專利名稱：用于培育糖度提高的植物體的組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質且用于培育糖度提 高的植物體的組合物及其用途。
背景技術：
通常，水果類、蔬菜類和谷物類等植物中含有糖分。糖分的量用糖 度表示，根據(jù)植物的種類，所述糖度對商品的價值產(chǎn)生影響。因此，近 年來正在開展用于提高植物的糖度的技術開發(fā)。
例如，高糖度番茄主要由土地耕種生產(chǎn)。還提出了由培養(yǎng)液栽培來 生產(chǎn)高糖度番茄的技術(專利文獻1 )。
另一方面，人們認識到，谷胱甘肽等調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物
質，能夠作為細胞或器官的分化調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用(專利文獻2)。還認識
到谷胱甘肽能夠作為植物生長調(diào)整輔助劑發(fā)揮作用(專利文獻3 )。
專利文獻1:日本國公開專利公報《特開平10-271924號公報(公開
日1998年10月13日)》
專利文獻2:國際公開W0 01/080638 (
公開日2003年7月22日) 專利文獻3:日本國公開專利公報《特開2004-352679號公報(公開
日2004年12月16日)》

發(fā)明內(nèi)容
然而，上述以往的植物的提高糖度的技術并不簡便。能夠由土地耕 種生產(chǎn)高糖度番茄的人僅限于部分專業(yè)技術人員。另外，由培養(yǎng)液栽培 生產(chǎn)高糖度番茄，在栽培管理上需要特殊的技術以及特殊的生產(chǎn)裝置。
因此，本發(fā)明是鑒于上述情況而做出的，本發(fā)明的目的是提供用于 簡便地培育糖度提高的植物的組合物及使用該組合物的技術。本發(fā)明人為了解決上述課題進行了認真的研討，得到的成果是，發(fā) 現(xiàn)當用添加了調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質的培養(yǎng)基(含有土壤及土 壤改良劑)培育植物體，或者對植物體直接涂布、噴霧所述調(diào)節(jié)細胞內(nèi) 氧化還原狀態(tài)的物質時，該植物體的糖度將有所提高。本發(fā)明是基于此 全新的發(fā)現(xiàn)而做出的，包含以下的發(fā)明。
本發(fā)明涉及的用于培育糖度提高的植物體的組合物的特征在于，含 有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質(但過氧化氫除外)。
本發(fā)明涉及的用于培育糖度提高的植物體的組合物中，所述調(diào)節(jié)細
胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質較優(yōu)選為谷胱甘肽、編碼Y-谷氨酰半胱氨酸合 成酶的多核苷酸或編碼谷胱甘肽結合性質體型果糖-1, 6-二磷酸醛縮酶 的多核苷酸。
再有，本發(fā)明涉及的用于培育糖度提高的植物體的組合物中，所述 調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質較優(yōu)選為氧化型谷胱甘肽。
另外，本發(fā)明涉及的用于培育糖度提高的植物體的試劑盒的特征在 于，所述試劑盒具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質(但過氧化氫除外)。
另外，本發(fā)明涉及的糖度提高的植物體的培育方法的特征在于，所 述方法含有使用調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質(但過氧化氫除外)栽 培植物體的工序。
另外，由本發(fā)明涉及的培育方法得到的植物體也是本發(fā)明的范疇。
本發(fā)明其它的目的、特征、以及優(yōu)點通過以下示出的內(nèi)容將被充分 的理解。另外，本發(fā)明的優(yōu)點通過下述參照附圖的說明將變得顯而易見。


圖1示出了實施方案2中得到的番茄果實的糖度測定結果； 圖2示出了 AN0VA解析圖1中示出的糖度測定結果的結果； 圖3示出了從GSSG或GSH的處理日起經(jīng)過的天數(shù)與糖度的關系的經(jīng) 證實的結果；
圖4示出了 35S-GSH1的淀粉及葡萄糖的測定結果； 圖5示出了實施方案8中得到的櫻桃果實的糖度測定結果；圖6示出了實施方案9中得到的溫州蜜柑果實的糖度測定結果； 圖7示出了實施方案10中得到的草莓果實的糖度測定結果； 圖8示出了實施方案11中得到的甜玉米果實的糖度測定結果； 圖9示出了序列號15-36的基因系統(tǒng)樹。
具體實施例方式
<1.本發(fā)明涉及的用于培育糖度提高的植物體的組合物〉
本發(fā)明涉及的用于培育糖度提高的植物體的組合物(以下稱"本發(fā) 明涉及的組合物")只要含有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質即可。
使用本發(fā)明涉及的組合物能夠簡便地培育糖度提高的植物體。例如， 令培養(yǎng)基中包含本發(fā)明涉及的組合物，可用該培養(yǎng)基培育植物體。另夕卜， 如下所述，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質為多核苷酸的情況下,可以 僅僅使用已知的轉化技術將所述多核苷酸導入植物中來栽培該植物。因 此，與上述土地耕種等現(xiàn)有技術相比，不需要熟練的技能、特殊的技術、 特殊的生產(chǎn)裝置等，能夠極為簡便地得到糖度提高的植物。
這種將調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質用于培育糖度提高的植物的 用途，是與現(xiàn)有的該物質的用途完全不同的新用途。另外，這種能夠得 到糖度提高的植物的效果，根據(jù)現(xiàn)有的用途是完全不能夠預測的。因此 本發(fā)明是由本發(fā)明人基于全新的發(fā)現(xiàn)而得到的。
本說明書中，所謂"糖度提高的植物體"，意為與該植物體的野生植 抹相比糖度提高的植物體。換言之，糖度提高的植物體與野生植抹相比 具有高糖度。即，本發(fā)明涉及的組合物也可以說是一種用于培育具有與 野生植林相比高糖度的植物體的組合物。例如，使用本發(fā)明涉及的組合 物栽培植物體，與不使用本發(fā)明涉及的組合物進行栽培的情況相比，能 夠提高該植物體的糖度。對糖度使用已知的方法進行測定即可，也可以 像本實施方案一樣使用已知的糖度計。
本說明書中，所謂"調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質"，意為調(diào)節(jié)與 細胞內(nèi)的氧化還原相關的物質的氧化和還原的物質，包含使下述量表示 的值發(fā)生變化的物質，例如活性氧的生成容易度，谷胱甘肽的絕對量，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比，煙酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸的
還原型(NAD(P)H)的絕對量，NADPH/NADP的比，細胞色素c的氧化型/ 還原型的比，質體醌、泛醌等電子傳遞鏈的構成要素的氧化/還原比。并 且，與細胞內(nèi)進行的氧化還原相關的物質是該技術領域中已知的，并不 限定于此。另外，使上述值發(fā)生變化的物質，可例示出對谷胱甘肽的合 成或谷胱甘肽的量有影響的物質、促進或阻礙活性氧的生成的物質、促 進或阻礙某種化合物向氧化型和還原型中的任意一種轉變的物質。
本發(fā)明涉及的組合物中含有的調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質，并 不僅限于上述意思中包含的物質，但優(yōu)選例示出對谷胱甘肽的合成或谷 胱甘肽的量有影響的物質。當采用這些物質時，能夠得到較高糖度的植 物。
另外，本說明書中，所謂"對谷胱甘肽的合成或谷胱甘肽的量有影 響的物質"，意為使細胞內(nèi)的谷胱甘肽的量發(fā)生變化的物質，優(yōu)選使谷胱 甘肽增加的物質，例如可舉出谷胱甘肽本身、谷胱甘肽合成酶、編碼該 酶的多核苷酸等。
另外，作為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質，可分為能夠通過與植 物接觸從而被植物吸收的物質和導入植物基因組中的物質。當然，這兩 種物質可以單獨使用，也可以并用。
作為對谷胱甘肽的合成或谷胱甘肽的量有影響、并且能夠在與植物 接觸后被植物吸收的物質的具體實例，可例示出谷胱甘肽、谷胱甘肽結 合物、活性氧(例如過氧化氫等)、活性氮、多胺、二氧化鈦、茉莉酸、 水楊酸、半胱氨酸、胱氨酸、重金屬鎘、鐵離子。并且，多胺成為過氧 化氫的原料。二氧化鈦在光照下生成活性氧。半胱氨酸、胱氨酸是谷胱 甘肽的前體。重金屬鎘和鐵離子優(yōu)選過量添加。另外，此處例示出的物 質中優(yōu)選谷胱甘肽。另外，對于谷胱甘肽，存在還原型谷胱甘肽(下稱 "GSH")及氧化型谷胱甘肽(下稱"GSSG，，)，但本發(fā)明涉及的組合物中含 有的谷胱甘肽較優(yōu)選為GSSG。為GSSG時，正如下述實施方案所示，能夠 得到較高糖度的植物。另外，能夠增加果實數(shù)量，使果實更為肥碩。
另外，作為對谷胱甘肽的合成或谷胱甘肽的量有影響、且導入植物基因組中的物質的具體實例，可優(yōu)選例示出，例如y -谷氨酰半胱氨酸合 成酶、編碼y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸(下稱"GSH1基因")、 谷胱甘肽結合性質體型果糖-1, 6-二磷酸醛縮酶、編碼谷胱甘肽結合性 質體型果糖-1， 6-二磷酸醛縮酶的多核苷酸(下稱"FBA基因")。
對GSH1基因的具體實例并沒有特別的限定，已知例如百日草 (Genbank accession: AB158510 )、稻(Genbank access ion: AJ508915 )、 煙草(Genbank accession: DQ"WM)等，這些基因也能夠適用于本發(fā) 明。與擬南芥相同，這些基因的翻譯產(chǎn)物也在N端區(qū)域具有葉綠體轉運 信號肽。
但是，在本發(fā)明中，可以優(yōu)選例示出以下(a) - (d): (a )編碼由序列號1或3示出的氨基S吏序列構成的多肽的多核苷酸； (b )編碼由一個氨基酸序列構成的、具有y -谷氨酰半胱氨酸合成酶 活性的多肽的多核香酸，所述氨基酸序列是通過在序列號1或3示出的 氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸而得到的； (c )由序列號2或4示出的堿基序列構成的多核苷酸；
(d) 與由和上述(a) - (c)的多核苷酸中的任意一種多核苷酸互補 的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的多核苷酸。
并且，序列號2示出了一個堿基序列的實例，所述堿基序列編碼由 序列號1示出的氨基酸序列構成的多肽；序列號4示出了一個堿基序列 的實例，所述堿基序列編碼由序列號3示出的氨基S臾序列構成的多肽。
對FBA基因的具體實例并沒有特別的限定，但優(yōu)選例示出以下的(e )
(e) 編碼由序列號5、 6及15-36的任意一個示出的氨基酸序列構成 的蛋白質的多核苷酸；
(f )編碼由一個氨基酸序列構成的、具有谷胱甘肽結合性質體型果 糖-1, 6-二磷酸醛縮酶活性的蛋白質的多核苷酸，所述氨基酸序列是通 過在序列號5、 6及15-36的任意一個示出的氨基酸序列中缺失、置換或 添加1個或多個氨基酸而得到的；
(g )由序列號7及37-56示出的堿基序列構成的多核苷酸；(h)與由和上述(e) -(g)的多核苷酸中的任意一種多核苷酸互補的堿基序列構成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸。
序列號8示出了由序列號5示出的氨基酸序列構成的蛋白質的cDNA序列。在序列號8示出的堿基序列中，第145位-第147位為起始密碼子，第1318位-第1320位為終止密碼子。即是說，擬南芥FBA1基因具有序列號8示出的堿基序列中的第145位-第1320位作為開放閱讀框架(ORF )。
序列號9示出了編碼由序列號6示出的氨基酸序列構成的蛋白質的堿基序列的一個實例。在序列號9中，第104位-第1300位是由序列號6示出的氨基酸序列構成的蛋白質的編碼區(qū)。并且，在序列號6中，從第1位的蛋氨酸至第48位的丙氨酸構成的肽是葉綠體轉運肽。
序列號7示出的堿基序列為擬南芥FBA1基因的ORF的堿基序列。并且，作為與擬南芥FBA1基因的堿基序列同源的基因，可舉出在稻的基因組中發(fā)現(xiàn)的基因(dbjlBAB55475. 1 )。
另外，序列號37-56分別作為編碼序列號15-34示出的氨基酸序列的DNA序列的一個實例。
另外，圖9示出了序列號15-36示出的氨基S復序列的系統(tǒng)樹，僅供參考。
另外，本領域技術人員能夠容易地理解，在所述序列號示出的氨基酸序列或DNA序列含相當于葉綠體轉運信號的區(qū)域的情況下，該區(qū)域可以置換為其它蛋白質的葉綠體轉運信號。
這里所謂"缺失、置換或添加1個或多個氨基酸"，意為通過位點特異性突變誘導方法等已知的變異肽的制造方法，缺失、置換或添加可以缺失、置換或添加的數(shù)量的氨基酸(優(yōu)選IO個以下，較優(yōu)選7個以下，更優(yōu)選5個以下)。這樣的變異蛋白質并不限定于通過已知的變異多肽的制造方法從而具有人工導入的變異的蛋白質，也可以是天然存在的蛋白質經(jīng)提純精制后得到的。
在本領域中眾所周知的是，可以容易地改變蛋白質的氨基酸序列中的幾個氨基酸而對該蛋白質的構造或功能不產(chǎn)生實質影響。另外，不僅僅是人工令其發(fā)生改變，在天然蛋白質中存在不使該蛋白質的構造或功能發(fā)生實質變化的變異體，也是眾所周知的。
優(yōu)選的變異體具有保守性或非保守性氨基酸置換、缺失、或添加。優(yōu)選沉默置換、添加和缺失，特別優(yōu)選保守性置換。這些突變不會使本發(fā)明涉及的多肽活性發(fā)生變化。
可考慮的代表性的保守性置換有在脂肪族氨基酸Ala、 Val、 Leu、和lie中的一個氨基酸置換為該范圍內(nèi)的其它的氨基酸、羥基殘基氨基酸Ser和Thr的交換、酸性殘基氨基酸Asp和Glu的交換、酰胺基殘基氨基酸Asn和Gln之間的置換、堿性殘基氨基酸Lys和Arg的交換、以及芳香族殘基氨基酸Phe、 Tyr之間的置換。
本發(fā)明書中，所謂"嚴格的條件"，意為僅當序列間存在至少90%的一致性，優(yōu)選至少95%的一致性，最優(yōu)選至少97°/。的一致性時才發(fā)生雜交。具體而言，例如，可以舉出在雜交溶液(含有50%甲酰胺、5xSSC(150mM的NaCl、 15mM的枸櫞酸三鈉)、50mM的磷酸鈉(pH7. 6 )、 5xDenhardt，s溶液、10%硫酸葡聚糖、及20ug/ml的經(jīng)變性并剪斷的鮭魚精子DNA )中在42。C下培養(yǎng)一夜后，在約65。C下在0. 1 x SSC中洗凈過濾器這樣的條件。雜交可使用如在Sambrook等所著，冷泉港實驗室出版社于2001年出版的《分子克隆實驗室手冊》第三版(Molecular Cloning, A LaboratoryManual, 3rd Ed" Cold Spring Harbor Laboratory (2001))中所述的方法那樣的眾所周知的方法進行。通常，溫度越高，鹽濃度越低，則嚴格度越高(進行雜交越困難)，能夠得到同源性越高的多核苷酸。
在本發(fā)明組合物中包含上述多核苷酸的情況下，本發(fā)明組合物也可含有具有該多核苷酸的表達型載體。表達型載體的構建方法可使用已知
的方法，對此沒有特別的限定。
表達型載體的母體的載體，可以4吏用已知的各種載體。例如，可以使用質粒、噬菌體、或科斯質粒等，可根據(jù)導入的植物細胞或導入方法進4亍適當?shù)倪xl奪。具體而言，例如，可舉出pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、 pBluescriptSK、 pBI系的載體等。特別是，在4吏用本發(fā)明涉及的組合物，將具有上述多核普酸的載體通過農(nóng)桿菌法導入植物體的情況下，優(yōu)選使用pBI系的雙元載體。具體而言，作為pBI系的雙元載體，例如可舉出pBIG、 pBIN19、 pBI101、 pBI121、 pBI221等。
上述啟動子只要是能夠在植物體內(nèi)實現(xiàn)基因表達的啟動子，對其就沒有特別的限定，已知的啟動子是適于使用的。這樣的啟動子，例如可舉出花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)、 Actin啟動子、胭脂堿合成酶的啟動子、煙草的PRla基因啟動子、番茄的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基啟動子等。其中，可較優(yōu)選使用花椰菜花葉病毒35S啟動子或Ac Un啟動子。當將用上述各種啟動子得到的表達型載體導入植物細胞內(nèi)時，能夠使其強烈地表達任意的基因。
上述的啟動子，只要連結并導入載體內(nèi)從而能夠將編碼了轉錄因子的基因表達出來即可，對于表達型載體的具體構造沒有特別的限定。
上述表達型載體除了含有上述啟動子及上述多核苷酸，還可進一步含有DNA片段。對所述其它的DNA片段沒有特別的限定，但可舉出終止子、選擇性標記基因、增強子、用于提高翻譯效率的堿基序列等。另夕卜，上述表達型載體也可進一步具有T-DNA區(qū)。特別是當使用農(nóng)桿菌將上述表達型載體導入植物體內(nèi)時，T-DNA區(qū)能夠提高基因導入效率。
終止子只要具有作為轉錄終止位點的功能，對其就沒有特別的限定，可以是已知的終止子。例如，具體而言，可以優(yōu)選使用胭脂堿合成酶基因的轉錄終止位點(Nos終止子)、花椰菜花葉病毒35S的轉錄終止位點(CaMV35S終止子)等。其中可以較優(yōu)選Nos終止子。在上述表達型載體中，通過將終止子設置在適當?shù)奈稽c，能夠防止在導入植物細胞后合成不必要的長轉錄物以及強效的啟動子使質粒的復制數(shù)目減少之類的現(xiàn)象的發(fā)生。
上述的選擇性標記基因，可使用例如耐藥性基因。作為這樣的耐藥性基因的具體的一個實例，可舉出例如對潮霉素、博萊霉素、卡那霉素、慶大霉素、氯霉素等的耐藥性基因。因此，通過選擇在含有上述抗生素的培養(yǎng)基中培育的植物體，能夠容易地選出發(fā)生轉化的植物體。
作為上述用于提高翻譯效率的多核苷酸，可舉出例如來自煙草花葉病毒的omega序列。通過將該omega序列設置于啟動子的非翻譯區(qū)(5，UTR)，能夠提高編碼上述轉錄因子的基因的翻譯效率。如此，在上述表達型載體中，為了達到此目的可以含有各種各樣的DNA片段。
作為構建表達型載體的具體方法，可以舉出如下方法在作為經(jīng)適當選擇的母體的載體上，將上述啟動子和上述多核苷酸，以及根據(jù)需要的上述其它的DNA片段按照設定的順序進行導入。另外，連結上述多核苷酸和啟動子(以及根據(jù)需要的終止子等)構建表達框，只要將其導入載體即可。在表達框的構建中，例如，將各個DNA片段的切斷位點作為互補的突出末端，通過在連接酶作用下發(fā)生反應，能夠規(guī)定該DNA片段的順序。并且，當表達框中含有終止子時，按下述順序排列即可從上游開始，啟動子、編碼N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶的多核苷酸、終止子。另外，對于用于構建表達型載體的試劑，即限制酶及連接酶等的種類也沒有特別的限定，適當選擇市場上的試劑使用即可。
另外，對上述表達型載體的增殖方法(生產(chǎn)方法)也沒有特別的限定，可以使用已知的方法。 一般地，將大腸桿菌作為宿主，只要使其在該大腸桿菌內(nèi)增殖即可。這時，可根據(jù)載體的種類選擇適當?shù)拇竽c桿菌的種類。
以上例示出的物質可單獨-使用，也可2種以上并用。當本發(fā)明涉及的組合物中含有的、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質，包含能夠通過與植物接觸被植物吸收的物質時，對它的量沒有特別的限定，但優(yōu)選0. OlmM-20mM，更優(yōu)選0. lmM-2mM,在此范圍內(nèi)，能夠更加揭_高培育的植物的糖度。并且，根據(jù)適用的植物的種類、目標糖度值等，其濃度也可作出適當?shù)淖兓?br> 本發(fā)明涉及的組合物中，在不損害本發(fā)明涉及的組合物的作用效果的范圍內(nèi)，也可含有其它成分。例如，當本發(fā)明涉及的組合物，作為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質，包含能夠通過與植物接觸被植物吸收的物質時，本發(fā)明組合物也可以在水、已知的液體載體等中溶解，以溶液狀藥劑、乳濁液狀藥劑、凝膠狀藥劑等形態(tài)提供。作為這樣的液體載體，可例示出二曱苯等芳香烴類，乙醇、乙二醇等醇類，丙酮等酮類，二氧雜環(huán)乙烷、四氫呋喃等醚類，二甲基曱酰胺，二曱亞砜，乙腈等，但并不限于上述物質。另外，也可以將調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質承載于固體的載體成分上，作為固體藥劑、粉體藥劑等。作為這樣的固體的載體成分，可以例示出滑石、粘土、蛭石、硅藻土、高嶺土、碳酸鈣、氫氧化鈣、陶土、硅膠等無機物，小麥粉、淀粉等有機物等，但并不限于上述物質。另外，本發(fā)明涉及的組合物中，可以適當添加其它的輔助劑。作為這樣的輔助劑可舉出例如烷基硫酸鹽類、烷基磺酸鹽、烷芳基磺酸鹽、雙烷基磺化琥珀酸鹽等陰離子表面活性劑，高級脂肪胺的鹽類等陽離子表面活性劑，聚乙二醇烷基醚、聚乙二醇?；ァ⒕垡叶?多元醇?；?、纖維素衍生物等非離子表面活性劑，明膠、酪蛋白、阿拉伯膠等增粘劑，增量劑，結合劑等。
對于本發(fā)明涉及的組合物的使用方法沒有特別的限定。例如，當本發(fā)明涉及的組合物，作為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質，包含能夠通過與植物接觸被植物吸收的物質時，當該組合物為溶液狀藥劑等的情況下，可以使該組合物包含在培育植物時使用的培養(yǎng)基等中，也可以將其散布、滴下、涂布在生長點、芽、葉、莖等植物體的一部分或全體上。并且，本說明書中培育植物時使用的"培養(yǎng)基，，中含有土壤、土壤改良劑。
另外，當本發(fā)明涉及的組合物為固體藥劑等時，可以使其包含在培育植物時使用的培養(yǎng)基中，在適用于水上栽培的植物時，也可將其放入水中使其緩慢溶解。也可提供溶于水的固體藥劑等，在使用時將其溶于水。另外，也可將本發(fā)明涉及的組合物與已知的肥料、植物激素等藥劑混合后施于一直物。
可以從播種植物種子的時候開始施用本發(fā)明涉及的組合物。具體而言，
當對像番茄等在播種后2個月-不到半年的期間能夠結果的植物施用本發(fā)明涉及的組合物時，可以在播種當天施用，優(yōu)選播種當天-播種后30天之間，較優(yōu)選播種當天-60天之間，更優(yōu)選從播種當天到收獲當天，定期的施用是更優(yōu)選的。在這種情況下，對施用本發(fā)明涉及的組合物的間隔沒有特別的限定，但一周內(nèi)優(yōu)選1次-4次，4交優(yōu)選2-3次。對施用量沒有特別限定，根據(jù)植物的種類作出適當?shù)脑O定即可，例如植物為番茄等時，每抹每次施用的調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質，優(yōu)選施用
0. OOlmraol以上0. lmmol以下，專交優(yōu)選0. Olmmol以上0. 05mrao1以下。并且，當如上所述在培養(yǎng)基中含有本發(fā)明涉及的組合物時，從將植物種子播種到該培養(yǎng)基時開始，或從將植物的苗等移栽到該培養(yǎng)基時開始，將本發(fā)明涉及的組合物施于該4直物。
另外，可以從播種后、成苗后等，有了一定程度的生長發(fā)育后開始，一定期間內(nèi)施用本發(fā)明涉及的組合物。例如，對甜玉米等稻科植物施用本發(fā)明涉及的組合物時，可在育苗后施用本發(fā)明涉及的組合物。這種情況下，可以使種植已長成的苗的培養(yǎng)基中預先含有本發(fā)明涉及的組合物，也可以在將苗種植到該培養(yǎng)基后，將本發(fā)明涉及的組合物定期地施加到培養(yǎng)基中。當在移栽苗之后將本發(fā)明涉及的組合物施加到培養(yǎng)基中的情況下，對相對具體的施加時期沒有特別的限定，但例如從移栽苗之后到收獲之間， 一周內(nèi)優(yōu)選施加1次-4次，較優(yōu)選2-3次。對施加量沒有特別的限定，可以根據(jù)植物的種類作出適當?shù)脑O定，但例如植物為甜玉米等時，每抹每次施加的調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質優(yōu)選施加0. OOlmmol以上0. lmmol以下，4交優(yōu)選0. Olmmol以上0. 05mmo1以下。
另外，也可以基于開花期設定施用本發(fā)明涉及的組合物的時期。例如，可以在花蕾期施用，也可在花瓣凋落后使用，也可從花蕾期到結果之間、從開花期到結果之間、從花瓣凋落到結果之間施用本發(fā)明涉及的組合物。如以下的實施方案所述，當對葡萄施用本發(fā)明涉及的組合物時，可以施于花序上。并且，在此實施方案中，按照用于培育無籽葡萄的植物激素(赤霉素)的施用期，將本發(fā)明涉及的組合物混入該植物激素中施用。
另外，也可以從收獲期起反向計算設定施用本發(fā)明涉及的組合物的時期。例如，可設定為從收獲期之前10天開始施用，從之前20天開始使施用等。
當如上所述在栽培期間施用本發(fā)明涉及的組合物時，可以將肥料和/或植物激素等藥劑與該組合物混合施于植物。在這種情況下，對施用所述的肥料等與組合物的混合物的時期沒有特別的限定，可以按照上述的另外，當本發(fā)明涉及的組合物，作為使細胞內(nèi)的谷胱甘肽增加的物 質，含有導入植物的基因組中的物質，如上述多核苷酸時，只要以使用 已知的轉化方法將該多核苷酸導入植物體的基因組中的方式來使用即 可。另外，例如，本發(fā)明涉及的組合物是含有這些多核苷酸的物質，也 可以是使用已知的植物表達型載體導入植物體的物質，也可以是含有具 有這些核苷酸的載體的物質。
另外，本發(fā)明涉及的組合物中，對上述的多核苷酸的含量沒有特別 的限定。另外，這些多核苷酸一般可以預先溶解在用于保存多核苷酸的 緩沖液等中。
關于將載體導入植物細胞，可以使用本領域技術人員已知的轉化方 法(例如農(nóng)桿菌法、基因槍法、聚乙二醇法、電穿孔法等)。例如，當使 用農(nóng)桿菌法時，將構建的用于植物的表達型載體導入合適的農(nóng)桿菌中(例
如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacter ium tumefaciens )),按照葉片法(leaf disc) (內(nèi)宮博文著，植物基因操作手冊，1990,第27-31頁，講談社Scientific, 東京)等令該菌林感染無菌培養(yǎng)葉片，能夠得到轉化植物。并且，在使 用基因槍法時，可以直接使用植物體、植物器官、植物組織自身，也可 以在制成切片后使用，也可以制成原生質體使用。可以使用基因導入裝 置(例如PDS-1000 (BIO-RAD公司)等)對經(jīng)過上述制備的試樣進行處理。 處理條件根據(jù)植物或樣品而有所不同，但通常在450-2000psi左右的壓 力，4-12cm左右的距離的條件下進行。
導入了目的基因的細胞或植物組織，首先用卡那霉素耐性、潮霉素 耐性等耐藥性標記對其進行選^^,然后用標準方法再生為植物體。由轉 化細胞再生為植物體的過程，可以根據(jù)植物細胞的種類用本領域技術人 員已知的方法實現(xiàn)。
關于目的基因是否已導入植物體的確認，可以按照PCR法、Southern 雜交法、Northern雜交法等進行。例如，由轉化植物制備DNA,針對導 入的DNA設計特異性引物，從而進行PCR。隨后，通過對擴增產(chǎn)物進行瓊 脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細管電泳等，用溴化乙啶等染色，從而檢測出目的擴增產(chǎn)物的方法，可以確認已經(jīng)完成了轉化。
一旦得到了基因組中導入了目的基因的轉化植物體，由該植物經(jīng)有 性生殖或無性生殖能夠得到子代。另外，從該植物體或其子代或者克隆 得到繁殖材料(例如種子、原生質體等)，以這些為基礎能夠批量生產(chǎn)目 的植物體。
在本發(fā)明中作為轉化的對象的植物，意為下述任意一種整抹植物 體、植物器官(例如葉、花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、 韌皮部、薄壁組織、木質部、維管束、柵欄組織、海綿組織等)或植物 培養(yǎng)細胞、或各種形態(tài)的植物細胞(例如懸浮培養(yǎng)的細胞)、原生質體、 葉的切片、愈傷組織等。對可用于轉化的植物沒有特別的限定，適當選 擇能夠表達目的基因的植物即可。
并且，上述的多核苷酸來自擬南芥，但已有報告例如煙草、楊樹、 檸檬等，用擬南芥的基因能夠培育轉化植物，這樣的報告也能夠作為本
魏酸5-羥基化酶的擬南芥基因的改性木質素》(Modified lignin in tobacco and poplar plants over—expressing the Arabidopsis gene encoding f erulate 5-hydroxylase.) ， Franke R， McMichael CM, Meyer K， Shirley AM, Cusumano JC, Chappie C.著，發(fā)表于Plant J. 2000 年第22期第223-224頁；《柑橘屬植物中擬南芥LEAFY或APETALAl基 因的纟且成型表達減少豆其世^時間》(Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALAl genes in citrus reduces their generation time. )Pena L， Martin-Tri1lo M， Juarez J， Pina JA, Navarro L， Martinez-Zapater JM.著，發(fā)表于Nat Biotechnol. 2001 年第19期第263-267頁)。
對于作為本發(fā)明組合物的對象的植物沒有特別的限制，對各種單子
葉植物、雙子葉植物、樹木等植物能夠全部適用。例如，作為單子葉植 物，能夠例示出例如，包含紫萍屬植物(紫萍)和浮萍屬植物(稀脈 萍和品藻)的浮萍科植物，包含卡特蘭屬植物、蕙蘭屬植物、石斛蘭屬 植物、蝴蝶蘭屬植物、萬代蘭屬植物、兜蘭屬植物、文心蘭屬植物等的蘭科植物，香蒲科植物、黑三棱科植物、眼子菜科植物、茨藻科植物、 芝菜科植物、澤瀉科植物、水鳘科植物、霉草科植物、稻科植物(玉米 等，如甜玉米等)、莎草科植物、椋櫚科植物、天南星科植物、谷精草科 植物、鴨跖草科植物、雨久花科植物、燈心草科植物、百部科植物、百 合科植物、石蒜科植物、薯蕷科植物、秀尾科植物、芭蕉科植物、姜科 植物、美人蕉科植物、水玉簪科植物等。
另外，作為雙子葉植物，能夠例示出例如，包含牽牛屬植物(牽 ?；?、打碗花屬植物(日本打碗花、打碗花、腎葉打碗花)、番薯屬植 物(厚藤、甘薯)、菟絲子屬植物(日本菟絲子、南方菟絲子)的旋花科 植物，包含石竹屬植物(康乃馨等)、繁縷屬植物、米努草屬植物、巻耳 屬植物、漆姑草屬植物、無心菜屬植物、種阜草屬植物、孩兒參屬植物、 Honckenya屬植物、大爪草屬植物、擬漆姑屬植物、蠅子草屬植物、剪秋 蘿屬植物、女婁菜屬植物、狗筋蔓屬植物的石竹科植物，木麻黃科植物、 三白草科植物、胡椒科植物、金粟蘭科植物、楊柳科植物、楊梅科植物、 胡桃科植物、樺木科植物、山毛櫸科植物、榆科植物、?？浦参铩⑹n麻 科植物、川草科植物、山龍眼科植物、鐵青樹科植物、檀香科植物、槲 寄生科植物、馬兜鈴科植物、帽蕊草科植物、蛇恭科植物、蓼科植物、 藜科植物、莧科植物、紫茉莉科植物、假繁縷科植物、商陸科植物、番 杏科植物、馬齒莧科植物、木蘭科植物、昆欄樹科植物、連香樹科植物、 睡蓮科植物、金魚藻科植物、毛萊科植物、木通科植物、小檗科植物、 防己科植物、蠟梅科植物、樟科植物、罌粟科植物、山柑科植物、十字 花科植物、茅膏菜科植物、豬籠草科植物、景天科植物、虎耳草科植物、 海桐花科植物、金縷梅科植物、懸鈴木科植物、薔薇科植物、豆科植物、 酢漿草科植物、櫳牛兒苗科植物、亞麻科植物、蒺藜科植物、蕓香科植 物、苦木科植物、楝科植物、遠志科植物、大戟科植物、水馬齒科植物、 黃楊科植物、巖高蘭科植物、馬?？浦参?、漆樹科植物、冬青科植物、 衛(wèi)矛科植物、省沽油科植物、茶茱萸科植物、槭樹科植物、七葉樹科植 物、無患子科植物、清風藤科植物、鳳仙花科植物、鼠李科植物、葡萄 科植物、杜英科植物、椴樹科植物、錦葵科植物、梧桐科植物、獼猴桃科植物、山茶科植物、金絲桃科植物、溝繁縷科植物、檉柳科植物、堇 菜科植物、刺籬木科植物、旌節(jié)花科植物、西番蓮科植物、秋海裳科植 物、仙人掌科植物、瑞香科植物、胡頹子科植物、千屈菜科植物、石榴 科植物、紅樹科植物、八角楓科植物、野牡丹科植物、菱科植物、柳葉 菜科植物、小二仙草科植物、杉葉藻科植物、五加科植物、傘形科植物、 山茱萸科植物、巖梅科植物、山柳科植物、鹿蹄草科植物、杜鵑科植物、 紫金牛科植物、報春花科植物、藍雪科植物、柿樹科植物、山礬科植物、 野茉莉科植物、木樨科植物、醉魚草科植物、龍膽科植物、夾竹桃科植 物、蘿摩科植物、花葸科植物、紫草科植物、馬鞭草科植物、唇形科植 物、茄科植物(番茄等)、玄參科植物、紫葳科植物、胡麻科植物、列當 科植物、苦苣莒科植物、貍藻科植物、爵床科植物、苦檻藍科植物、透 骨草科植物、車前科植物、茜草科植物、忍冬科植物、五?；浦参铩?敗醬科植物、川續(xù)斷科植物、葫蘆科植物、桔梗科植物、菊科植物等。
另外，本發(fā)明中包含用于培育糖度提高的植物體的試劑盒(以下稱 為"本發(fā)明涉及的試劑盒，，)。本發(fā)明涉及的試劑盒只要具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi) 氧化還原狀態(tài)的物質(例如，谷胱甘肽、編碼Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶 的多核香酸、或編碼谷胱甘肽結合性質體型果糖-1， 6-二磷酸醛縮酶的 多核苦酸)即可。另外，本發(fā)明涉及的試劑盒，也可具有這些物質以外 的其它成分。調(diào)劑細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質以及上述的其它成分，可 以以其適當容量和/或形態(tài)包含在一個容器中來提供，也可以用分別的容 器來提供。另外，也可具有用于培育植物的器具、培養(yǎng)基等。另外，當 本發(fā)明涉及的試劑盒具有上述的多核苷酸時，可將作為使該多核苷酸進 行表達的表達型載體的母體載體，置入與該多核苷酸不同的容器中；也 可預先備有插入了該多核苷酸的該載體。另外，也可備有在已知的植物 轉化方法中使用的試藥等。
<2.本發(fā)明涉及的糖度提高的植物體的培育方法〉
本發(fā)明涉及的糖度提高的植物體的培育方法(以下稱為"本發(fā)明涉 及的培育方法")只要含有用調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質(例如，谷 胱甘肽、編碼y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸、或編碼谷胱甘肽結合性質體型果糖-1, 6-二磷酸醛縮酶的多核苷酸)栽培植物體的工序即 可。
作為上述工序，例如，作為細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)，只要在使 用通過與植物接觸能夠被植物吸收的物質時，該物質能被該植物吸收即 可。對于使調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質被植物吸收的方法沒有特別 的限定，例如，可以通過使用含有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質的培
養(yǎng)基(含土壤以及土壤改良劑)栽培植物，使其由根吸收；也可以在栽 培植物的期間將調(diào)解細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質噴霧、涂布，令植物體 吸收該物質。另外，也可以使調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質吸附在離 子交換樹脂等吸附物質上，將其埋進土壤中等，置于培養(yǎng)基中，在上述 工序的基礎上栽培該纟直物體。
另外，例如，作為細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)，使用導入植物基因 組中的物質、如上述的多核苷酸時，也可以不是使其被植物吸收，而是 預先導入植物中進行轉化，培育得到的轉化植物。關于將多核苷酸導入 植物的方法，遵照上述的本發(fā)明組合物的說明。
通過本發(fā)明涉及的培育方法得到的植物體也是本發(fā)明的范圍。通過 檢測調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質在植物體中的量和比例的至少其中 一項，能夠對所述植物體進行簡易的檢測，從而能夠將其與由本發(fā)明的 方法之外的方法得到的植物體明確的區(qū)別開來。除了檢測該物質的量 濃 度的方法，例如，還能夠通過用DNA微陣列等對基因表達模式比較來進 行檢測。使用GSSG作為該物質時，例如，預先檢測施用GSSG栽培的植 物體的基因表達模式，與其它方法栽培的植物體的基因表達模式進行比 較，預先確定施用GSSG時的特有的表達模式(GSSG表達模式)。然后， 檢測作為檢測對象的植物體的表達模式，通過與上述GSSG表達模式進行 比較，能夠簡便地進行檢測。進一步，作為其它的實例，通過與由谷胱 甘肽結合蛋白質的二維電泳圖像預先檢測的模式變化進行比較，能夠判 斷是否施用了 GSSG。另外，當使用上述多核苷酸時，通過PCR法、Southern 雜交法、Northern雜交法等確認植物體內(nèi)的該多核苷酸，從而能夠將本 發(fā)明涉及的植物體與其它的植物區(qū)別開來。
18以下示出了實施例，對本發(fā)明的實施方案進行更為詳細的說明。當 然，本發(fā)明并不局限于以下的實施例，在細節(jié)上有各種各樣的方案是可 能的，這一點是不言而喻的。進一步，本發(fā)明并不限定于上述的實施方 案，在權利要求的范圍內(nèi)進行各種各樣的變動是可能的，將各個公開的 技術方案進行適當?shù)慕M合從而得到的實施方案也包含在本發(fā)明的技術的 范圍內(nèi)。另外，引用本說明書中記載的文獻的全部內(nèi)容，作為本發(fā)明書 中的參考。
實施例
〈實施例1.番茄的培育〉
在本實施例中，使用GSSG或GSH培育了番茄。具體如下所述。
首先，將番茄苗(瀧井(TAKII)種苗社制，品名王樣番茄麗夏) 移栽在水耕栽培用盆中(1/2000公畝)。在水耕栽培用盆內(nèi)，層積下層蛭 石(旭工業(yè)抹式會社制)6L、中層吳羽園藝培土 (林式會社吳羽(KUREHA) 制)3L、上層蛭石3L。
在培育番茄的期間，每抹每周在根部施用2次0. 5mM GSSG或0. 5mM GSH(用0. 1N NaOH調(diào)整至pH7),每次50ml，不摘芽，培育60天。另外， 最后的十天作為收獲果實的對象期間。另外，為了進行比較，除了 GSSH 和GSH都不施用之外，在相同條件下培育番茄。并且，在任何一種條件 下，作為追肥，每2周施用1次組合(KUMIAI)磷硝安加里(phosphorate ammonium nitrate potassium) S-604號(TISS0旭月巴泮牛沖朱式會it制)3g。
然后，針對收獲的果實的糖度等進行味覺測試。結果證實，與GSSG 和GSH都不施用時相比，施用了 GSSG得到的果實中糖度增加。另外證實 了果實數(shù)量的增加。證實了施用了 GSH得到的果實中糖度增加。另外證 實了酸p木的增加。
由以上的結果示出了，通過使用含GSSG、 GSH的培養(yǎng)基培育番茄， 能夠培育糖度增加的番茄。
<實施例2.糖度的測定〉
用實施例1中描述的方法施用GSSG或GSH培育番茄。施用口袋糖度計APAL-1 (林式會社愛宕)測定了得到的果實的糖度。
另外，為了進行比較，在2種條件下培育了番茄。分別記為"Cont"、 "Cont2Sunny"。在Cont中，除了 GSSG和GSH都沒有施用之外，用與實 施例1相同的方法培育番茄。在Con12Sunny中，GSSG和GSH都沒有施用， 為了使照度達到100%,以單林獨立種植的方式培育以使其充分接受陽光。 并且，施用了 GSSG或GSH的林系以及Cont中，分別以抹間間隔40cm-50cm 種植。因此，植抹有時會遮住其他植抹接受的光，從而使這些植抹照射 到的光的照度低于100%。
并且，在施用GSSG的條件、施用GSH的條件、Cont的條件下各培育 3抹，在Cont2Sunny的條件下培育1抹。
結果示于圖1和圖2中。圖1示出了在本實施例中得到的番茄果實 的糖度的測定結果，縱軸表示糖度(Brix，單位％)，橫軸表示培育條 件。另外，圖1中的"*"，表示在上述對象期間內(nèi)沒有得到果實。圖2 示出了將圖一中示出的糖度的測定結果通過AN0VA解析后的結果，縱軸 表示糖度，橫軸表示培育條件。另外，圖2中各個數(shù)據(jù)柱上記錄的字母 文字，表示在AN0VA解析的分組中屬于同組。并且，使用StatView5. 0 (SAS Institute Inc.制)進行AN0VA分析，以顯著差異水平5%來檢驗判 定。
如圖1和圖2所示，在施用了 GSSG或GSH的條件下得到的番茄果實， 不用說與Cont相比，就是與充分照射了陽光的番茄果實相比，其糖度也 有了明顯的提高。其中，施用了 GSSG的植抹得到了極高糖度的番茄。
<實施例3.甜玉米的培育〉
在本實施例中培育了甜玉米。具體而言，首先將甜玉米(瀧井種苗 社制，產(chǎn)品號堪培拉90)的種子播種在蛭石中(旭工業(yè)林式會社制)。 播種2周后，移栽到實施例1中所述的水耕栽培用盆中，作為追肥，在4 周后和6周后分別施用組合磷硝安加里S-604號3g。
另夕卜，從播種后第五周開始，在2周內(nèi)在根部施用0. 2mMGSSG4次， 每次50ml。從播種后第7周開始，在2周內(nèi)經(jīng)葉片散布0. 2mMGSSG4次， 每次50ml，并且，為了進行比較，除不施用GSSG之外，用與本實施例相播種90天后收獲果實，對甜度進行了味覺測試。結果證實，施用GSSG 進行培育得到的果實，與不施用GSSG進行培育得到的果實相比，糖度增 加。另外證實，在施用了 GSSG的情況下，果實更為肥碩，果實的數(shù)量增 加。
<實施例4.甜玉米的培育2>
在本實施例中，在與實施例3不同的條件下施用GSSG來培育甜玉米。 具體而言，首先，將甜玉米(瀧井種苗社制，產(chǎn)品號堪培拉90)的種 子播種在蛭石中(旭工業(yè)抹式會社制)。播種1周后，移栽到實施例1中 所述的水耕栽培用盆中，作為追肥，在4周后和6周后分別施用組合磷 硝安加里S-604號3g。
另外，從發(fā)芽后起12周內(nèi)，每周在根部施用0. 5mM GSSG 2次，每 次200ml。并且，為了進行比較，除不施用GSSG之外，用與本實施例相 同的方法培育甜玉米并收獲果實。
播種后12周后收獲果實，對糖度進行味覺測試。結果證實，使用GSSG 進行培育得到的果實，與不施用GSSG進行培育得到的果實相比，糖度增 加。另外證實，在施用了 GSSG的情況下，果實更為肥碩，果實的數(shù)量增 加。
<實施例5.葡萄的培育>
在本實施例中培育了葡萄。具體而言，在葡萄(特拉華)開花之后， 立即將混合了 lmM的赤霉素(GA3)和lmM的各種試劑的溶液施于花序上。 分別使用GSSG、 GSH作為各種試劑。隨后，在涂布了各種試劑之后，收 獲結出的果實。另外，為了進行比較，除了不使用上述各種試劑而僅施 用GA3之外，用同樣的方法培育葡萄，收獲果實用于以下的味覺測試。
然后，對收獲的果實的糖度進行味覺測試。結果證實，與僅施用GA3 進行培育得到的果實相比，施用了GSSG和GA3、 GSH和GA3進行培育得 到的果實，兩者糖度都增加。另外證實，在施用GSSG和GA3的情況下， 果實更為肥碩。
另夕卜，在使用GSSG或GSH的情況下，證實了當不使用GA3培育葡萄時，糖度增加。并且，在不使用GA3的情況下，無籽的效果受到了抑制。 <實施例6.調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原的物質添加后的經(jīng)時變化〉 在本實施例中，測定了在將調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質施于植 物之后的該植物中的糖度。使用GSH、 GSSG作為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀 態(tài)的物質。另外，植物使用與實施例1中使用的植物相同的番茄。具體 而言，進行以下操作。
播種番茄種子之后，在90天后用GSH或GSSG進行處理。對于培育 番茄的方法，除了用GSH或GSSG處理之外，用與實施例l中所述的方法 相同的方法進行。所述用GSH或GSSG進行的處理為，每抹在根部施用1 次0. 5mM GSSG或0. 5mM GSH (用0. 1N NaOH調(diào)整至pH7) 50ml。然后，在 施用后第0天-第4天每天收獲果實，測定其糖度。結果示于圖3。圖3 示出了從GSSG或GSH處理日起經(jīng)過的天數(shù)與糖度的關系經(jīng)證實的結果， 縱軸表示糖度(Brix,單位％),橫軸表示從處理日起的天數(shù)。另外， 在圖3中的圓形記號表示施用了 GSH的結果，三角形記號表示施用了 GSSG 的結果，四邊形記號表示用于進行比較的GSSG和GSH都沒有施用時的結 果。并且，GSSG或GSH的施用在第0天的早上進行，在圖3中第0天的 結果表示的是在第0天的晚上進行的果實的收獲和糖度的測定的結果。 如圖3所示，通過施用GSSG或GSH,能夠迅速地提高果實的糖度。 <實施例7.導入了 GSH1基因的植物的培育〉
在本實施例中，使用經(jīng)克隆的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基因作為調(diào) 節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質。它是具有序列號3中示出的序列的多核 苷酸，是GSH1基因之一，在本實施例中簡記為"GSH1基因"。
(1 )使用的植物
作為用于制作轉化體的親本植物，使用野生型擬南芥的Columbia (Col-0)。在正方形的塑料盆(6. 5 x 6. 5 x 5cm)中分三層放入土壤，從盆 底開始為蛭石(旭工業(yè)，閃山)、吳羽培養(yǎng)土 (吳羽園藝培土，吳羽化學， 東京)、蛭石，比例為2: 1: 1;將植物播種在該土壤中，在培育溫度22 。C、長日條件下(16小時明期/8小時暗期)培育。
(2) GSH1基因的克隆、GSH1基因的改變、以及GSH1轉化體的培育分離提純來自3周齡的擬南芥野生型Columbia (Col-0)的全RNA, 用Prostar first strand RT-PCR試劑盒(Stratagene， UJolla， CA， USA)合成cDNA。
然后，使用基于GSH1基因的cDNA序列設計的以下特異性引物將完 整長度的cDNA作為2個片段通過PCR擴增，在pGEM-T Easy載體 (Promega， Madison， WI， USA)中亞克隆各片段。在引物GSHl_5，-3和 GSH1_3，-2上，在導入用于植物轉化的雙元載體pBI121時，分別插入 必要的Xbal和SacI切割位點。
GSH1 —5，-3: 5，-GCTTTCTTCTAGATTTCGACGG-3，(序列號10) GSHl — 3，-3: 5，-CCTGATCATATCAGCTTCTGAGC-3，(序列號11) GSHl_5，-2: 5，-ATGCCAAAGGGGAGATACGA-3，(序列號12) GSHl_3，-2: 5，-GGAGACTCGAGCTCTTCAGATAG-3，(序列號13) 將2個片段在Kpnl切割位點融合，構建含完整長度的cDNA的載體 (Chl.GSHl-pGEM)。用限制酶Xbal和Sacl處理Chi. GSHl-pGEM后，將片 段與雙元載體pBI121的花椰菜花葉病毒的35S啟動子的下游的P-葡萄 糖苷酸酶的編碼區(qū)置換，做成用于培育轉化植物的構建體(35S-Chl. GSHl-pBI121 )。
另外，在擬南芥基因組中，GSH1基因僅存在1個拷貝，且含有向葉 綠體的轉運信號。因此，為了在細胞質中積蓄GSH1基因產(chǎn)物(y-谷氨 酰半胱氨酸合成酶)，制作了表達除去推斷為葉綠體轉運信號的N末端73 個氨基酸且將從N端起第74個的丙氨酸殘基置換為曱硫氨酸殘基的蛋白 質的構建體(35S-cyt.GSHl-pBI121)。首先，將以下示出的從N端起第 74個的丙氨酸殘基置換為曱硫氨酸殘基，使用在所述第74個氨基酸的上 游插入了 Xbal切割位點(堿基置換位點用下劃線表示)的引物 GSHl(cyt.)-5'和上述的GSHl — 3'-3進行PCR,用限制酶XbaI和Kpnl處理 片革殳后，在pBluescript載體(Stratagene， La Jolla， CA USA)中亞克 隆(cyt.GSH卜pBS)。
GSH1 (cyt.) _5，: 5，-AGGGCATCTAGAGACCATGGCAAGTCC-3，(序列號14 ) 將cyt.GSHl-pBS用限制酶Xbal和Kpnl處理后，將片段與35S-Chl.GSHl-pBI121的GSH1上的XbaI-K叩I片段置換，構建35S-cyt. GSH1-pBI121。
將按照上述內(nèi)容構建的35S-Chi. GSH1-pBI121和35S-cyt. GSH1-pBI121的2種表達型載體用農(nóng)桿菌法(《Floral dip法 一種農(nóng)桿菌 介導轉化擬南芥的簡化方法》(Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thalia-na), Clough, S. J.和SHI-pB Bent，A. F.著，發(fā)表于Plant J. 1998年 第16期第735-743頁)導入Col-O,培育了轉化植物。
具體而言，在含有作為選擇標記的卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基(1/2 倍濃度的Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基)上反復選才奪，直至得到所有的 種子均顯示出卡那霉素耐性的世代(不發(fā)生分離的世代)。另外在選擇 的過程中，卡那霉素耐性的性狀以3: l的比例發(fā)生分離，證實了表達 型載體已導入到至少單獨一條染色體上。
按照以上的描述得到的植物，以下記為"35S-GSHl"。
(3)糖度的測定
在生育光(growth light)強度50或500 p Em_2s—1的條件下培育 35S-GSHl和用于進行比較的野生型擬南芥(Col-0)。培育一周后，采 摘植物體。然后，用液氮凍結采摘的植物體后，磨碎成粉末狀，每50mg 植物體用100 ja 1的50mM醋酸鈉緩沖液提取。
然后，測定了得到的提取物中的葡萄糖和淀粉的量。葡萄糖量的 測定用葡萄糖CII-Test Wako (和光純藥社制)進行。另外，對于淀 粉量的測定，將淀粉葡聚糖酶35Units/ml及醋酸鈉緩沖液 (50mM，pH4. 5)與提取物混合，靜置1小時后，測定葡萄糖的量。結果 示于圖4。圖4示出了 35S-GSH1的淀粉和葡萄糖的測定結果，圖4(a) 示出了淀粉量，圖4 (b)示出了葡萄糖量。另外，在圖4 (a)和(b) 中，縱軸分別表示淀粉和葡萄糖的相對含量，橫軸表示使用的植物的 種類。在橫軸中A和B表示35S-GSH1。即，在本實施例中用圖4中表 示為A和B的2抹35S-GSH1進行試驗。另外，上述的相對含量意為， 將在生育光強度50|aEm—2s—^々條件下培育的Col-0的結果計為100時的相對量。
如圖4所示，35S-GSH1與Col-O相比，顯示了高淀4分量和^f唐度。 <實施例8.櫻桃的培育〉
在本實施例中培育了櫻桃。具體而言，在櫻桃預計的收獲日的4 周之前和3周之前，在預計收獲果實的結果枝條的葉片表面涂布0. 5mM 的GSSG，在預計日收獲果實。
然后，對收獲的果實的糖度進行味覺測試。結果證實，施用GSSG 進行培育得到的果實糖度增加且酸度降低。另外證實，在施用了GSSG 的情況下，果實重量增加。進一步，用口袋糖度計APAL-1 (抹式會社 愛宕制)測定了得到的果實的糖度。圖5示出了本實施例中得到的櫻 桃果實的糖度的測定結果，縱軸表示糖度(Brix,單位％)。并且， 4吏用StatView5. 0 ( SAS Institute Inc.制)進4亍AN0VA分4斤，以顯著差 異水平5%來纟全驗判定，證實存在顯著差異。
如上所述，通過施用GSSG得到了糖度顯著提高的櫻桃果實。
<實施例9.溫州蜜柑的培育〉
在本實施例中培育了溫州蜜柑。具體而言，在溫州蜜柑預計的收獲 曰的1周之前，在預計收獲果實的結果枝條的葉片表面涂布0. 5mM的 GSSG,在預計日收獲果實。
然后，然后，對收獲的果實的糖度進行味覺測試。結果證實，施 用GSSG進行培育得到的果實糖度增加且酸度降低。另外證實，在施用 了 GSSG的情況下，果實重量增加。進一步，用口袋糖度計APAL-1 (林 式會社愛宕制)測定了得到的果實的糖度。并且，也對用于進行比較 的在未施用GSSG的條件下得到的果實測定了糖度。圖6示出了本實施 例中得到的溫州蜜柑果實的糖度的測定結果，縱軸表示糖度(Brix, 單位％)。并且，使用StatView5.0(SAS Institute Inc.制)進行ANOVA 分析，以顯著差異水平5%來檢驗判定，證實存在顯著差異。
如上所述，通過施用GSSG得到了糖度顯著提高的溫州蜜柑果實。
<實施例IO.草莓的培育〉
在本實施例中，施用GSSG或GSH培育了草莓。具體如下所述。首先，將草莓苗移栽到盆中，在盆中層積下層蛭石(旭工業(yè)林式會社
制)6L、中層吳羽園藝培土 (抹式會社吳羽制)3L、上層蛭石3L。
在培育草莓的期間，每抹每周在根部施用1次50ml的0. 2mM或0. 5mM 的GSSG或者0. 4mM或1. OmM的GSH (用0. 1N NaOH調(diào)整為pH7 ),不摘芽， 培育63天。另外，為了進行比較，除了 GSSG和GSH都不施用之外，在 相同條件下培育草莓。并且，在任一條件下，作為追肥，每2周施用1 次組合磷硝安加里S-604號(TISSO旭肥料抹式會社制)3g。
然后，對收獲的果實的糖度等進行味覺測試。結果證實，與GSSG和 GSH都沒有施用的情況相比，施用了 GSSG得到的果實中糖度增加且算為 降低。另外證實了果實數(shù)量增加。證實了在施用了 GSH得到的果實中糖 度和酸p未都增加。
進一步，用口袋糖度計APAL-1 (林式會社愛宕制)測定了得到的果 實的糖度。并且，也對用于進行比較的在GSSG和GSH均未施用的條件下 得到的果實測定了糖度。圖7示出了本實施例中得到的草莓果實的糖度 的測定結果，縱軸表示糖度(Brix,單位％)。并且，使用SUtView5.0 (SAS Institute Inc.制)進行ANOVA分析，以顯著差異水平5°/。來檢驗判 定，^i正實存在顯著差異。
由以上的結果顯示，通過使用含有GSSG、 GSH的培養(yǎng)基培育草莓， 能夠培育糖度增加的草莓果實。
<實施例ll.甜玉米的培育〉
在本實施例中培育了甜玉米。具體而言，首先將甜玉米(瀧井種苗 社制，產(chǎn)品號堪培拉86)的種子播種到蛭石上(旭工業(yè)林式會社制)。 播種2周后，移栽到實雄例1中所述的水耕栽培用盆中，作為追肥，在4 周后和6周后分別施用組合磷硝安加里S-604號3g。
另外在播種后第5周、第6周、第7周、第8周在葉片表面散布0. 5mM GSSG (溶解于作為鋪展劑的0. l°/。Tween80)。并且，為了進行比較，除了 不施用GSSG而施用Tween80作為代替之外，用與本實施例相同地方法培 育甜玉米并收獲果實。
播種86天后收獲果實，對糖度進行味覺測試。結果證實，施用GSSG進行培育得到的果實，與未施用進行培育得到的果實相比，糖度增加。
進一步，用口袋糖度計APAL-1 (抹式會社愛宕制)測定了得到的果實的 糖度。并且，也對用于進行比較的未施用GSSG的條件下得到的果實測定 了糖度。圖8示出了本實施例中得到的甜玉米果實的糖度的測定結果， 縱軸表示糖度(Brix,單位％ )。并且，使用StatView5. O(SAS Institute Inc.制)進行AN0VA分析，以顯著差異水平5%來4企驗判定，證實存在顯 著差異。
另外證實，在施用GSSG的情況下，果實更為月巴碩，果實數(shù)量增加。 進一步證實，施用了 GSSG的甜玉米果實在播種后第70天就可以收獲了。
由以上的結果顯示，通過使用含有GSSG的培養(yǎng)基培育甜玉米，能夠 培育糖度增加的草莓果實。
本發(fā)明涉及的用于培育糖度提高的植物體的組合物，由于含有調(diào)節(jié) 細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質，起到了能夠簡便地培育糖度提高的植物體 的效果。
明本發(fā)明的技術內(nèi)容，不應僅局限于這些具體實例來狹義地解釋本發(fā)明 的技術內(nèi)容，在本發(fā)明的精神實質和以下所述的權利要求的范圍內(nèi)是可 以做出各種變動來實施的。
產(chǎn)業(yè)上的實用性
由于通過使用本發(fā)明涉及的組合物，能夠容易地培育糖度提高的植 物，因此本發(fā)明涉及的組合物能夠用于農(nóng)業(yè)、食品業(yè)等產(chǎn)業(yè)。另外，由 于由糖度高的植物能夠高效率地制造酒精，因此能夠在能源產(chǎn)業(yè)等大范 圍的產(chǎn)業(yè)中利用本發(fā)明的組合物。
2權利要求
1.一種用于培育糖度提高的植物體的組合物，其特征在于，所述組合物含有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質(但過氧化氫除外)。
2. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧 化還原狀態(tài)的物質為谷胱甘肽、編碼Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷 酸或編碼谷胱甘肽結合性質體型果糖-1, 6-二磷酸醛縮酶的多核苷酸。
3. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧 化還原狀態(tài)的物質為氧化型谷胱甘肽。
4. 一種用于培育糖度提高的植物體的試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質(但過氧化氫除外)。
5. —種糖度提高的植物體的培育方法，其特征在于，所述培育方法 含有使用調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質(但過氧化氫除外)栽培植物 體的工序。
6. —種植物體，其特征在于，所述植物體是通過權利要求5所述的 培育方法得到的。
全文摘要
本發(fā)明涉及的一種用于培育糖度提高的植物體的組合物含有谷胱甘肽、編碼γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸或編碼谷胱甘肽結合性質體型果糖-1，6-二磷酸醛縮酶的多核苷酸。優(yōu)選含有氧化型谷胱甘肽。由此提供了用于簡便地培育糖度提高的植物的組合物。
文檔編號A01G7/06GK101686669SQ200880018279
公開日2010年3月31日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權日2007年11月13日
發(fā)明者小川健一 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構