專利名稱：滇重樓快繁技術(shù)和煉苗、種植的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滇重樓快繁技術(shù)和煉苗、種植的方法。
背景技術(shù)：
重樓是《中國藥典》收錄品種,是云南白藥和中藥配伍中重要的稀缺中藥材，重樓是以地下根為 藥材，重樓主根生長(zhǎng)緩慢，周期長(zhǎng)，依賴于采挖野生資源來滿足需求，資源日漸枯竭.國內(nèi)雖有種 植，但播種后1-2年萌發(fā)出芽，尚末解決種源，隨著我國制藥企業(yè)對(duì)重樓原料需求量的迅速增長(zhǎng)， 重樓已逐漸成為瀕臨消亡的珍稀瀕危物種。
目前國外無此相關(guān)技術(shù)的研究報(bào)道，我國對(duì)于重樓的引種馴化和人工栽培技術(shù)的研究從上世紀(jì) 80年代就開始了，例如李運(yùn)昌(1982)對(duì)滇重樓的有性繁殖進(jìn)行了研究。王麗萍，起學(xué)偉(2002)也 對(duì)滇重樓進(jìn)行了野生馴化及栽培技術(shù)的初步研究。近年來對(duì)重樓需求每年以20%幅度遞增，而其野 生資源逐年減少，供需逐年擴(kuò)大。種植重樓是大勢(shì)所趨，綜觀技術(shù)有四
1、 假植
在中藥現(xiàn)代法種植中，云南省重樓的大多數(shù)種植公司是將甲地的野生重樓挖出，運(yùn)到乙地種植， 實(shí)際上不是種植是假植，假植處理不妥，爛根極多，導(dǎo)致重樓資源短缺，沒有解決從獲得種苗至大 田種植的根本問題。
2、 有性繁殖種苗的種植
從種植方面而言，目前國內(nèi)常采用的兩種方法(有性種子繁殖和無性切塊繁殖)之一采集野
外和假植重樓的種子進(jìn)行有性繁植，如澄江正飛藥材種植公司。野生滇重樓的種子采集困難，滇重 樓種子的生物特性決定滇重樓種子的發(fā)芽必須經(jīng)過兩個(gè)冬季休眠才會(huì)發(fā)芽，才能長(zhǎng)成幼苗，是典型 的"二年種子"，種植后十年其根可作藥材，十二年種植費(fèi)用和管理成本很高，周期過長(zhǎng)，藥農(nóng)不能 早見效益，難于推廣。非專業(yè)技術(shù)人員采集種子的品種難于控制，使種植的重樓有非藥用滇重樓的 情況，品種混亂使藥材質(zhì)量不易控制。
3、 滇重樓無繁一切塊種植 一
先對(duì)滇重樓帶頂芽的塊莖進(jìn)行切塊，將切塊直接種入苗床，待成芽后再移入大田進(jìn)行種植。如 云南白藥有限公司和澄江正飛藥材種植公司。非專業(yè)技術(shù)人員挖來的重樓品種難于控制，使種植的 重樓品種混亂，使種植的重樓有非藥用滇重樓的情況。切塊后品種不保證，藥材質(zhì)量難控制。切塊 快繁可縮短種植周期，但仍需采集野生重樓為材料，種植中爛根較多尚未完全解決，于資源保護(hù)不 利。4、 滇重樓組培苗
云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南大學(xué)和云南中醫(yī)學(xué)院，先后進(jìn)行了組培實(shí)驗(yàn)。組培生產(chǎn)種苗，可縮短出苗 周期，使品種單一，但組培苗不易生根，種植不易成活的瓶頸難題尚未解決，滇重樓組培苗大田種 植成活率方面沒有突破，雖有人做過試驗(yàn)，但均未見有成功和較好效果的文獻(xiàn)報(bào)道。
5、 滇重樓組培苗存在問題
滇重樓組培苗不易生根，煉苗技術(shù)不成熟，種植不易成活是困繞科技工作者多年， 一直沒有解決 的瓶頸難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種滇重樓快繁技術(shù)和煉苗、種植的方法，該方法利用組織培養(yǎng)的技術(shù)原 理，選擇滇重樓根部的頂端為外植體，進(jìn)行無性繁植；攻克了組培苗不易生根，煉苗技術(shù)不成熟、 種植不易成活的瓶頸難題,為滇重樓資源的再生、確保重樓中藥材的市場(chǎng)供應(yīng)、滿足制藥企業(yè)對(duì)重樓 原料需求、實(shí)現(xiàn)資源的再生和持續(xù)利用提供了有效的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一、 快繁技術(shù)
材料經(jīng)過對(duì)甾體皂甙化學(xué)成分含量分析后，選擇高含量植株莖、芽為外植體，建立單株無菌 體系，確保種苗品質(zhì)的一致性，確保滇重樓中藥材優(yōu)質(zhì)種源。
1) 對(duì)外植體消毒:取健壯根沖洗1小時(shí)——70%乙醇擦洗根部——放到超凈工作臺(tái)上按以下步驟 操作用0. 1%升汞液浸泡10—15min，放入裝有無菌水的瓶子搖洗6次，用消毒鑷子取出在用消毒 刀片先切芽頭部分，然后順著芽頭往下在芽眼處斜切，切面成三角形，將切面向下沿瓶邊插入MS培
養(yǎng)基中，每瓶放一塊外植體。蓋緊瓶蓋，用保鮮袋封好瓶口，；
2) 組培
① 培養(yǎng)基配制以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物激素(如Naphthalene acetc acid， 6-benzyladenine, kinetin, I油le-3-butyric acid , Indole-3-actic acid, adenine)庶 糖30g/L、瓊脂粉6.5g/ L 、 ^值=5.6—6.4，生根培養(yǎng)基中加入活性炭lg/L。
配制過程按照常規(guī)方法，培養(yǎng)瓶為玻璃瓶或透明塑料瓶。滅菌采用121 'C滅菌30分鐘高壓濕熱 滅菌。
② 組培條件:組培室溫度25'C、置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25'C士2，光照時(shí)間為12小時(shí)， 光照強(qiáng)度為1000 2000勒可斯，uM m-2 s -1條件下培養(yǎng)。
二、 煉苗
將上面獲得的再生小苗從生根培養(yǎng)基中取出，用無菌水洗去再生小苗的培養(yǎng)基。于大量元素培 養(yǎng)基和微量元素液以及根據(jù)目的添加鐵鹽、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、各種維生素、植物激素，煉苗12天，根3—5條，長(zhǎng)度3—5cm。
大量元素培養(yǎng)基即MS培養(yǎng)基，其具體配方為硝酸鉀18-49、硫酸鎂.5.1-8.2、硝酸銨11.25、 磷酸二氫鉀1.6-5.3，定溶1升，與用無水氯化鈣6.64克定溶1升的溶液進(jìn)行混配；
微量元素液具體配方為上述培養(yǎng)基中每升加入硒1. 6—4. 2克，銨1. 8—5.6克，鋅0. 002—0.01 克，磷0.01—0.5克，培養(yǎng)10—15天，增加光照強(qiáng)度， 一般要求為4000 6000勒可斯，而后打開 瓶蓋通風(fēng)、透氣5—7天，待苗木葉色濃綠、塊莖木質(zhì)化程度提高，并逐步適應(yīng)后、再移栽。也可以 將生根瓶移入溫室內(nèi)培養(yǎng)，而后打開瓶蓋通風(fēng)、透氣，使苗逐步適應(yīng)后再移栽。
三、種植
具體方法步驟及條件從微量元素液中取出幼苗，移栽在經(jīng)消毒的土壤培養(yǎng)袋中，置于背陰、通 風(fēng)、濕潤(rùn)的地床上，無需施肥、澆水， 一周后檢査土壤濕潤(rùn)度以土壤從手指縫中流出，手捏住土 壤時(shí)濕潤(rùn)無滲水為標(biāo)準(zhǔn)；20天后小苗葉片轉(zhuǎn)為墨綠色，長(zhǎng)出新根后，可添加腐熟土更換營(yíng)養(yǎng)袋中消 毒土壤，待長(zhǎng)出的頂芽長(zhǎng)成葉片時(shí)，即可移栽野外。
蟲害防治重樓的主要蟲害為白螞蟻及老鼠，老鼠喜溫，因此，野外移栽防治鼠害的條件極為 重要首先要選擇西邊背陰1800米海拔以上的寒冷山區(qū)為宜；同時(shí)，定期滅鼠。
本發(fā)明的有益效果
優(yōu)選重樓的根中"根莖頂端生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)"為外植體進(jìn)行單株組培組培，可確保種苗品質(zhì)的一致性， 確保重樓中藥材優(yōu)質(zhì)種源。誘導(dǎo)出愈傷組織，分化頻率為100%，增殖系數(shù)為5—6倍以上。愈傷組織 轉(zhuǎn)接到不定芽分化和繼代培養(yǎng)，每個(gè)芽的年增殖系數(shù)理論上為1.0X1010以上。無根不定芽，轉(zhuǎn)接到 生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到不定根生根苗，生根達(dá)3—5厘米。煉苗時(shí)加入微量元素，可長(zhǎng)出新的須根 2—5條，須根長(zhǎng)度均超過0. 5CM。煉苗的成活率達(dá)80X.主根粗壯，須根增多,種植野外時(shí)適應(yīng)性強(qiáng)，大 田種植成活率達(dá)80%以上，解決了組培不易成活的難題。
重樓種子具"二次休眠"的生理特性，用種子有性繁殖出苗需二年以上；利用"根莖頂端生長(zhǎng) 優(yōu)勢(shì)"為外植體進(jìn)行組培，在一年內(nèi)即可培育三批組培苗，提前二年獲得種苗，縮短了種植周期。 此發(fā)明創(chuàng)造技術(shù)與現(xiàn)有其他技術(shù)相比，具有生長(zhǎng)周期短、生產(chǎn)成本低、品質(zhì)好、可規(guī)模化生產(chǎn)種苗 的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:愈傷組織誘導(dǎo)與分化
取甾體皂甙化學(xué)成分含量高,健壯的重樓根外殖體，用70%的乙醇表面消毒卜6分鐘，再用0.1% 的升汞消毒5-15分鐘，滅菌蒸餾水洗6次，每次10分鐘。然后，將消毒后的外植體切成小塊接種 在0. 2 mg/L NAA和1. 5 mg/L 6-BA激素，分裂素3%活性炭,添加100ml/L椰汁的MS蔗糖瓊脂培養(yǎng)基 上，配制過程按照常規(guī)方法，培養(yǎng)瓶為玻璃瓶，滅菌采用121 'C滅菌30分鐘高壓濕熱滅菌。置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25'C土2，光照時(shí)間為12小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000 2000勒可斯， yMm-2 s -1條件下培養(yǎng)；經(jīng)過對(duì)外植體誘導(dǎo)后得到愈傷組織，培養(yǎng)4周，其體積可比原愈傷組織 擴(kuò)大5 6倍。誘導(dǎo)出愈傷組織，增殖系數(shù)為5 6倍以上。
按此方法可每月繼代培養(yǎng)，每個(gè)芽的年增殖系數(shù)理論上為1.0X1010以上。 實(shí)施例2:不定芽、不定根誘導(dǎo)
選取愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽分化和繼代培養(yǎng)基中，置于溫度為10 °C±2，光照時(shí)間為4小時(shí)，光 照強(qiáng)度為1000 2000勒可斯，yM nr2 s -1條件下培養(yǎng)得到不定芽。按此方法45天為一周期繼代 培養(yǎng)。
選取生長(zhǎng)健壯、高度為1.5-3.0 cm的無根不定芽，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，置于溫度為2(TC土2， 光照時(shí)間為10小時(shí)，光照強(qiáng)度2000~4000勒可斯，u M m-2 s -1條件下培養(yǎng)得到不定根生根苗， 生根達(dá)3—5厘米。 實(shí)施例3:煉苗
采用微量元素配方將獲得的生根苗從生根培養(yǎng)基中取出，用無菌水洗去培養(yǎng)基。將生根苗置
于微量元素液，每升加入硒4.2克，銨5.6克，鋅0.01克，磷0.5克，培養(yǎng)15天，保持光照強(qiáng)度 為4000 6000勒可斯，iiMnr2s-l，氣溫為20-25°C，相對(duì)濕度為70-100%。待長(zhǎng)出木質(zhì)化新根3 一5條，再將其移栽到大棚進(jìn)行煉苗30—50天，可長(zhǎng)出新的須根2—5條，須根長(zhǎng)度均超過0. 5CM。 實(shí)施例4:種植
經(jīng)大棚煉苗長(zhǎng)出新的須根2—5條，須根長(zhǎng)度均超過0.5cm時(shí)，木質(zhì)化新根粗壯，原地上部分枯 萎，變黃逐漸倒苗，新生苗芽頂出現(xiàn)，此時(shí)適應(yīng)性強(qiáng)，在11月，4月和8月份分批將大棚中的幼苗 整株移栽于野外，并fe持水分。種植成活率達(dá)到80%以上，突破了我國重樓組培苗煉苗技術(shù)及難以種 植成活的瓶徑難題。
權(quán)利要求
1、一種滇重樓快繁技術(shù)，其特征是包括組培選擇高含量植株莖、芽為外植體，建立單株無菌體系，對(duì)外植體消毒后插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行組培；生根培養(yǎng)基配制以MS為基本培養(yǎng)基，附加植物激素，蔗糖30g/L、瓊脂粉6.5g/L、PH值＝5.6--6.4，培養(yǎng)基中加入活性炭1g/L；組培條件在溫度為25℃±2，光照時(shí)間為12小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000～2000勒可斯、μMm-2s-1條件下培養(yǎng)；
2、 一種滇重樓煉苗方法，其特征為步驟如下將獲得的再生小苗從生根培養(yǎng)基中取出用無菌水洗凈，于MS培養(yǎng)基中添加鐵鹽、肌醇、 甘氨酸、脯氨酸各種維生素及植物激素?zé)捗?2天，根5—10條，長(zhǎng)度3—5cm;再加入微量元素， 每升加入硒1.6—4.2克，銨1.8—5.6克，鋅0.002—0.01克，磷0.01—0.5克，培養(yǎng)10— 15天，增加光照強(qiáng)度至4000 6000勒可斯，而后打開瓶蓋通風(fēng)、透氣5—7天，待苗木葉色 濃綠、塊莖木質(zhì)化程度提高，并逐步適應(yīng)后、再移栽；
3、 一種滇重樓種植方法，其特征為具體方法是從上述微量元素液中取出幼苗，移栽在經(jīng)消毒的土壤培養(yǎng)袋中，置于背陰、通風(fēng)、濕潤(rùn)的 地床上，無需施肥、澆水， 一周后檢査土壤濕潤(rùn)度以土壤從手指縫中流出、手捏住土壤時(shí)濕 潤(rùn)無滲水為標(biāo)準(zhǔn)；20天后小苗葉片轉(zhuǎn)為墨綠色，長(zhǎng)出新根后，可添加腐熟土更換營(yíng)養(yǎng)袋中消 毒土壤，待長(zhǎng)出的頂芽長(zhǎng)成葉片時(shí)，即可移栽野外并進(jìn)行蟲害防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種滇重樓快繁技術(shù)和煉苗、種植的方法，其快繁技術(shù)包括篩選優(yōu)質(zhì)單株體系、消毒、組培煉苗是關(guān)系組培苗種植成活率高低的關(guān)鍵，本發(fā)明首次利用微量元素進(jìn)行滇重樓煉苗，使煉苗成活率達(dá)80％，從而確保種植成活率達(dá)80％；煉苗是將再生小苗先置于添加維生素及植物激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，再加入微量元素進(jìn)行培養(yǎng)再移栽；種植方法是將經(jīng)過煉苗的幼苗移栽在經(jīng)消毒的配方土壤培養(yǎng)袋中，待新長(zhǎng)出的頂芽長(zhǎng)成葉片時(shí)，即可移栽野外并進(jìn)行蟲害防治。本發(fā)明的技術(shù)及方法可確保種苗品質(zhì)的一致性，確保重樓中藥材優(yōu)質(zhì)種源。煉苗的成活率達(dá)80％。主根粗壯，須根增多，種植野外時(shí)適應(yīng)性強(qiáng)，大田種植成活率達(dá)80％以上，解決了組培不易生根、煉苗技術(shù)不成熟，種植不易成活的瓶頸難題。具有生長(zhǎng)周期短、生產(chǎn)成本低、品質(zhì)好、可規(guī)?；a(chǎn)種苗的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101461327SQ200810233480
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者艷 張, 張抱瓊, 喆 楊, 熊云昆, 勇 石, 陳昌祥 申請(qǐng)人:昆明優(yōu)利豐園科技開發(fā)有限公司