯病是我國(guó)冬麥區(qū)的重要病害之一，小麥不同生育階段均可受害，在長(zhǎng)江流域及黃淮平原麥區(qū)普遍發(fā)生。近年來(lái)，耕作制度和氣候的變化以及感病品種的大面積應(yīng)用，使得小麥紋枯病的危害面積迅速擴(kuò)大。一般病田損失產(chǎn)量為10% -15%，嚴(yán)重田塊損失可達(dá)30%-40%，甚至更高，成為影響小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重大障礙。因此抗紋枯病育種以及篩選我國(guó)現(xiàn)有的抗性種質(zhì)對(duì)產(chǎn)量的提高具有重要的意義。 目前，小麥紋枯病抗性鑒定的時(shí)期主要包括溫室苗期、成株期及大田成株期，主要的抗性鑒定方法有自然病圃鑒定和人工接菌鑒定兩種，自然病圃鑒定依賴(lài)于當(dāng)年病菌本身的數(shù)量、病害發(fā)生的環(huán)境，如果環(huán)境不利于病害的發(fā)生或病菌較少，就會(huì)導(dǎo)致材料不出現(xiàn)病斑而無(wú)法抗性鑒定的情況。人工接菌鑒定法有牙簽接種法、表土接種法、播種溝撒病麥粒法3種。非專(zhuān)利文獻(xiàn)ー種新的小麥紋枯病抗性苗期鑒定評(píng)價(jià)方法(任麗娟，姚金保，陳萍等.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，5 :131-133.)報(bào)道了一種新的小麥紋枯病抗性苗期鑒定評(píng)價(jià)方法，它采用牙簽接種法在小麥溫室苗期進(jìn)行抗性鑒定，其在小麥3-4葉期進(jìn)行接種用消毒鑷子夾取有菌的牙簽，輕輕地嵌入麥苗莖桿與葉鞘內(nèi)，每個(gè)葉鞘嵌入I個(gè)有菌牙簽，每個(gè)品種(系)接種20個(gè)單株。其在接種處纏繞浸濕的醫(yī)用脫脂棉球，并用雙層遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋，通過(guò)彌霧器使接種幼苗在近100%的相対濕度下保持48h，然后去除遮陽(yáng)網(wǎng)，幼苗正常生長(zhǎng)管理，每天噴水I次；在接種30d后調(diào)查病級(jí)數(shù)，然后計(jì)算病情指數(shù)。非專(zhuān)利文獻(xiàn)小麥抗紋枯病種質(zhì)創(chuàng)新及QTL定位的初步研究(蔡士賓，任麗娟，顏偉等沖國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39 (5) =928-934.)在研究小麥紋枯病基因定位時(shí)，利用播種溝土壤接菌法進(jìn)行種質(zhì)的抗性鑒定，其將紋枯菌在煮熟的麥粒上培養(yǎng)，待麥粒表面長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲后待用。小麥播種開(kāi)行后，先將培養(yǎng)好的帶菌麥粒均勻撒與播種溝內(nèi)，每平方米接種帶菌麥粒3g，后播種試驗(yàn)材料，再覆土、保濕3-5d，在乳熟期分0-4級(jí)調(diào)查紋枯病病級(jí)。采用人工接種鑒定法，不管是在溫室還是大田，都需要占用土地資源，接種后需要進(jìn)行噴水保濕措施，因此抗性鑒定準(zhǔn)確與否受到保濕措施、接種效果、環(huán)境等因素的限制，也容易發(fā)生所有材料均不表現(xiàn)出病斑的情況導(dǎo)致抗性無(wú)法確定的情況；接種到病害發(fā)生需要ー個(gè)月以上的時(shí)間，鑒定時(shí)間長(zhǎng)；鑒定時(shí)由技術(shù)人員操作，不同人之間存在評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，產(chǎn)生誤差。由于在鑒定時(shí)有時(shí)間限制且工作量大，需要很多人員同時(shí)展開(kāi)エ作，消耗大量的人力物力。綜上所述，現(xiàn)有的紋枯病抗性鑒定方法的準(zhǔn)確性受環(huán)境因素的影響，鑒定所需時(shí)間長(zhǎng)，人為因素誤差大，并且需耗費(fèi)大量的人力物力。

發(fā)明內(nèi)容
(一 )要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種紋枯病抗性評(píng)估方法，其能夠縮短植物紋枯病抗性鑒定的時(shí)間，且其準(zhǔn)確性不受環(huán)境等不確定因素的影響，同時(shí)可節(jié)省大量的人力物力。( ニ)技術(shù)方案為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種紋枯病抗性評(píng)估方法，包括以下步驟A :選取具有不同紋枯病抗性的小麥萌發(fā)期的種子，并采用染有紋枯病菌的種子對(duì)選取的部分種子進(jìn)行侵染，將其余部分種子作為對(duì)照種子；B:在不破壞種子細(xì)胞和組織的情況下，采用非損傷性?huà)呙桦x子選擇電極技術(shù)檢測(cè)對(duì)照種子和受侵染的待測(cè)種子的胚根處的Ca2+離子電壓差；C :根據(jù)所測(cè)Ca2+離子電壓差計(jì)算所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向及流速；D :若所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向始終保持外流，則該待測(cè)種子為感病品種，若所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向始終保持內(nèi)流，則該待測(cè)種子為抗病品種。優(yōu)選地，所述步驟A中，選取具有不同紋枯病抗性的小麥萌發(fā)期種子將種子消毒、浸種催芽后，挑選露白一致的種子。優(yōu)選地，所述步驟B進(jìn)ー步包括在距離種子胚根表面預(yù)定距離處垂直測(cè)量?jī)牲c(diǎn)之間的電壓差，并將兩點(diǎn)之間的電壓差換算成離子濃度差。優(yōu)選地，所述步驟B還包括使Ca2+選擇性微電極前端灌充Ca2+離子的液態(tài)交換劑液柱，后端灌充電解液柱，將電極固定器上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解液接觸。優(yōu)選地，所述步驟C中，計(jì)算所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向，進(jìn)ー步包括根據(jù)菲克第一擴(kuò)散定律J0 = -D · dc/dx判斷Ca2+離子的流向,其中，dc為待測(cè)種子的胚根處兩點(diǎn)間的Ca2+離子濃度差，dx為采用非損傷性?huà)呙桦x子選擇電極技術(shù)檢測(cè)待測(cè)種子的胚根處的Ca2+離子電壓差時(shí)電極的移動(dòng)距離，D為離子擴(kuò)散常數(shù)。(三)有益效果本發(fā)明紋枯病抗性評(píng)估方法通過(guò)在種子萌發(fā)階段采用非損傷性?huà)呙桦x子選擇電極技術(shù)檢測(cè)受紋枯病菌侵染種子的胚根處的Ca2+離子濃度差，進(jìn)而推算種子的Ca2+的流向，以此為依據(jù)進(jìn)行小麥種子的紋枯病抗性評(píng)估，本發(fā)明能夠有效地進(jìn)行紋枯病抗性的鑒定，本發(fā)明只需選取品種的幾粒種子在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥品種紋枯抗性的快速評(píng)估，節(jié)省了品種、土地資源，降低了人工消耗，同時(shí)縮短了抗性鑒定的時(shí)間，并不受環(huán)境等不確定因素的影響。


圖I為本發(fā)明實(shí)施方式中所述紋枯病抗性評(píng)估方法的流程圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施方式中所述山紅麥、CI12633、西鳳、百農(nóng)64、寧麥8號(hào)、豫麥49對(duì)照與接種兩種情況下種子胚根Ca2+離子流速變化示意圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施方式中所述山紅麥、CI12633、西鳳、百農(nóng)64、寧麥8號(hào)、豫麥49對(duì)照與接種兩種情況下種子胚根Ca2+平均離子流速圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。鈣離子作為重要的第二信使，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞眾多的生理和病理過(guò)程。研究表明，鈣信使系統(tǒng)參與植物抗病性表達(dá)過(guò)程，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞和胞外也是高等植物對(duì)病原侵染的早期反應(yīng)之一。專(zhuān)著《植物誘導(dǎo)抗病性原理和研究》認(rèn)為大麥對(duì)霜霉病的抗性表現(xiàn)出與細(xì)胞間鈣離子的濃度有很大的相關(guān)性。非專(zhuān)利文獻(xiàn)(關(guān)春蕾，侯春燕，王冬梅.影響Ca2+代謝和鈣通道的藥物對(duì)小麥?zhǔn)苋~銹菌侵染后誘發(fā)的HR的作用.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29 (6)4-8.)研究表明胞內(nèi)Ca2+濃度升高可能是誘發(fā)小麥葉片發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)所必需的，Ca2+在小麥抵抗葉銹菌侵染的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中可能發(fā)揮重要作用。非損傷性?huà)呙桦x子選擇電極技術(shù)(scanning ion-selective electrode technique, SIET)是一種選擇性離子/ 分子微電極技術(shù)，在電腦自動(dòng)控制下，利用選擇性微電極，在不接觸被測(cè)樣品的情況下獲得進(jìn)出樣品的各種分子/離子的濃度(mM級(jí))、流速(10-12mol ^nT2)及其三維運(yùn)動(dòng)方向的信息。因 此在給小麥種子接種紋枯病菌后，利用非損傷性?huà)呙桦x子選擇電極技術(shù)檢測(cè)Ca2+的流動(dòng)情況，可以判斷出小麥材料的紋枯病抗性。如圖I所示，本發(fā)明所述的紋枯病抗性評(píng)估方法，包括以下步驟A :選取具有不同紋枯病抗性的小麥萌發(fā)期的種子，并采用染有紋枯病菌的種子對(duì)選取的部分種子進(jìn)行侵染，將其余部分種子作為對(duì)照種子；步驟A中，選取具有不同紋枯病抗性的小麥萌發(fā)期種子將種子消毒、浸種催芽后，挑選露白一致的種子。例如可將抗病品種山紅麥、西鳳、CI12633 ;感病品種揚(yáng)麥15、豫麥49、百農(nóng)64共6個(gè)品種用3%次氯酸鈉消毒5分鐘，在培養(yǎng)箱分別浸種催芽24小時(shí)后，挑選露白一致的種子，置于鋪有單層濾紙的發(fā)芽盒中生長(zhǎng)，對(duì)照盒放置25粒種子，接種盒中放置25粒種子的同時(shí)，每粒種子邊上放置I粒紋枯病麥粒進(jìn)行侵染，侵染24小時(shí)后分別檢測(cè)對(duì)照以及接種種子的Ca2+進(jìn)出情況。B:在不破壞種子細(xì)胞和組織的情況下，采用非損傷性?huà)呙桦x子選擇電極技術(shù)檢測(cè)對(duì)照種子和受侵染的待測(cè)種子的胚根處的Ca2+離子電壓差；本發(fā)明所述方法以?huà)呙桦x子選擇性微電極技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，獲取進(jìn)出樣品的Ca2+離子濃度(禮級(jí))、流速及三維運(yùn)動(dòng)方向的信息。在Ca2+選擇性微電極前端灌充20 μ mCa2+離子的液態(tài)交換劑(LIX)液柱，后端灌充有15-20mm左右的電解液柱(IOOmM CaCl)，將電極固定器上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解液接觸。其中，參比電極為固體電極。在測(cè)量前Ih將種子轉(zhuǎn)移到測(cè)試盒中，測(cè)試液成分采用O. ImMCaCl2，測(cè)量位點(diǎn)為種子胚根，在距離胚根表面10 μ m處垂直測(cè)量?jī)牲c(diǎn)電壓差,此時(shí)電極兩點(diǎn)移動(dòng)距離30 μ m。穩(wěn)定測(cè)量IOmin后，對(duì)照與接種處理5次重復(fù)。C :根據(jù)所測(cè)Ca2+離子電壓差計(jì)算所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向及流速；Ca2+離子選擇性微電極在待測(cè)離子濃度梯度中以已知距離dx進(jìn)行兩點(diǎn)測(cè)量，獲得電壓Vl和V2，利用已知的該電極的電壓/濃度校正曲線(xiàn)將兩點(diǎn)之間電壓差換算成離子濃度差dc,將它們代入Ficks第一擴(kuò)散定律JO = -D *dc/dx (10_12mol/cm2 *s)可獲得該離子的流速和運(yùn)動(dòng)方向，其中，D為離子擴(kuò)散常數(shù)，Jtl為擴(kuò)散通量。在凈離子流的計(jì)算過(guò)程中，認(rèn)為根離子流符合圓柱擴(kuò)散幾何模型。流速的換算使用Mageflux軟件(Younger USA Sci. &Tech.Corp.，USA)完成。由圖2可知，在未用紋枯病菌接種的情況下(對(duì)照)，山紅麥、CI12633、西鳳、百農(nóng)64、寧麥8號(hào)、豫麥49共6個(gè)品種的種子胚根處Ca2+流速均為負(fù)值，平均流速分別為_(kāi)8O. I>-36. 5、_35· 3、_63· 4、_21· 3、_12· 4pmoI. cm 2· s 1 (見(jiàn)圖 3),大于 _90pmol. cm 2· s 1,且震蕩幅度較小。而接種紋枯病菌后，抗病品種一山紅麥、CI12633、西鳳種子胚根處Ca2+流速仍均為負(fù)值(圖2)，平均流速分別為-133. 6、-253. 3、-94. lpmol. cm_2· s_H見(jiàn)圖3)，與各自的對(duì)照相比，Ca2+流向不變，流速明顯增大，表現(xiàn)出更強(qiáng)的Ca2+內(nèi)吸；而感病品種-百農(nóng)64、寧麥8號(hào)、豫麥49種子胚根 處Ca2+流速表現(xiàn)為正值(見(jiàn)圖2)，平均流速分別為148.6、136. 1、67. 6pmol. cnT2. S、見(jiàn)圖3),與各自的對(duì)照相比,Ca2+的流向由內(nèi)吸轉(zhuǎn)為外排,差值可達(dá) 80pmol. cm 2. s 1 以上。D :若所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向始終保持外流，則該待測(cè)種子為感病品種，若所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向始終保持內(nèi)流，則該待測(cè)種子為抗病品種。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(圖2、圖3)可以得出在紋枯病菌脅迫下，抗病品種一山紅麥、Cl 12633、西鳳Ca2+流向不變，且流速増大，可能是快速吸收Ca2+，使得胞內(nèi)Ca2+濃度升高來(lái)誘導(dǎo)抗病反應(yīng)的發(fā)生，而感病品種則表現(xiàn)為Ca2+外排，可能是因?yàn)椴【o種子造成了很大的傷害，使得無(wú)法吸收Ca2+。由此得出，具有不同紋枯病抗性的品種在感染紋枯病后，表現(xiàn)出不同的Ca2+進(jìn)出情況，據(jù)此規(guī)律可對(duì)小麥品種進(jìn)行紋枯病抗性的評(píng)估。以上實(shí)施方式僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而并非對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變化和變型，因此所有等同的技術(shù)方案也屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍應(yīng)由權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
1.一種紋枯病抗性評(píng)估方法，其特征在于，包括以下步驟 A :選取具有不同紋枯病抗性的小麥萌發(fā)期的種子，并采用染有紋枯病菌的種子對(duì)選取的部分種子進(jìn)行侵染，將其余部分種子作為對(duì)照種子； B:在不破壞種子細(xì)胞和組織的情況下，采用非損傷性?huà)呙桦x子選擇電極技術(shù)檢測(cè)對(duì)照種子和受侵染的待測(cè)種子的胚根處的Ca2+離子電壓差； C :根據(jù)所測(cè)Ca2+離子電壓差計(jì)算所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向及流速； D :若所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向始終保持外流，則該待測(cè)種子為感病品種，若所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向始終保持內(nèi)流，則該待測(cè)種子為抗病品種。
2.如權(quán)利要求I所述的紋枯病抗性評(píng)估方法，其特征在于，所述步驟A中，選取具有不同紋枯病抗性的小麥萌發(fā)期的種子包括將種子消毒、浸種催芽后，挑選露白一致的種子。
3.如權(quán)利要求I所述的紋枯病抗性評(píng)估方法，其特征在于，所述步驟B進(jìn)ー步包括在距離種子胚根表面預(yù)定距離處垂直測(cè)量?jī)牲c(diǎn)之間的電壓差，并將兩點(diǎn)之間的電壓差換算成尚子濃度差。
4.如權(quán)利要求I所述的紋枯病抗性評(píng)估方法，其特征在于，所述步驟B還包括使Ca2+選擇性微電極前端灌充Ca2+離子的液態(tài)交換劑液柱，后端灌充電解液柱，將電極固定器上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解液接觸。
5.如權(quán)利要求I所述的紋枯病抗性評(píng)估方法，其特征在于，所述步驟C中，計(jì)算所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向，進(jìn)ー步包括根據(jù)菲克第一擴(kuò)散定律J0 = -D · dc/dx判斷Ca2+離子的流向，其中，dc為待測(cè)種子的胚根處兩點(diǎn)間的Ca2+離子濃度差，dx為采用非損傷性?huà)呙桦x子選擇電極技術(shù)檢測(cè)待測(cè)種子的胚根處的Ca2+離子電壓差時(shí)電極的移動(dòng)距離，D為離子擴(kuò)散常數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種紋枯病抗性評(píng)估方法，包括以下步驟A選取具有不同紋枯病抗性的小麥萌發(fā)期的種子，并采用染有紋枯病菌的種子對(duì)選取的部分種子進(jìn)行侵染，將其余種子作為對(duì)照種子；B在不破壞種子細(xì)胞和組織的情況下，采用非損傷性?huà)呙桦x子選擇電極技術(shù)檢測(cè)對(duì)照種子和受侵染的待測(cè)種子的胚根處的Ca2+離子電壓差；C根據(jù)所測(cè)Ca2+離子電壓差計(jì)算所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向及流速；D若所述待測(cè)種子的胚根處的Ca2+的流向始終保持外流，則該待測(cè)種子為感病品種，若所述待測(cè)種子胚根處的Ca2+的流向始終保持內(nèi)流，則該待測(cè)種子為抗病品種。本發(fā)明能縮短小麥紋枯病抗性鑒定時(shí)間，且其準(zhǔn)確性不受環(huán)境等不確定因素的影響，同時(shí)可節(jié)省大量的人力物力。
文檔編號(hào)A01C1/08GK102687612SQ20121013032
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者于春花, 侯佩臣, 王成, 王曉冬, 羅斌, 高權(quán) 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心