專利名稱：用于殺死細(xì)胞的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于殺死細(xì)胞的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于殺死活的靶細(xì)胞或者破壞所述細(xì)胞之關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持所述細(xì)胞環(huán)境之pH的組合物和方法。

背景技術(shù)：
已知多種形式的細(xì)胞對(duì)人體有害以及可能致命。例如，在美國(guó)，癌細(xì)胞是繼心臟病之后的第二大死因(Boring等，(1993)，CA CancerJournal for Clinicians 437)。細(xì)胞微生物也會(huì)引起許多疾病。在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中已對(duì)靶向性和選擇性殺死細(xì)胞(例如癌細(xì)胞和病原細(xì)菌)進(jìn)行了廣泛的研究。
微生物可侵入宿主組織并增殖，引起嚴(yán)重的疾病癥狀。病原細(xì)菌已被證實(shí)為多種衰竭性疾病或致命性疾病的根本原因，所述疾病包括例如結(jié)核病、霍亂、百日咳、鼠疫等。為了治療這樣的嚴(yán)重感染，施用殺死感染原的藥物(例如抗生素)。然而，病原細(xì)菌常常會(huì)產(chǎn)生針對(duì)抗生素的抗性，因此需要對(duì)藥物進(jìn)行改進(jìn)以防止此類微生物感染的傳播。
感染是許多侵入性手術(shù)、治療和診斷操作的常見(jiàn)并發(fā)癥。就涉及植入式醫(yī)療裝置的操作而言，避免感染可能尤其困難，這是因?yàn)榧?xì)菌可形成保護(hù)微生物免遭受試者免疫系統(tǒng)清除的生物膜(biofilm)。由于這些感染難以利用抗生素進(jìn)行治療，因此常需要取出所述裝置，這對(duì)于患者而言是創(chuàng)傷性的并增加了醫(yī)療成本。
由于對(duì)消除基于生物膜的感染相關(guān)的困難有了很好的認(rèn)識(shí)，因此已開(kāi)發(fā)了多種技術(shù)來(lái)處理表面或浸浴表面之流體以防止或破壞生物膜的形成。生物膜對(duì)醫(yī)療系統(tǒng)以及公眾健康必不可少的其它系統(tǒng)(例如供水設(shè)備和食物生產(chǎn)設(shè)備)產(chǎn)生不利的影響。已提出了多種利用有機(jī)或無(wú)機(jī)材料處理表面以干擾生物膜形成的技術(shù)。例如，已應(yīng)用多種利用抗生素(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利4,107,121、4,442,133、4,895,566、4,917,686、5,013,306、4,952,419、5,853,745和5,902,283)和其它抑菌化合物(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利4,605,564、4,886,505、5,019,096、5,295,979、5,328,954、5,681,575、5,753,251、5,770,255和5,877,243)來(lái)涂覆醫(yī)療裝置之表面的方法。
盡管已有這些技術(shù)，然而醫(yī)療裝置污染以及由此引起的侵入性感染仍舊是個(gè)大問(wèn)題。
盡管做出大量的努力來(lái)保持無(wú)菌，但在醫(yī)療環(huán)境中感染性生物仍是普遍存在的。這些生物的存在可導(dǎo)致住院患者和醫(yī)護(hù)人員的感染。這些感染(稱為“醫(yī)源性感染”)常涉及比在醫(yī)院外遇到的生物毒力更強(qiáng)、更罕見(jiàn)的生物。此外，醫(yī)源性感染更有可能涉及已對(duì)多種抗生素產(chǎn)生抗性的生物。盡管在常規(guī)情況下采用清潔和抗菌方案，但是感染性生物很容易在醫(yī)療環(huán)境中的多種表面(尤其是暴露于潮濕環(huán)境或浸沒(méi)在流體中的表面)上定植。甚至屏障材料(例如手套、圍裙和護(hù)罩)也可將感染傳播給佩帶者或醫(yī)療環(huán)境中的其他人。盡管進(jìn)行了滅菌和清潔，然而醫(yī)療環(huán)境中的許多金屬和非金屬材料仍可殘存有受到生物膜保護(hù)的危險(xiǎn)生物，從而傳播給其他宿主。
用于破壞醫(yī)療環(huán)境中生物膜形成的任何藥劑對(duì)使用者來(lái)說(shuō)必須是安全的。某些采用足以干擾生物膜的量的殺生物劑也可損傷宿主組織。引入局部組織區(qū)域的抗生素可誘導(dǎo)形成抗性生物，而后這些抗性生物可形成生物膜群落，其中的游走型微生物同樣會(huì)對(duì)特定抗生素產(chǎn)生抗性。此外，任何抗生物膜藥劑或抗污垢劑一定不能干擾醫(yī)療裝置的有助健康的特性。選擇某些具有特定類型的操作者可操作性、柔軟度、水不透性、抗張強(qiáng)度或耐壓縮性的材料，所述性質(zhì)不能被為了抗微生物作用而添加的藥劑所改變。另一個(gè)問(wèn)題是，被添加到植入性裝置表面上以抑制污染和生物膜形成的物質(zhì)有可能會(huì)導(dǎo)致血栓。
生物膜形成具有重要的公共健康影響。已知飲用水系統(tǒng)藏納著生物膜，即使這些環(huán)境通常含有消毒劑。任何提供表面和液體之間界面的系統(tǒng)均有可能形成生物膜。眾所周知，空調(diào)的水冷卻塔由于形成生物膜而給公共健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，不定期爆發(fā)感染(例如軍團(tuán)病)即是證據(jù)。已在流動(dòng)管道(例如血液透析管)和配水管道中鑒定出生物膜。還證實(shí)，即便用高達(dá)200ppm的氯氣進(jìn)行處理，生物膜仍能在所選的市政儲(chǔ)水罐、私人井和滴灌系統(tǒng)中引起生物污垢。
在食品加工環(huán)境中生物膜是一個(gè)長(zhǎng)期令人困擾的問(wèn)題。食品加工涉及流體、固體物質(zhì)及其組合。例如，奶加工設(shè)備提供了流體管道和流體停留在表面上的區(qū)域。目前，清潔擠奶設(shè)備和奶加工設(shè)備在氣攜式原位清潔方法中利用機(jī)械、熱和化學(xué)處理的相互作用。此外，用巴氏消毒法對(duì)奶產(chǎn)品本身進(jìn)行處理。在奶酪生產(chǎn)中，生物膜可導(dǎo)致車達(dá)奶酪(Cheddar cheese)中產(chǎn)生乳酸鈣。肉類加工和封裝設(shè)備同樣容易形成生物膜。非金屬和金屬表面均可受到影響。在肉類加工設(shè)備的橡膠“手指”(rubber“finger”)、塑料簾幕、傳送帶材料、取內(nèi)臟設(shè)備和不銹鋼表面上檢測(cè)到生物膜?？刂剖称芳庸ぶ械纳锬ず臀⑸镂廴臼艿剿迷噭┎荒苡绊懏a(chǎn)品的味道、口感或觀感等其它需求的阻礙。
因此，需要能夠?qū)σ话惚砻孢M(jìn)行殺菌。能殺死有害微生物的材料引起人們極大的興趣?？墒褂眠@樣的材料涂覆日常生活中人們所接觸的常見(jiàn)物體(例如門把手、兒童玩具、計(jì)算機(jī)鍵盤(pán)、電話、織物、醫(yī)療裝置等)的表面以對(duì)它們進(jìn)行消毒，從而不能傳播細(xì)菌感染。由于普通材料不能抗微生物或殺死細(xì)胞，因此需要對(duì)它們進(jìn)行改進(jìn)。例如，用聚乙二醇和某些其它合成聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾的表面可驅(qū)除(盡管不能殺死)微生物(Bridgett，M.J.等，(1992)Biomaterials 13，411-416；Arciola，C.R.等Alvergna，P.，Cenni，E.& Pizzoferrato，A.(1993)Biomaterials14，1161-1164；Park，K.D.，Kim，Y.S.，Han，D.K.，Kim，Y.H.，Lee，E.H.B.，Suh，H.&Choi，K.S.(1998)Biomaterials 19，51-859)。
或者，可使用抗微生物劑(例如抗生素、季銨化合物、銀離子或碘)來(lái)浸漬材料，所述抗微生物劑隨時(shí)間逐漸釋放到周圍溶液中并殺死其中的有害細(xì)胞和微生物(Medlin，J.(1997)Environ.Health Preps.105，290-292；Nohr，R.S.& Macdonald，G.J.(1994)J.Biomater.Sci.，Polymer Edn.5，607-619Shearer，A.E.H.等(2000)Biotechnol.Bioeng67，141-146)。盡管這些策略已在含有細(xì)菌的水溶液中得到證實(shí)，但是在不存在液體介質(zhì)的情形下預(yù)計(jì)它們不能有效抗御空氣傳播的細(xì)菌。對(duì)于基于釋放的物質(zhì)而言這尤其正確，當(dāng)釋出的抗菌劑耗盡時(shí)所述基于釋放的物質(zhì)即變?yōu)闊o(wú)效。
已開(kāi)發(fā)了一般的表面涂覆/衍生化方法，其可適用于大多數(shù)材料而無(wú)需考慮材料的性質(zhì)。
存在具有固有的抗微生物或抗靜電性質(zhì)的聚合物。這樣的聚合物可與多種基質(zhì)(例如玻璃、織物、金屬、纖維素材料、塑料等)聯(lián)用以提供具有抗微生物和/或抗靜電性質(zhì)的基質(zhì)。此外，所述聚合物也可以與其它聚合物相組合以提供具有抗微生物和/或抗靜電性質(zhì)的其它聚合物。
然而，還需要兼具可持續(xù)性和相容性并且用于多種聚合物材料和基質(zhì)上以及與其一起使用的此類試劑。已表明多種添加劑和聚合物體系具有抗微生物性質(zhì)。參見(jiàn)，例如Byck的美國(guó)專利3,872,128；Blakely等人的美國(guó)專利5,024,840；Malrose等人的美國(guó)專利5,290,894；Ottersbach等人的美國(guó)專利5,967,714、6,203,856和6,248,811；Klasse等人的美國(guó)專利6,194,530；Siddiqui等人的美國(guó)專利。
然而，仍需要向多種基質(zhì)和材料提供可持續(xù)性細(xì)胞殺死性質(zhì)的潛在毒性較低的聚合物組合物。
眾所周知，溶液中帶電分子能夠殺死細(xì)菌(Endo等，1987；Fidai等，1997；Friedrich等，2000；Isquith等，1972)。然而，最近已認(rèn)識(shí)到，結(jié)合于表面的電荷可通過(guò)接觸而殺死細(xì)菌，并且均具有陽(yáng)離子(正電荷)基團(tuán)，例如季銨(Thome等，2003)或鏻(Kanazawa等，1993；Popa等，2003)。已測(cè)試了多種結(jié)構(gòu)自組裝單層(Atkins，1990；Gottenbos等，2002；Rondelez & Bezou，1999)、聚電解質(zhì)層(Lee等，2004；Lin等，2002，2003；Popa等，2003；Sauvet等，2000；Thome等，2003；Tiller等，2001)以及超枝化樹(shù)枝狀聚合物(hyperbranched dendrimer)(Cen等，2003；Chen & Cooper，2000，2002)。該方法的重要優(yōu)點(diǎn)是殺生物分子與基質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，使得其能在清潔過(guò)程后再次利用并防止物質(zhì)向環(huán)境中失控釋放。然而，殺生物過(guò)程中所涉及作用的關(guān)鍵參數(shù)尚未闡明。
近來(lái)，Kügler等(2005)報(bào)道了存在這樣的電荷密度閾值，在該電荷密度閾值以上，當(dāng)細(xì)菌被吸附至帶有陽(yáng)離子季銨基團(tuán)的基底上時(shí)迅速發(fā)生死亡。其作者通過(guò)兩種不同的方法將季銨化聚乙烯基吡啶鏈接枝到玻璃表面上，并改變有機(jī)層內(nèi)的外層電荷密度(outer-layer chargedensity，OLCD)，使其在1012至1016個(gè)正電荷/cm2之間。對(duì)它們的測(cè)量表明該參數(shù)對(duì)殺傷效率具有很大影響。在閾值以上時(shí)，在靜止?fàn)顟B(tài)下細(xì)菌在10分鐘內(nèi)即發(fā)生死亡。對(duì)于生長(zhǎng)狀態(tài)下的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，OLCD值要低10倍至100倍。其還取決于細(xì)菌類型，他們觀察到在高度分裂條件下大腸桿菌(Escherichia coli)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)之間相差10倍?；谒麄兊慕Y(jié)果，這些作者提出了基于在細(xì)菌細(xì)胞膜和官能化表面之間進(jìn)行離子交換的細(xì)胞殺死機(jī)制。
然而，所有上述公開(kāi)物和美國(guó)專利申請(qǐng)教導(dǎo)了表面處理的效果、表面性質(zhì)以及為了殺死細(xì)胞必須與表面緊密接觸。上述文獻(xiàn)均沒(méi)有教導(dǎo)固體酸性或堿性質(zhì)子/羥基導(dǎo)體和緩沖劑對(duì)活細(xì)胞的“體效應(yīng)(BULKEFFECT)”。它們也沒(méi)有教導(dǎo)使用細(xì)胞毒性聚合物涂覆的屏障層作為殺死細(xì)胞的一種方式。此外，任何上述美國(guó)專利申請(qǐng)均沒(méi)有教導(dǎo)選擇性殺死某些細(xì)胞類型的聚合物構(gòu)型。
因此，仍需要能夠?qū)φ婧思?xì)胞和原核細(xì)胞發(fā)揮持續(xù)和長(zhǎng)效細(xì)胞毒性作用的試劑，并且這種試劑是非常有利的。實(shí)現(xiàn)這些期望目標(biāo)的一種方式是使用涂覆材料涂覆固體離子交換劑(solid ion exchanger，SIEx)，一般而言，所述涂覆材料具有擴(kuò)散屏障的性質(zhì)并且無(wú)固有的藥理學(xué)性質(zhì)或毒性。這些涂覆材料將限制競(jìng)爭(zhēng)性反離子運(yùn)送至SIEx表面或從SIEx表面運(yùn)送出，但允許質(zhì)子/羥基離子的轉(zhuǎn)移。從而，消除或顯著降低了離子交換被反離子飽和，并導(dǎo)致其持續(xù)及長(zhǎng)效的活性。
Wen等人的美國(guó)專利6,001,392描述了與二乙烯基苯交聯(lián)的經(jīng)涂覆和未經(jīng)涂覆的磺酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Amberlite TM IRP-69；得自Rohmand Haas)混合物的用途，其中右美沙芬(常用的鎮(zhèn)咳藥)被加載到所述樹(shù)脂上以使得該藥物在液體制劑中持續(xù)釋放。約30％的藥物/樹(shù)脂復(fù)合物被乙基纖維素或乙基纖維素膠乳與增塑劑和水分散性聚合物(例如SURELEASE)的混合物所涂覆。用于上述目的所述樹(shù)脂和涂覆材料的另外實(shí)例是Dow XYS-40010.00(Dow Chemical Company)。AmberliteTM IRP-69和Dow XYS-40010.00均是磺酰化聚合物，其由與8％二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯組成，其離子交換能力約為4.5～5.5meq./g干樹(shù)脂(H+形式)。它們的本質(zhì)區(qū)別在于物理形式。Amberlite TM IRP-69由尺寸為47～149μm的形狀不規(guī)則的顆粒組成，所述顆粒是通過(guò)碾磨較大尺寸的Amberlite TM IRP-120母體球制得的。Dow XYS-40010.00產(chǎn)品則由尺寸為45～150μm的球形顆粒組成。另一種有用的交換樹(shù)脂Dow XYS-40013.00是由與8％二乙烯基苯交聯(lián)并使用季銨基團(tuán)官能化的聚苯乙烯組成的聚合物；其交換能力通常約為3～4meq./g干樹(shù)脂。
一般來(lái)說(shuō)，涂覆材料可以是多種天然或合成的常規(guī)成膜材料的任一種，其單獨(dú)使用、相互混合使用以及與增塑劑、顏料等混合使用，其具有擴(kuò)散屏障的性質(zhì)并且無(wú)固有的藥理學(xué)性質(zhì)或毒性。一般地，所述涂層的主要組分應(yīng)不溶于水且可滲入水。然而，引入可溶于水的材料(例如甲基纖維素)以改變所述涂層的滲透性或者引入不溶于酸、但可溶于堿的材料以用作腸溶包衣可能是理想的。所述涂覆材料可作為水性液體中的懸液或有機(jī)溶劑中的溶液來(lái)應(yīng)用。此類涂覆材料的合適實(shí)例由R.C.Rowe描述于Materials used in Pharmaceutical Formulation.(A.T.Florence，編輯)，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1-36(1984)中，其通過(guò)參考并入本文。水滲入性擴(kuò)散屏障選自乙基纖維素、甲基纖維素及其混合物(一個(gè)實(shí)例是Colorcon生產(chǎn)的SURELEASE，其是基于水的乙基纖維素膠乳，利用癸二酸二丁酯或植物油進(jìn)行增塑)。其它非限制性涂覆材料有AQUACOAT(其由費(fèi)城的FMC公司生產(chǎn)，其是乙基纖維素假膠乳)；基于乙基纖維素的溶劑；蟲(chóng)膠；玉米醇溶蛋白(zein)；松香酯；醋酸纖維素；EUDRAGITS(其由費(fèi)城的Rohm andHaas生產(chǎn)，其為丙烯酸樹(shù)脂)；硅氧烷彈性體；聚氯乙烯甲基纖維素以及羥丙基甲基纖維素。
可利用常規(guī)的涂覆溶劑和涂覆方法(例如流化床涂覆和噴涂)對(duì)顆粒進(jìn)行涂覆。流化床涂覆技術(shù)在例如美國(guó)專利3,089,824、3,117,027和3,253,944中有所教導(dǎo)。涂覆溶劑的非限制性實(shí)例包括乙醇、二氯甲烷/丙酮混合物、涂覆乳液、甲基丙酮、四氫呋喃、四氯化碳、甲基乙基酮、二氯乙烷、三氯乙烯、己烷、甲醇、異丙醇、甲基異丁基酮、甲苯、2-硝基丙烷、二甲苯、異丁醇、乙酸正丁酯?？蓪⑸鲜黾夹g(shù)用于本發(fā)明中以設(shè)計(jì)用于選擇性和靶向性殺死細(xì)胞的經(jīng)涂覆SIE。
已確認(rèn)，溶液中的極端pH值(高于7.0和低于5.5)對(duì)細(xì)胞(微生物細(xì)胞以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞)有害，因而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。Bennett等人的英國(guó)專利No.2374287描述了一種用于對(duì)無(wú)孔硬表面進(jìn)行消毒和/或滅菌的組合物，其包含醇和有效量的pH調(diào)節(jié)劑，所述醇選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、芐醇及其混合物并以約40wt％至約70wt％的量存在，所述pH調(diào)節(jié)劑使得所述組合物的pH范圍為約7.0至約13.0，其中所述醇的量與所述組合物的pH成反比。已發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)提高組合物的pH來(lái)降低醇的使用量。因此，已提供了具有含量減少之VOC(volatile organic compound，揮發(fā)性有機(jī)化合物)的有效滅菌組合物。另一方面，Woodrow的美國(guó)專利No.5614241描述了營(yíng)養(yǎng)均衡的水溶性粉末食品組合物，當(dāng)與水混合時(shí)，其具有低pH(5.5～2.0)、延長(zhǎng)的貨架期、高的抗微生物活性，并且其包括在溶液或混懸液中的蛋白質(zhì)α-氨基酸。該食品組合物利用低pH的二元蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑系統(tǒng)和高的總酸性-低pH細(xì)菌穩(wěn)定劑系統(tǒng)。
然而，上述專利和其它現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了在液體溶液中pH的抗微生物作用。任何上述專利或現(xiàn)有技術(shù)均未證明或教導(dǎo)，在沒(méi)有不利影響溶液pH的情形下，固體緩沖劑和離子交換劑通過(guò)細(xì)胞膜和離子交換劑之間的質(zhì)子交換引起的細(xì)胞毒作用。
下面的公開(kāi)物通過(guò)引用并入本文Arciola，C.R.，Alvergna，P.，Cenni，E.& Pizzoferrato，A.(1993)Biomaterials 14，1161-1164；Atkins，P.W.(1990).Physical Chemistry.New YorkW.H.Freeman & Company；Boring等，CA Cancer Journal for Clinicians.4371993；Bridgett，M.J.等，(1992).Biomaterials 13，411-416；Cen，L.，Neoh，K.G.& Kang，E.T.(2003).Langmuir19，10295-10303；Chen，C.Z.& Cooper，S.L.(2000).AdvMaterials 12，843-846；Chen，C.Z.&Cooper，S.L.(2002).Biomaterials23，3359-3368；Endo，Y.，Tani，T.&Kodama，M.(1987).Appl EnvironMicrobiol53，2050-2055；Fidai，S.，F(xiàn)arer，S.W.&Hancock，R.E.(1997).Methods Mol Biol 78，187-204；Friedrich，C.L.，Moyles，D.，Beverige，T.J.& Hancock，R.E.W.(2000).Antimicrob Agents Chemother 44，2086-2092；Gottenbos，B.，van der Mei，H.C，Klatter，F(xiàn).，Nieuwenhuis，P.& Busscher，H.J.(2002).Biomaterials 23，1417-1423；Isquith，A.J.，Abbott，E.A.& Walters，P.A.(1972).Appl Microbiol 24，859-863；Kanazawa，A.，Ikeda，T.& Endo，T.(1993).J Polym Sci Part A PolymChem 31，1467-1472；Kügler R.，Bouloussa O.和Rondelez F.，(2005)Microbiology，151，1341-1348；Lee，S.B.，Koepsel，R.R.，Morley，S.W.，Matyajaszewski，K.，Sun，Y.& Russell，A.J.(2004).Biomacromolecules5，877-882.Lin，J.，Qiu，S.，Lewis，K.&Klibanov，A.M.(2002).Biotechnol Prog 18，1082-1096；Lin，J.，Qiu，S.，Lewis，K.&Klibanov，A.M.(2003).Biotechnol Bioeng 83，168-172；Medlin J.1997.Germ warfare.Environ Health Persp 105290-292；Nohr R S和Macdonald G J.1994.JBiomater Sci，Polymer Edn 5607-619；Park，K.D.，Kim，Y.S.，Han，D.K.，Kim，Y.H.，Lee，E.H.B.，Suh，H.&Choi，K.S.(1998)Biomaterials19，51-859；Popa，A.，Davidescu，C.M.，Trif，R.，Ilia，Gh.，Iliescu，S.&Dehelean，Gh.(2003).React Funct Polym 55，151-158；Rondelez，F(xiàn).&Bezou，P.(1999).Actual Chim 10，4-8；Rowe R.C.(1984)in Materialsused in Pharmaceutical Formulation.(A.T.Florence編)，BlackwellScientific Publications，Oxford，1-36；Shearer，A.E.H.等，(2000)，Biotechnol.Bioeng 67，141-146；Sauvet，G.，Dupond，S.，Kazmierski，K.& Chojnowski，J.(2000).J Appl Polym Sci 75，1005-1012；Thome，J.，Hollander，A.，Jaeger，W.，Trick，I.& Oehr，C.(2003).Surface CoatingTechnol 174-175，584-587；Tiller，J.C，Liao，C，Lewis，K.& Klibanov，A.M.(2001).Proc Natl Acad Sci USA 98，5981-5985。


發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是公開(kāi)不溶性質(zhì)子庫(kù)或質(zhì)子源(proton sinkor source，PSS)，其可用于通過(guò)接觸來(lái)殺死活的靶細(xì)胞(living target cell，LTC)或者破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用。所述PSS包含(i)提供緩沖能力的質(zhì)子源或質(zhì)子庫(kù)；以及(ii)提供質(zhì)子傳導(dǎo)和/或電勢(shì)的裝置；其中所述PSS有效地破壞LTC限定體積內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡和/或破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中所述PSS是不可溶的疏水性的陰離子型、陽(yáng)離子型或兩性聚合物，其可用于通過(guò)接觸來(lái)殺死活的靶細(xì)胞(LTC)或者破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用。此外或作為替代，在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中所述PSS是不可溶的親水性的陰離子型、陽(yáng)離子型或兩性聚合物，其與水不互溶型聚合物聯(lián)用，可用于通過(guò)接觸來(lái)殺死活的靶細(xì)胞(LTC)或者破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用。進(jìn)一步地，在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中所述PSS是不可溶的親水性的陰離子型、陽(yáng)離子型或兩性聚合物，其與水不互溶的陰離子型、陽(yáng)離子型或兩性帶電聚合物聯(lián)用，可用于通過(guò)接觸來(lái)殺死活的靶細(xì)胞(LTC)或者破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用。
此外，在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中以非限制性方式改造所述PSS，使其在整體(bulk)上或表面處接觸活的靶細(xì)胞；例如，在能夠與本發(fā)明PSS接觸的生物體或無(wú)生命物體的最外圍處；在能通過(guò)多種透皮遞送途徑之任一種與PSS接觸的微生物、動(dòng)物和植物的內(nèi)膜和表面處；在整體上，所述整體為配備或不配備攪拌的整體等。
仍在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中(i)PSS或(ii)包含所述PSS的產(chǎn)品還包含有效量的至少一種添加劑。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所述任一項(xiàng)中所定義的PSS，其中通過(guò)水滲透性和/或潤(rùn)濕性來(lái)提供質(zhì)子傳導(dǎo)，尤其是其中通過(guò)親水性添加劑來(lái)提供所述潤(rùn)濕性。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所述任一項(xiàng)中所定義的PSS，其中通過(guò)固有性質(zhì)子傳導(dǎo)材料(inherently proton conductive material，IPCM)和/或固有性親水性聚合物(IHP)提供質(zhì)子傳導(dǎo)性或潤(rùn)濕性，尤其是通過(guò)選自以下的IPCM和/或IHP來(lái)提供磺化四氟乙烯共聚物；選自二氧化硅、聚硫醚砜(SPTES)、苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯(S-SEBS)、聚醚-醚-酮(PEEK)、聚(亞芳基-醚-砜)(PSU)、聚偏氟乙烯(PVDF)接枝的苯乙烯、聚苯并咪唑(PBI)和聚磷腈的磺?；牧?；用交聯(lián)聚苯乙烯磺酸鹽(PSS鹽)離子交換樹(shù)脂的微米級(jí)懸浮顆粒澆鑄聚苯乙烯磺酸鹽溶液所制備的質(zhì)子交換膜；市售的Nafion TM及其衍生物。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所述任一項(xiàng)中所定義的PSS，其中所述PSS被構(gòu)建成綴合物，其包含兩種或更多種二維(2D)或三維(3D)的PSS，每種PSS由含有高度解離的陽(yáng)離子和/或陰離子基團(tuán)(highlydissociating cationic and/or anionic group，HDCA)的材料組成，所述基團(tuán)以有效地將LTC環(huán)境中pH變化降至最小的方式進(jìn)行空間組織。每種HDCA任選地以有效地將LTC環(huán)境中pH變化降至最小的特定2D(拓?fù)湔郫B的2D表面)或3D方式進(jìn)行空間組織；此外任選地，所述進(jìn)行空間組織的HDCA的至少一部分以選自以下的方式進(jìn)行2D或3D排布(i)交錯(cuò)；(ii)重疊；(iii)綴合；(iv)均勻或不均勻混合以及(iv)平鋪(tiling)。
在此方面，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，術(shù)語(yǔ)“HDCA”非限制性地表示離子交換劑，例如與水不互溶的離子型疏水材料。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所述任一項(xiàng)中所定義的PSS，其中所述PSS有效地破壞限定體積內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的完整性；另外，其中所述環(huán)境的完整性通過(guò)選自以下的參數(shù)來(lái)表征環(huán)境功能性、化學(xué)性質(zhì)；可溶物濃度，可能除了質(zhì)子或羥基濃度以外；生物學(xué)相關(guān)的參數(shù)；生態(tài)學(xué)相關(guān)的參數(shù)；物理參數(shù)，尤其是顆粒大小分布、流變學(xué)和粘稠度；安全性參數(shù)，尤其是毒性，或者說(shuō)影響LD50或ICT50的參數(shù)；嗅覺(jué)或感官參數(shù)(例如顏色、味道、氣味、質(zhì)地、概念性外觀等)；或上述的任意組合。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所述任一項(xiàng)中所定義的PSS，其中提供了PSS，其可用于破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)既(i)有效維持LTC環(huán)境的pH又(ii)最小程度地影響LTC環(huán)境的完整性，從而使從PSS滲漏(leach)到LTC環(huán)境中的離子化或中性原子、分子或顆粒(atom，molecule or particle，AMP)降至最低。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中將上述滲漏降至最低使得所滲漏的離子化或中性原子的濃度小于1ppm?；蛘?，將上述滲漏降至最低使得所滲漏的離子化或中性原子的濃度小于50ppb?；蛘?，上述的將滲漏降至最低使得所滲漏的離子化或中性原子的濃度小于50ppb且大于10ppb。或者，將滲漏上述降至最低使得所滲漏的離子化或中性原子的濃度小于10ppb且大于0.5ppb?；蛘?，將上述滲漏降至最低使得所滲漏的離子化或中性原子的濃度小于0.5ppb。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所述任一項(xiàng)中所定義的PSS，其中提供了PSS，其可用于破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)較少破壞至少一個(gè)第二限定體積(例如非靶細(xì)胞(non-target cell，NTC))內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所述任一項(xiàng)中所定義之PSS的區(qū)分方法，其中通過(guò)以下手段中的一種或多種來(lái)實(shí)現(xiàn)區(qū)分LTC與NTC(i)提供差異性離子能力；(ii)提供差異性pH值；以及(iii)優(yōu)化PSS與靶細(xì)胞的大小比例；(iv)提供PSS的差異性空間構(gòu)型(2D、拓?fù)湔郫B的2D表面或3D構(gòu)型)；(v)提供在每一指定體積內(nèi)具有所定義能力的臨界數(shù)目的PSS顆粒(或可用的表面)；以及(vi)提供尺寸排阻工具/裝置。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一種產(chǎn)品，其包含上文任一項(xiàng)所定義的至少一種不溶性、非滲漏的PSS。位于所述產(chǎn)品內(nèi)表面和/或外表面上的PSS可用于通過(guò)接觸來(lái)破壞LTC至少一部分內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡同時(shí)有效維持所述表面的pH和功能。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一種產(chǎn)品，其包含上文任一項(xiàng)所定義的至少一種不溶性、非滲漏的PSS。尤其適用于殺死靶細(xì)胞。所述PSS具有至少一個(gè)具有指定功能(例如，電流傳導(dǎo)性、親和性、選擇性等)的質(zhì)子可滲透的外表面；所述表面至少部分地由PSS組成或者用PSS鋪層于局部和/或下面；從而破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH和功能。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一種產(chǎn)品，其包含上文任一項(xiàng)所定義的至少一種不溶性、非滲漏的PSS，其包含具有指定功能的表面以及質(zhì)子可滲透的一個(gè)或多個(gè)外層，每層被置于所述表面的至少一部分上；其中所述層至少部分地由PSS組成或者用PSS鋪層，從而破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH和功能。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一種產(chǎn)品，其包含上文任一項(xiàng)所定義的至少一種不溶性、非滲漏的PSS。所述基于PSS的系統(tǒng)包含(i)至少一種PSS；以及(ii)一個(gè)或多個(gè)保護(hù)性屏障，為PSS提供長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的活性；優(yōu)選地，其中至少一個(gè)屏障是適用于避免重離子擴(kuò)散的聚合物保護(hù)性屏障；進(jìn)一步優(yōu)選地，其中所述聚合物是離聚物屏障(ionomericbarrier)，特別是市售的Nafion TM。
在此方面，公認(rèn)的是，可選擇性允許質(zhì)子和羥基(而非其它競(jìng)爭(zhēng)性離子)運(yùn)送到SIEx表面或運(yùn)送出SIEx表面的屏障的存在或引入消除或顯著降低了離子交換被反離子飽和，導(dǎo)致本發(fā)明的材料和組合物持續(xù)地長(zhǎng)期發(fā)揮細(xì)胞殺死活性。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中所述細(xì)胞與強(qiáng)酸性和/或強(qiáng)堿性材料和組合物之間的質(zhì)子和/或羥基交換可導(dǎo)致細(xì)胞pH穩(wěn)態(tài)的破壞并因此導(dǎo)致細(xì)胞死亡。所述質(zhì)子傳導(dǎo)性、體積緩沖能力和體積活性(bulk activity)對(duì)本發(fā)明是關(guān)鍵和重要的。
仍在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中可通過(guò)用聚合物屏障材料和/或離聚物屏障材料浸涂和涂覆酸性和堿性的離子交換材料來(lái)調(diào)節(jié)所述pH介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一種產(chǎn)品，其包含上文任一項(xiàng)所定義的至少一種不溶性、非滲漏的PSS，其適用于避免產(chǎn)生LTC抗性和針對(duì)抗性突變的選擇。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文任一項(xiàng)所定義的一種產(chǎn)品，其被設(shè)計(jì)并構(gòu)建成選自以下的成員屏障；膜；濾器；墊；篩狀物；網(wǎng)狀物；插入物；顆粒物質(zhì)；粉末；納米粉末等；含有PSS的介質(zhì)、載體或囊泡(例如，含有PSS的脂質(zhì)體)；摻添加劑的(doped)、經(jīng)涂覆的、經(jīng)浸沒(méi)的、所包含的、經(jīng)浸泡的、經(jīng)固定的、經(jīng)包埋的、經(jīng)粘附的、置于柱上的、溶解的或者與其鍵合的含PSS的材料。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一種產(chǎn)品，其特征在于下述之一(i)可再生的質(zhì)子源或質(zhì)子庫(kù)；(ii)可再生的緩沖能力；以及(iii)可再生的質(zhì)子傳導(dǎo)性。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)用于通過(guò)接觸來(lái)殺死活的靶細(xì)胞(LTC)或者破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用的方法。該方法包括如下步驟提供包含(i)提供緩沖能力之質(zhì)子源或質(zhì)子庫(kù)和(ii)提供質(zhì)子傳導(dǎo)和/或電勢(shì)之裝置的至少一種PSS；使LTC與所述PSS接觸，利用所述PSS從而有效破壞LTC內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中所述方法的第一步還包括以下步驟向PSS提供水滲透特性和/或潤(rùn)濕特性，特別是其中通過(guò)向PSS提供親水性添加劑來(lái)至少部分地獲得所述質(zhì)子傳導(dǎo)性和潤(rùn)濕性。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中該方法還包括以下步驟向PSS提供固有性質(zhì)子傳導(dǎo)材料(IPCM)和/或固有性親水性聚合物(IHP)，特別地，所述IPCM和/或IHP選自磺化四氟乙烯共聚物、市售的Nafion TM及其衍生物。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中該方法還包括以下步驟提供兩種或更多種二維(2D)、拓?fù)湔郫B的2D表面或三維(3D)的PSS，每種PSS由含有高度解離的陽(yáng)離子和/或陰離子基團(tuán)(HDCA)的材料組成；并以有效地將LTC環(huán)境pH變化降至最低的方式對(duì)HDCA進(jìn)行空間組織。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中該方法還包括以下步驟以特定的2D或3D方式對(duì)每個(gè)HDCA進(jìn)行空間組織，使得LTC環(huán)境pH的變化降至最低。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中所述組織步驟通過(guò)選自以下的方式來(lái)提供的(i)使HDCA交錯(cuò)；(ii)使HDCA重疊；(iii)使HDCA綴合；(iv)使HDCA均勻或不均勻混合以及(v)平鋪HDCA。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中該方法還包括如下步驟利用PSS破壞LTC至少一部分內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電勢(shì)，同時(shí)(i)有效維持LTC環(huán)境的pH，并且(ii)最小程度地影響LTC環(huán)境的完整性；該方法特別地通過(guò)使從PSS滲漏到LTC環(huán)境中的離子化或電中性原子、分子或顆粒降至最低來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中該方法還包括如下步驟優(yōu)先破壞至少一個(gè)第一限定體積(例如，活的靶細(xì)胞(LTC))的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，同時(shí)較少破壞至少一個(gè)第二限定體積(例如，非靶細(xì)胞(NTC))的pH穩(wěn)態(tài)。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的區(qū)分方法，其中通過(guò)以下步驟中的一個(gè)或多個(gè)來(lái)實(shí)現(xiàn)區(qū)分LTC與NTC(i)提供差異性離子能力；(ii)提供差異性pH值；(iii)優(yōu)化PSS與LTC的大小比例；(iv)在PSS整體之上設(shè)計(jì)PSS邊界的差異性空間構(gòu)型；(v)在每一給定體積內(nèi)提供具有所定義能力的臨界數(shù)目的PSS顆粒(或可用的表面)；以及(vi)提供尺寸排阻工具/裝置，例如篩、網(wǎng)格等。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)用于制備產(chǎn)品的方法，其包括以下步驟提供上文所定義的PSS；將所述PSS置于所述產(chǎn)品表面之上或之下；以及通過(guò)將PSS與LTC接觸來(lái)破壞LTC至少一部分內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，同時(shí)有效維持所述表面的pH和功能。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中該方法還包括以下步驟提供具有指定功能的至少一個(gè)質(zhì)子可滲透外表面；向所述表面的至少一部分提供至少一種PSS，和/或?qū)⒅辽僖环NPSS鋪層于所述表面之上或之下；從而殺死LTC，或者破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用，同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH和功能。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中該方法還包括以下步驟提供具有指定功能的至少一個(gè)質(zhì)子可滲透外表面；在所述表面至少一部分的局部和/或下面鋪一個(gè)或多個(gè)質(zhì)子可滲透層；所述一個(gè)或多個(gè)層至少部分地由至少一種PSS組成或鋪成；殺死LTC或者破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH和功能。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中該方法包括如下步驟提供至少一種PSS；以及向所述PSS提供至少一個(gè)保護(hù)性屏障的PSS，從而獲得長(zhǎng)期持續(xù)的作用。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所定義的方法，其中所述提供屏障的步驟是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的使用適于避免重離子擴(kuò)散的聚合物保護(hù)性屏障；優(yōu)選地提供聚合物作為離聚物屏障，特別是利用市售的NafionTM產(chǎn)品。
因此，在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中提供了下述材料的一種或多種在固體或半固體包膜中包封的強(qiáng)酸和強(qiáng)堿緩沖劑、固體離子交換劑(SIEx)、離聚物、經(jīng)涂覆的SIEx、高度交聯(lián)的小孔隙SIEx、空隙經(jīng)填充的SIEx、經(jīng)基質(zhì)包埋的SIEx、包埋在基質(zhì)中的離聚物顆粒、陰離子型(酸性)和陽(yáng)離子型(堿性)SIEx的混合物等。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文任一項(xiàng)中所定義的PSS，其中所述PSS是天然有機(jī)酸的組合物，其含有多種羧酸和/或磺酸家族基團(tuán)、松香酸(C20H30O2)(例如松香/松脂、松木樹(shù)脂等)、酸性和堿性萜類。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)用于誘導(dǎo)LTC群中至少一部分發(fā)生細(xì)胞凋亡的方法。該方法包括以下步驟獲得上文任一項(xiàng)中所定義的至少一種PSS；使PSS與LTC接觸；有效地破壞LTC內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡使得LTC發(fā)生凋亡，同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)用于避免產(chǎn)生LTC抗性和針對(duì)抗性突變的選擇的方法。該方法包括以下步驟獲得上文所定義的至少一種PSS；使PSS與LTC接觸，有效地破壞LTC內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，使得避免產(chǎn)生LTC抗性和針對(duì)抗性突變的選擇，同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH和患者的安全。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一種治療患者的方法，其包括以下步驟得到非天然的醫(yī)療植入物；向該植入物提供至少一種上文所定義PSS，所述PSS適于破壞LTC內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡；將該植入物植入患者體內(nèi)，或者將該植入物施用到患者表面，使得植入物與至少一種LTC接觸；破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用，同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH和患者的安全。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一種治療患者的方法，其包括以下步驟以使PSS接觸至少一種LTC的方式向患者施用有效量的上文所定義的PSS；破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持LTC的環(huán)境pH。在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中所述PSS以例如經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)內(nèi)窺鏡、近距離放射治療(brachytherapy)、局部或靜脈內(nèi)、全身性的方式施用，其作為顆粒物或利用可藥用載體來(lái)提供。
本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)使上文所述PSS再生的方法，其包括選自以下的至少一個(gè)步驟(i)使PSS再生；(ii)使其緩沖能力再生；以及(iii)使其質(zhì)子傳導(dǎo)性再生。



為了理解本發(fā)明并了解可以如何實(shí)施本發(fā)明，現(xiàn)在參照下述附圖僅采用非限制性的實(shí)施例來(lái)描述多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中 圖1示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的pH和時(shí)間依賴性的細(xì)胞毒作用。使Jurkat細(xì)胞暴露于經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠0、10、20和30分鐘。通過(guò)LIVE/DEAD生存力試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力； 圖2示意具有不同pH的經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠作為珠濃度函數(shù)的細(xì)胞毒作用。使Jurkat細(xì)胞暴露于經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠0、10、20和30分鐘。通過(guò)LIVE/DEAD生存力試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力； 圖3示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)Jurkat細(xì)胞作為珠pH和孵育時(shí)間之函數(shù)的細(xì)胞毒作用。使Jurkat細(xì)胞暴露于經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠0、10、20和30分鐘。通過(guò)LIVE/DEAD生存力試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力； 圖4示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)HT-29細(xì)胞作為珠pH和孵育時(shí)間之函數(shù)的細(xì)胞毒作用。使HT-29細(xì)胞暴露于經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠50小時(shí)。通過(guò)磺酰羅丹明測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力； 圖5示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)HT-29細(xì)胞的濃度依賴性細(xì)胞毒作用。使HT-29細(xì)胞暴露于不同濃度的經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠50小時(shí)。通過(guò)磺酰羅丹明測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力； 圖6示意PAAG珠對(duì)HT-29細(xì)胞作為珠pH之函數(shù)的細(xì)胞毒作用。使HT-29細(xì)胞暴露于經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠50小時(shí)。通過(guò)磺酰羅丹明測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力； 圖7示意具有不同pH(pH 2～6)的PAAG珠對(duì)HT-29細(xì)胞的濃度依賴性細(xì)胞毒作用。使HT-29細(xì)胞暴露于不同濃度的經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠50小時(shí)。通過(guò)磺酰羅丹明測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力； 圖8示意具有不同pH(pH 7～11)的PAAG珠對(duì)HT-29細(xì)胞的濃度依賴性細(xì)胞毒作用。使HT-29細(xì)胞暴露于不同濃度的經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠50小時(shí)。通過(guò)磺酰羅丹明測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力； 圖9示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠的溶血活性。使紅細(xì)胞暴露于經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠4小時(shí)。通過(guò)分光光度法檢測(cè)所述珠的溶血活性； 圖10示意經(jīng)PAAG珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。使Jurkat細(xì)胞暴露于PAAG珠20分鐘。通過(guò)LIVE/DEAD生存力試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)活細(xì)胞的百分比； 圖11示意經(jīng)PAAG珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。使Jurkat細(xì)胞暴露于PAAG珠20分鐘。通過(guò)LIVE/DEAD生存力試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)死細(xì)胞的百分比； 圖12示意PAAG珠誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生凋亡。使Jurkat細(xì)胞暴露于PAAG珠20分鐘。為了檢測(cè)凋亡，使用Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒； 圖13示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。使Jurkat細(xì)胞暴露于經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠20分鐘。通過(guò)LIVE/DEAD生存力試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)活細(xì)胞的百分比； 圖14示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。使Jurkat細(xì)胞暴露于經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠20分鐘。通過(guò)LIVE/DEAD生存力試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)死細(xì)胞的百分比； 圖15示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生凋亡。使Jurkat細(xì)胞暴露于經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠20分鐘。為了檢測(cè)凋亡，使用Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒； 圖16示意對(duì)照和經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠所處理Jurkat細(xì)胞的形態(tài)的顯微照片。使細(xì)胞暴露于48號(hào)經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠，然后利用Hoechst 33342檢測(cè)染色質(zhì)濃縮； 圖17示意對(duì)照和經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠所處理Jurkat細(xì)胞的形態(tài)的顯微照片。使細(xì)胞暴露于48號(hào)經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠。形態(tài)學(xué)研究顯示膨脹的細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞起泡(即細(xì)胞凋亡的特征)； 圖18示意對(duì)照和經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠所處理Jurkat細(xì)胞的形態(tài)的顯微照片。使細(xì)胞暴露于48號(hào)經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠。形態(tài)學(xué)研究顯示膨脹的細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞起泡(即細(xì)胞凋亡的特征)； 圖19顯示G1期細(xì)胞的濃度依賴性毒性； 圖20顯示G1期細(xì)胞、有絲分裂期細(xì)胞的濃度依賴性毒性； 圖21和22分別表示組合物A和B的活性測(cè)試；以及 圖23表示PSS對(duì)白色念珠菌(Candida albicans，ATCC 10231)的測(cè)試。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述 以下說(shuō)明書(shū)結(jié)合附圖闡述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本文中公開(kāi)的本發(fā)明實(shí)施方案是本發(fā)明人預(yù)想的在商業(yè)環(huán)境中實(shí)施其發(fā)明的最佳方式，然而應(yīng)當(dāng)理解的是可在本發(fā)明的參數(shù)內(nèi)進(jìn)行多種改動(dòng)。
在下文中，術(shù)語(yǔ)“接觸”是指PSS與限定體積(活的靶細(xì)胞(LTC)或病毒)的任何直接或間接接觸，其中所述PSS與LTC位置接近，例如其中所述PSS到達(dá)LTC的內(nèi)部或外部；此外，其中所述PSS和LTC位置接近使得(i)有效破壞pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，或者(ii)破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用。
在下文中，術(shù)語(yǔ)“有效地”是指超過(guò)10％的有效性，此外或者作為替代，該術(shù)語(yǔ)是指超過(guò)50％的有效性；此外或者作為替代，該術(shù)語(yǔ)是指超過(guò)80％的有效性。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中為了殺死LTC，該術(shù)語(yǔ)是指在預(yù)定時(shí)間(例如10分鐘)內(nèi)殺死大于50％的LTC群。
在下文中，術(shù)語(yǔ)“添加劑”是指以下物質(zhì)的一種或多種殺生物劑，例如有機(jī)殺生物劑，如茶樹(shù)油、松香、松香酸、萜、迷迭香油等，以及無(wú)機(jī)殺生物劑，如氧化鋅、銅和汞、銀鹽等；標(biāo)記物、生物標(biāo)記物、染料、顏料、放射性標(biāo)記材料、膠、粘附劑、潤(rùn)滑劑、藥劑、緩釋藥物、營(yíng)養(yǎng)物、肽、氨基酸、多糖、酶、激素、螯合劑、多價(jià)離子、乳化劑或去乳化劑、粘合劑、填充劑、增稠劑、因子、輔因子、酶促抑制劑、感官試劑(organoleptic agent)；運(yùn)載工具，例如脂質(zhì)體、多層囊泡或其它囊泡、磁性或順磁性物質(zhì)、鐵磁性和非鐵磁性物質(zhì)；增強(qiáng)生物相容性的物質(zhì)和/或生物可降解的物質(zhì)，例如聚乳酸和聚谷氨酸；抗腐蝕顏料、防污顏料、UV吸收劑、UV增強(qiáng)劑、血凝劑；血液凝固抑制劑，例如肝素等；或其任意組合。
在下文中，術(shù)語(yǔ)“顆粒物質(zhì)”是指下述物質(zhì)中的一種或多種納米粉末、微米級(jí)粉末、細(xì)粉末、自由流動(dòng)的粉末、粉塵、聚集體、平均直徑為約1nm至約1000nm或者約1mm至約25mm的顆粒。
在下文中，術(shù)語(yǔ)“約”是指所限定測(cè)量值的±20％。
在下文中，術(shù)語(yǔ)“表面”是指其最廣泛的含義。在一種含義中，該術(shù)語(yǔ)是指生物體或無(wú)生命物體(例如運(yùn)輸工具、建筑物和食品加工設(shè)備等)的最外面的邊界，其能夠與本發(fā)明的組合物接觸(例如，對(duì)于動(dòng)物而言的皮膚、毛發(fā)和皮毛等，對(duì)于植物而言的葉、莖、開(kāi)花部分、種子、根和果實(shí)體等)。在另一種含義中，該術(shù)語(yǔ)還指動(dòng)物和植物的內(nèi)膜和表面(例如，對(duì)于動(dòng)物而言的消化道、脈管組織等，對(duì)于植物而言的脈管組織等)，其能通過(guò)多種經(jīng)皮遞送途徑(例如注射、攝入、透皮遞送、吸入等)與所述組合物接觸。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中公開(kāi)了采用聚合物、陶瓷、凝膠、樹(shù)脂或金屬氧化物形式的不溶性PSS。所述PSS攜帶強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性官能團(tuán)(或二者兼有)，其被調(diào)節(jié)至pH約＜4.5或約＞8.0。在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中所述不溶性PSS是固體緩沖劑。
此外，在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中提供了使所述基團(tuán)無(wú)論在PSS表面上還是內(nèi)部均能與水接觸的材料組合物。使活細(xì)胞(例如細(xì)菌、真菌、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞)與PSS接觸以在一定時(shí)間段內(nèi)殺死所述細(xì)胞，其效力取決于PSS的pH、接觸細(xì)胞的PSS量、PSS所攜帶的特定官能團(tuán)以及所述細(xì)胞的類型。通過(guò)滴定過(guò)程殺死細(xì)胞，其中PSS導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的pH改變。細(xì)胞常在膜破裂或細(xì)胞裂解之前被有效殺死。如果接觸是通過(guò)可滲透水、H+和OH-離子(而非其它離子或分子)的涂層或膜實(shí)現(xiàn)的，則PSS在不直接接觸細(xì)胞的情形下殺死細(xì)胞。這樣的涂層還能通過(guò)反離子向PSS官能團(tuán)擴(kuò)散來(lái)防止PSS或靶細(xì)胞周圍溶液的pH改變。在那些方面，公認(rèn)的是現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子(堿性)分子或聚合物來(lái)殺死細(xì)胞，其中可能通過(guò)膜破裂來(lái)殺死細(xì)胞并且與所述強(qiáng)陽(yáng)離子材料接觸或?qū)⑺霾牧系闹辽僖徊糠植迦氲酵鈱蛹?xì)胞膜中。
仍在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中公開(kāi)了攜帶強(qiáng)酸(例如磺酸或磷酸)或強(qiáng)堿(例如季銨或叔胺)官能團(tuán)(或二者兼有)、pH為約＜4.5或約＞8.0的不溶性聚合物、陶瓷、凝膠、樹(shù)脂或金屬氧化物。PSS的官能團(tuán)均能接觸水，其體積緩沖能力為約20至約100mM H+/l/pH單位，當(dāng)被置于未經(jīng)緩沖的水(例如，約5＜pH＞約7.5)中時(shí)其得到中性pH，但通過(guò)接觸來(lái)殺死活細(xì)胞。
還在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中用可滲透水、H+和OH-離子(而非較大離子或分子)的屏障層來(lái)涂覆上文所定義的不溶性聚合物、陶瓷、凝膠、樹(shù)脂或金屬氧化物，其通過(guò)接觸所述屏障層來(lái)殺死活細(xì)胞。
還在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中提供了上文所定義的不溶性聚合物、陶瓷、凝膠、樹(shù)脂或金屬氧化物，其可用于通過(guò)接觸而誘導(dǎo)細(xì)胞中的pH改變來(lái)殺死活細(xì)胞。
還在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中提供了上文所定義的不溶性聚合物、陶瓷、凝膠、樹(shù)脂或金屬氧化物，其可用于在不需要將其任何結(jié)構(gòu)插入到細(xì)胞膜中或結(jié)合到細(xì)胞膜的情形下殺死活細(xì)胞。
還在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中提供了上文所定義的不溶性聚合物、陶瓷、凝膠、樹(shù)脂或金屬氧化物，其可用于在不需要預(yù)先破裂細(xì)胞膜和裂解的情形下殺死活細(xì)胞。
還在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中提供了上文所定義的不溶性聚合物、陶瓷、凝膠、樹(shù)脂或金屬氧化物，其可用于導(dǎo)致活細(xì)胞周圍的生理溶液或體液的pH變化約＜0.2個(gè)單位同時(shí)通過(guò)接觸來(lái)殺死活細(xì)胞。
還在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中提供了上文所定義的不溶性聚合物、陶瓷、凝膠、樹(shù)脂或金屬氧化物，其采用任意形狀、涂層、膜、片層、珠、顆粒、微米顆?；蚣{米顆粒、纖維、線、粉末以及這些顆粒的混懸物等形式。
在整個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)部分，可使用下面的術(shù)語(yǔ)和注釋。除非另外指明，下面列舉的所有或部分材料和組合物(見(jiàn)表1和2)用于下述實(shí)施例中。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少兩次或三次。
表1經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(PAAG)涂覆的和未經(jīng)涂覆的二氧化硅珠
表2PAAG珠
實(shí)施例1 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(PAAG)涂覆的和未經(jīng)涂覆的二氧化硅珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 材料和方法 將混懸液中的未經(jīng)涂覆的二氧化硅珠(大小為～40nm，Sigma，貨號(hào)為421553)和通過(guò)與聚丙烯酰胺進(jìn)行光聚合而被涂覆以引入酸性和堿性丙烯酰胺衍生物(固定化電解質(zhì))的二氧化硅珠貯存在+4℃的冰箱中備用。
使用急性T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞系——克隆E6-1(ATCC號(hào)TIB-152)。將Jurkat細(xì)胞維持在添加有1mmol丙酮酸鈉、10％FBS和青霉素-鏈霉素-兩性霉素(1∶100)的RPMI-1640培養(yǎng)基中。
生存力和顯微鏡觀察 將2μl珠(用0.1％SDS溶液稀釋)加至25μl PBS中的106個(gè)Jurkat細(xì)胞中。加入LIVE/DEAD染料(LIVE-DEAD生存力試劑盒，Molecular Probes)(0.15μl)，在室溫進(jìn)行孵育。利用熒光顯微鏡(Axioskop 2plus；filter 4-3)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和生存力。
結(jié)果 使用Molecular Probes的LIVE/DEAD生存力試劑盒對(duì)經(jīng)二氧化硅珠處理的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察。該試劑盒利用了SYTO9綠色熒光核酸染色劑和紅色熒光核酸染色劑碘化丙啶(PI)的混合物。這些染色劑在光譜特性和穿透健康細(xì)胞的能力方面有所不同。SYTO9染色劑通常標(biāo)記細(xì)胞膜完整的細(xì)胞和細(xì)胞膜受損的細(xì)胞。相反，PI僅穿透細(xì)胞膜受損的細(xì)胞，導(dǎo)致當(dāng)存在兩種染色劑時(shí)SYTO9染色劑的熒光減弱。因此，細(xì)胞膜受損的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，而細(xì)胞膜完整的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。使用標(biāo)準(zhǔn)的綠色或紅色濾光器組件可同時(shí)觀察來(lái)自活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光。
使Jurkat細(xì)胞與官能化的二氧化硅珠接觸。珠/Jurkat細(xì)胞的比值范圍為1∶20至1∶80，分別對(duì)應(yīng)于3×106個(gè)～0.75×106個(gè)顆粒/細(xì)胞。通過(guò)熒光顯微鏡來(lái)測(cè)定官能化二氧化硅珠各組的7～10個(gè)隨機(jī)視野的死細(xì)胞和活細(xì)胞的百分比。使用未經(jīng)涂覆的珠作為這些實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。
圖1示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠之細(xì)胞毒作用的pH和時(shí)間依賴性。類似地，圖2示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的濃度依賴性細(xì)胞毒作用。
圖19顯示G1期細(xì)胞的濃度依賴性毒性；圖20顯示G1期細(xì)胞和有絲分裂期細(xì)胞的濃度依賴性毒性。圖19表示在濃度高達(dá)約8μg/ml時(shí)細(xì)胞存活百分比高。PSS濃度提供了有區(qū)別地殺死LTC的有效手段。圖20示意兩種類型的LTC，其中在PSS濃度小于5μg/ml時(shí)，有絲分裂期細(xì)胞被殺死。換句話說(shuō)，在5μg/ml時(shí)，PSS對(duì)G1期細(xì)胞的選擇性為2∶1。此外，圖20表明PSS可區(qū)分LTC和NTC，這通過(guò)提供單位指定體積內(nèi)具有所定義能力的臨界數(shù)目的PSS顆粒(或可應(yīng)用的表面)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
圖1和2中示出了各實(shí)驗(yàn)中死Jurkat細(xì)胞的百分比。數(shù)據(jù)表明攜帶強(qiáng)正電荷和強(qiáng)負(fù)電荷的經(jīng)PAAG涂覆二氧化硅珠表現(xiàn)出高的細(xì)胞毒性(圖1和2)。該效應(yīng)是時(shí)間和濃度依賴性的(圖2)。Jurkat細(xì)胞與未經(jīng)稀釋的二氧化硅珠一起孵育導(dǎo)致細(xì)胞立即裂解。
與堿性珠相比，酸性珠(pH 2至pH 4)的細(xì)胞毒性較低。評(píng)估了兩種類型的陰離子型取代基帶有強(qiáng)酸性磺酸基的取代基(其在中性條件下是強(qiáng)的、可極化的)和帶有弱酸性羧基的取代基(其在pH7時(shí)解離度超過(guò)98％)。
與帶有磺酸取代基的二氧化硅珠相比，帶有弱酸性羧基取代基的二氧化硅珠未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性活性。
帶有略微酸性、中性和堿性的二氧化硅珠在pH 5～8時(shí)似乎對(duì)Jurkat細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。
實(shí)施例2 PAAG珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 材料和方法 利用標(biāo)準(zhǔn)乳化技術(shù)制備多種pH下?lián)饺牍潭ɑ娊赓|(zhì)(immobiline)的PAAG珠(大小～500nm)。將儲(chǔ)液貯存在+4℃冰箱中備用。
使用急性T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞系——克隆E6-1(ATCC登錄號(hào)為TIB-152)。將Jurkat細(xì)胞維持在添加有1mmol丙酮酸鈉、10％FBS和青霉素-鏈霉素-兩性霉素(1∶100)的RPMI-1640培養(yǎng)基中。
生存力和顯微鏡觀察 將2μl珠(用0.1％SDS溶液稀釋)加至25μl PBS中的106個(gè)Jurkat細(xì)胞中。加入LIVE/DEAD染料(LIVE-DEAD生存力試劑盒，Molecular Probes)(0.15μl)，于室溫下孵育。使用熒光顯微鏡(Axioskop2plus；濾光片4-3)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和生存力。
結(jié)果 使用上述Molecular Probe的LIVE/DEAD生存力試劑盒對(duì)經(jīng)PAAG珠處理的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察。
使Jurkat細(xì)胞與PAAG珠接觸。珠/Jurkat細(xì)胞的比值為1∶20～1∶80，分別對(duì)應(yīng)于3×106～0.75×106個(gè)顆粒/細(xì)胞。利用熒光顯微鏡測(cè)定各組PAAG珠的7～10個(gè)隨機(jī)視野中死細(xì)胞和活細(xì)胞的百分比。使用未經(jīng)涂覆的珠作為這些實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。
圖3表示PAAG珠之細(xì)胞毒作用的pH和時(shí)間依賴性。
圖3中示出了該實(shí)驗(yàn)中死Jurkat細(xì)胞的百分比。數(shù)據(jù)表明，攜帶強(qiáng)正電荷和強(qiáng)負(fù)電荷的PAAG珠表現(xiàn)出高的細(xì)胞毒性。該作用是時(shí)間和濃度依賴性的。
與堿性珠相比，酸性珠(pH 2～pH 4)的細(xì)胞毒性較低。評(píng)估了兩種類型的陰離子型取代基帶有強(qiáng)酸性磺酸基的取代基(其在中性條件下是強(qiáng)的、可極化的)和帶有弱酸性羧基的取代基(其在pH～7時(shí)解離度超過(guò)98％)。
實(shí)施例3 兩種Amberlite TM珠CG-120-I和CG-400-II對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 材料和方法 測(cè)試了兩種Amberlite TM珠CG-120-I和CG-400-II對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。其中Amberlite TM CG-120-II(Fluka，06469)為磺酸官能化的、Na+形式、200～400目的強(qiáng)酸性凝膠型樹(shù)脂；AmberliteTM CG-400-II(Fluka，06471)為季銨官能化的、Cl-形式、200～400目的強(qiáng)堿性凝膠型樹(shù)脂。
將0.15μl染料混合物(Molecular Probes的LIVE/DEAD生存力試劑盒)加至20μl PBS中的Jurkat細(xì)胞(5×105個(gè)細(xì)胞)中。然后將5μl PBS中的Amberlite TM珠(5×105個(gè)珠)加至細(xì)胞懸液中。立即將7μl經(jīng)染色的細(xì)胞混懸物移至顯微鏡載玻片上并蓋上蓋玻片。利用4-3綠色濾光片在熒光顯微鏡下測(cè)量活的和死的Jurkat細(xì)胞。
結(jié)果 結(jié)果顯示，對(duì)照和兩種Amberlite TM珠之間沒(méi)有實(shí)質(zhì)性差異。這似乎表明Na+形式和Cl-形式對(duì)Jurkat細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒性。
實(shí)施例4 兩種經(jīng)轉(zhuǎn)化的Amberlite TM珠CG-120-I和CG-400-II對(duì)Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 材料和方法 根據(jù)以下步驟將上述Amberlite TM珠轉(zhuǎn)化成H+和OH-形式在室溫下將Amberlite TM GC-120(～100mg)于2ml 0.5M HCl中孵育30分鐘。在室溫下將Amberlite TM GC-400(～100mg)于2ml 0.5MNaOH中孵育30分鐘。然后用～50ml蒸餾水清洗珠直至兩種AmberliteTM類型(GC-120和GC-400)的清洗pH為5～6。用水制備濃度為1mg/ml(105個(gè)珠/ml)的儲(chǔ)備混懸液。Amberlite TM CG-120-II(Fluka，06469)為磺酸官能化的、H+形式、200～400目的強(qiáng)酸性凝膠型樹(shù)脂。Amberlite TM CG-400-II(Fluka，06471)為季銨官能化的、OH-形式、200～400目的強(qiáng)堿性凝膠型樹(shù)脂。將0.15μl染料混合物(市售MolecularProbes的LIVE/DEAD生存力試劑盒)加至20μl PBS中的Jurkat細(xì)胞(5×105個(gè)細(xì)胞)中。然后將5μl PBS中的Amberlite TM珠(5×105個(gè)珠)加至細(xì)胞懸液中。立即將7μl經(jīng)染色的細(xì)胞混懸液移至顯微鏡載玻片上并蓋上蓋玻片。利用4-3綠色濾光片于熒光顯微鏡下測(cè)量活的和死的Jurkat細(xì)胞。
結(jié)果 兩種類型的轉(zhuǎn)化Amberlite TM珠CG-120-I和CG-400-II被轉(zhuǎn)化為H+和OH-形式。Jurkat細(xì)胞與OH-形式的CG-400相互作用導(dǎo)致Jurkat細(xì)胞裂解；我們沒(méi)有觀察到CG-120H+形式與對(duì)照之間有任何差異。
未發(fā)現(xiàn)CG-120H+形式與對(duì)照之間存在差異。Jurkat細(xì)胞與OH-形式的CG-400相互作用導(dǎo)致細(xì)胞裂解。
實(shí)施例5 經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)HT-29細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 材料和方法 如上文所述制備經(jīng)PAAG涂覆的和未經(jīng)涂覆的二氧化硅珠(Sigma，貨號(hào)421553)。將儲(chǔ)液貯存在+4℃冰箱中備用。將HT-29細(xì)胞維持在添加有10％FBS和青霉素-鏈霉素-兩性霉素(1∶100)的DMEM培養(yǎng)基中。
磺酰羅丹明細(xì)胞毒性測(cè)試(針對(duì)HT-29細(xì)胞) 將含有1～2×104個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基等份分配到96孔板(Falcon)中。第二天，用95μl新鮮培養(yǎng)基和5μl含有不同濃度的相應(yīng)珠的混懸液替換培養(yǎng)基。然后在37℃下孵育該板72小時(shí)，然后向每孔中添加50μl 50％TCA。然后加入磺酰羅丹明試劑，根據(jù)下述步驟測(cè)定細(xì)胞毒作用 第一天加入2.5ml/板的胰蛋白酶-EDTA，室溫放置10分鐘(細(xì)胞分離)；將細(xì)胞-胰蛋白酶-EDTA轉(zhuǎn)移到50ml管中；加入30mlDMEM/10％FCS培養(yǎng)基；以1500rpm離心10分鐘；用20ml DMED/10％FCS培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞；以1500rpm離心10分鐘；用4ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；利用X ml細(xì)胞懸液和Y ml培養(yǎng)基制備混合物；向96孔板的每一孔中添加200μl細(xì)胞(2×104個(gè)細(xì)胞/200μl)；于37℃在CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
第二天更換培養(yǎng)基，添加培養(yǎng)基、溶劑和6種不同濃度的珠；添加新鮮培養(yǎng)基、溶劑和珠混懸液；于37℃在CO2培養(yǎng)箱中孵育50小時(shí)。
第三天用新鮮培養(yǎng)基清洗五次；添加50μl 50％TCA(終濃度為10％TCA)；在4℃孵育1小時(shí)；棄掉上清液；用自來(lái)水清洗5次；將板翻轉(zhuǎn)并在紙上輕輕敲打以除去殘留的水；在化學(xué)通風(fēng)櫥中進(jìn)行空氣干燥過(guò)夜。
第四天加入100μl磺酰羅丹明B(在1％乙酸中為0.4％(重量/體積))；在室溫下孵育10分鐘；通過(guò)用200μl 1％AcOH清洗5次除去未結(jié)合的染料；在化學(xué)通風(fēng)櫥中對(duì)板進(jìn)行空氣干燥至少2小時(shí)；用200μl 10mM Trizma堿(pH 10.3)提取細(xì)胞中的染料；在室溫下孵育至少10分鐘，同時(shí)進(jìn)行振搖；利用讀板儀于540nm處測(cè)量OD值(背景為620nm)。
結(jié)果 磺酰羅丹明B(SRB)測(cè)定用于確定細(xì)胞密度，其基于細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的測(cè)量值。該測(cè)定依賴于SRB與細(xì)胞的蛋白質(zhì)組分的結(jié)合能力，所述蛋白質(zhì)組分已通過(guò)三氯乙酸(TCA)固定在組織培養(yǎng)物板上。SRB是亮粉色氨基氧雜蒽染料，其在溫和的酸性條件下與堿性氨基酸殘基結(jié)合并在堿性條件下解離。因?yàn)镾RB的結(jié)合是化學(xué)計(jì)量性的，所以從經(jīng)染色細(xì)胞中提取出的染料的量與細(xì)胞量成正比。由于SRB染色強(qiáng)度較強(qiáng)，該分析可以96孔形式進(jìn)行。SRB測(cè)定的結(jié)果顯示，在密度為7.5×103～1.8×105個(gè)細(xì)胞/孔(對(duì)應(yīng)于匯合度1～200％)時(shí)，呈線性動(dòng)態(tài)范圍。
我們已對(duì)SRB測(cè)定進(jìn)行了改良，使其用于測(cè)試官能化珠對(duì)人HT-29細(xì)胞系(結(jié)腸腺癌)的毒性。為了在不同實(shí)驗(yàn)條件之間進(jìn)行比較，GI-50參數(shù)表示為為了誘導(dǎo)50％的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制所需的珠相對(duì)數(shù)(relative number of beads，RNB)。換句話說(shuō)，RNB值是本發(fā)明所公開(kāi)的其它實(shí)施例中所用的死細(xì)胞測(cè)量值百分比的倒數(shù)。
在下面的實(shí)驗(yàn)中，使HT-29細(xì)胞與經(jīng)官能化PAAG涂覆的二氧化硅珠接觸。還系統(tǒng)性地進(jìn)行了使用未改變之珠的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。珠∶HT-29細(xì)胞的比值為1∶20～1∶160或更高，這意味著對(duì)應(yīng)于每個(gè)HT-29細(xì)胞存在156,000,000～19,500,000個(gè)珠。重復(fù)SRB測(cè)定，對(duì)每個(gè)濃度的珠進(jìn)行6～8次重復(fù)(表3以及圖4和圖5)。
這些實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)PAAG涂覆的帶有強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性基團(tuán)的二氧化硅珠對(duì)HT-29細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。該作用在定性方面與所觀察的針對(duì)Jurkat細(xì)胞的作用(上述圖1～3)類似。然而，酸性二氧化硅珠對(duì)貼壁HT-29細(xì)胞的作用似乎比堿性珠的作用更強(qiáng)。
表3作為經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠pH(表1中的28～37號(hào)珠)之函數(shù)的RNB
圖4示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)HT-29(人腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞毒作用的pH依賴性。
在這些實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)PAAG涂覆的略微酸性和略微堿性的二氧化硅珠似乎對(duì)結(jié)腸HT-29細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。
經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制是濃度依賴性過(guò)程(圖5)。HT-29細(xì)胞與未經(jīng)稀釋的48號(hào)二氧化硅珠(pH 2)相互作用極其迅速地導(dǎo)致細(xì)胞裂解。
圖5示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)HT-29細(xì)胞的濃度依賴性細(xì)胞毒作用。
實(shí)施例6 PAAG珠對(duì)HT-29細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 材料和方法 利用標(biāo)準(zhǔn)乳化技術(shù)制備在多種pH下?lián)饺牍潭ɑ娊赓|(zhì)的PAAG珠(大小～500nm)。將儲(chǔ)液貯存在+4℃冰箱中備用。將HT-29細(xì)胞維持在添加有10％FBS和青霉素-鏈霉素-兩性霉素(1∶100)的DMEM培養(yǎng)基中。
磺酰羅丹明細(xì)胞毒性測(cè)試(針對(duì)HT-29細(xì)胞) 將含有1～2×104個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基等份分配到96孔板(Falcon)中。第二天，用95μl新鮮培養(yǎng)基和5μl含有不同濃度的相應(yīng)珠的混懸液替換培養(yǎng)基。然后在37℃孵育該板72小時(shí)，然后向每孔中添加50μl50％TCA。然后加入磺酰羅丹明試劑并根據(jù)上述方案測(cè)定細(xì)胞毒作用。
結(jié)果 如上文實(shí)施例5所述使用磺酰羅丹明B(SRB)測(cè)定。圖6示意PAAG珠對(duì)HT-29(人腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞毒作用的pH依賴性。在以下實(shí)驗(yàn)中，使HT-29細(xì)胞與官能化PAAG珠接觸。還系統(tǒng)性地進(jìn)行了使用未經(jīng)改變珠的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。珠∶HT-29細(xì)胞的比值為1∶20～1∶160或更高，這意味著對(duì)于每個(gè)HT-29細(xì)胞來(lái)說(shuō)存在156,000,000～19,500,000個(gè)珠。重復(fù)SRB測(cè)定，對(duì)每個(gè)濃度的珠進(jìn)行6～8次重復(fù)(圖6、7和8)。
這些實(shí)驗(yàn)表明，帶有強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性基團(tuán)的PAAG珠對(duì)HT-29細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。該作用在定性方面與所觀察的針對(duì)經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)HT-29細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞的作用(上述圖1-5)類似。
在這些實(shí)驗(yàn)條件下，所述略微酸性和略微堿性的PAAG珠似乎對(duì)結(jié)腸HT-29細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。
圖7示意PAAG珠(pH 2～6)對(duì)HT-29細(xì)胞的pH和濃度依賴性細(xì)胞毒作用；圖8表示PAAG珠(pH 7～11)對(duì)HT-29細(xì)胞的pH和濃度依賴性細(xì)胞毒作用。PAAG珠對(duì)HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制是濃度依賴性過(guò)程(圖7和8)。HT-29細(xì)胞與未經(jīng)稀釋的48號(hào)二氧化硅珠(pH 2)相互作用極其迅速地導(dǎo)致細(xì)胞裂解。
實(shí)施例7 經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠誘導(dǎo)溶血 材料和方法 珠的稀釋制備0.2ml稀釋的珠10+190μl PBS(Ca，Mg)。
RBC的制備將2ml血液加至13ml PBS中；輕輕地混合；在10℃以2000rpm離心7分鐘；除去不含RBC的上清液；將13ml PBS加到所得沉淀物中并輕輕混合；如步驟3所述進(jìn)行離心；除去上清液并將RBC重懸在PBS中至最終體積10ml；置于冰上備用。
溶血活性的測(cè)定將10μl稀釋的珠加至50μl經(jīng)清洗的RBC中，于37℃孵育并連續(xù)振搖4小時(shí)；在10℃以2000rpm離心7分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到新板(平底)中，測(cè)量540nm處的吸光度。
結(jié)果 圖9表示經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠誘導(dǎo)的RBC溶血作用(見(jiàn)表1)。其表明所有官能化的以及未改性的二氧化硅珠均表現(xiàn)出強(qiáng)的溶血作用。
珠的稀釋制備0.2ml稀釋的珠10+190μl PBS(Ca，Mg)。
RBC的制備將2ml血液加到13ml PBS中；輕輕地混合；在10℃以2000rpm離心7分鐘；除去不含RBC的上清液；將13ml PBS加到所得沉淀物中并輕輕混合；如步驟3所述進(jìn)行離心；除去上清液并將RBC重懸在PBS中至最終體積10ml；置于冰上備用。
溶血活性的測(cè)定將10μl稀釋的珠加到50μl清洗的RBC中，于37℃孵育并連續(xù)振搖4小時(shí)；在10℃以2000rpm離心7分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到新板(平底)中，測(cè)量540nm處的吸光度。
結(jié)果 結(jié)果表明所有官能化的以及未改性的二氧化硅珠均表現(xiàn)出強(qiáng)的溶血作用(圖9)。
實(shí)施例8 PAAG珠和經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡 材料和方法 如上文所述制備PAAG珠和經(jīng)PAAG涂覆的和未涂覆的二氧化硅珠(Sigma，貨號(hào)421553)。將儲(chǔ)液貯存在+4℃冰箱中備用。
使用急性T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞系——克隆E6-1(ATCC登錄號(hào)為TIB-152)。將Jurkat細(xì)胞維持在添加有1mmol丙酮酸鈉、10％FBS和青霉素-鏈霉素-兩性霉素(1∶100)的RPMI-1640培養(yǎng)基中。
生存力和顯微鏡觀察 將2μl珠(用0.1％SDS溶液稀釋)加至25μl PBS中的106個(gè)Jurkat細(xì)胞中。加入LIVE/DEAD染料(市售的LIVE-DEAD生存力試劑盒，Molecular Probes)(0.15μl)，于室溫下孵育。利用熒光顯微鏡(Axioskop 2plus；濾光片4-3)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和生存力。
使用Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Santa Cruz Biotechnology)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
細(xì)胞凋亡-壞死的誘導(dǎo) 按照下述方法進(jìn)行將2μl珠(以1∶30在SDS中稀釋)加至20μlPBS中的Jurkat細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞)中，在室溫孵育20分鐘；在2000rpm離心3分鐘后收集細(xì)胞；用PBS清洗細(xì)胞沉淀物并以106個(gè)細(xì)胞/100μl的濃度重懸在1×測(cè)定緩沖液中；加入2μl Annexin V FITC和10μl PI(Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒；Santa Cruz Biotechnology)；于室溫下在黑暗中渦漩并孵育15分鐘；將10μl細(xì)胞懸液置于載玻片上并蓋上蓋玻片。對(duì)于單獨(dú)的PI而言，利用濾光片4-3或4-4在顯微鏡下觀察結(jié)果。使用下述對(duì)照Annexin V FITC+PI；無(wú)Annexin V FITC并且無(wú)PI；單獨(dú)的Annexin V FITC以及單獨(dú)的PI。
結(jié)果 以下參照?qǐng)D10-18。圖10示意PAAG珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的pH誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性活細(xì)胞的百分比。圖11示意PAAG珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的pH誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性死細(xì)胞的百分比。圖12示意PAAG珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的pH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。圖13示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的pH誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性活細(xì)胞的百分比。圖14示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的pH誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性死細(xì)胞的百分比。圖15示意經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠對(duì)Jurkat細(xì)胞的pH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。圖16示意與經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠pH 2(表1中的48號(hào))孵育5分鐘后利用Hoechst 33342試劑染色的Jurkat細(xì)胞。圖17示意與經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠pH 2(表1中的48號(hào))孵育30分鐘后利用Annexin V-PI和DEAD/LIVE染料染色的Jurkat細(xì)胞。圖18顯示與經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠pH2(表1中的48號(hào))孵育90分鐘后利用Annexin V-PI和DEAD/LIVE染料染色的Jurkat細(xì)胞。
用3號(hào)(pH 4.5)和48號(hào)(pH 2)二氧化硅珠以及45-47號(hào)PAAG珠(pH 9～pH 11)處理后表明存在早期凋亡的細(xì)胞(有限的核片段化和綠色外觀)。另一方面，利用48號(hào)二氧化硅珠處理Jurkat細(xì)胞后還觀察到具有特征性核片段化的晚期凋亡(表4以及圖10-18)。
表4經(jīng)PAAG涂覆的二氧化硅珠pH2-pH8.5(48-55號(hào))對(duì)Jurkat細(xì)胞的pH誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡
實(shí)施例9 通過(guò)浸漬和涂覆酸性和堿性離子交換珠來(lái)調(diào)節(jié)pH介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 實(shí)驗(yàn)1 該實(shí)施例的目的是證明通過(guò)利用中性、水可滲透性聚合物來(lái)浸漬和涂覆酸性和堿性離子交換珠以產(chǎn)生離子選擇性屏障并且減慢離子交換過(guò)程而提高了抗菌性能。
材料和方法 市售的離子交換物質(zhì)用20％聚丙酰胺浸漬Amberlite TMCG-400-II珠(OH-形式)和Amberlite TM IR-120-II珠(H+形式)(Rohmand Haas，珠大小～100微米)。
將所述珠沉積在接種金黃色葡萄球菌(S.aureus)的瓊脂板上，通過(guò)在37℃下孵育24小時(shí)后于所述珠周圍產(chǎn)生的光暈半徑評(píng)價(jià)抗菌毒性。
利用未經(jīng)處理的珠進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果 經(jīng)涂覆珠周圍的光暈半徑是未經(jīng)涂覆珠周圍光暈半徑的兩倍(分別為1mm和0.5mm)。
實(shí)驗(yàn)2 該實(shí)施例的目的是證明通過(guò)利用離聚物聚合物來(lái)浸漬離子交換珠可提高本發(fā)明材料和組合物的pH介導(dǎo)的細(xì)菌毒性。
材料和方法 用市售的NafionTM(Dupont)溶液浸漬市售的離子交換物質(zhì)和Amberlite TM IR-120II珠(H形式)(Rohm and Haas，珠大小～100微米)，然后干燥并在所述離子交換樹(shù)脂的多孔基質(zhì)內(nèi)聚合。
將通過(guò)此方法得到的珠沉積在接種有金黃色葡萄球菌的瓊脂板上，通過(guò)在37℃孵育24小時(shí)后于所述珠周圍產(chǎn)生的光暈半徑評(píng)價(jià)抗菌毒性。利用未經(jīng)處理的珠進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。利用未經(jīng)處理的珠進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果 經(jīng)NafionTM涂覆的珠周圍的光暈半徑是未經(jīng)涂覆珠周圍光暈半徑的4倍以上(分別為3mm和0.7mm)。
結(jié)論 本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明本文所提議的殺死細(xì)胞的主要機(jī)制是基于細(xì)胞與強(qiáng)酸性和/或強(qiáng)堿性材料和組合物之間的優(yōu)先的質(zhì)子和/或羥基交換，并為其提供證據(jù)。本發(fā)明的材料和組合物通過(guò)將細(xì)胞與強(qiáng)酸性和/或強(qiáng)堿緩沖劑等接觸的“滴定樣過(guò)程(titration-like process)”來(lái)發(fā)揮其細(xì)胞殺死作用。
測(cè)試該主要機(jī)制并發(fā)現(xiàn)其有效抗御懸浮生長(zhǎng)的Jurkat細(xì)胞、貼壁的HT-29細(xì)胞以及細(xì)菌細(xì)胞。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的材料和組合物的細(xì)胞毒作用是pH、時(shí)間和濃度依賴性過(guò)程；使用強(qiáng)荷電的二氧化硅珠(最終稀釋度1∶20)導(dǎo)致Jurkat和HT-29細(xì)胞立即裂解。在Jurkat細(xì)胞與經(jīng)轉(zhuǎn)化的Amberlite TM CG-400(以其OH-形式)的相互作用中，該作用也很明顯。
可通過(guò)用聚合物屏障和/或離聚物屏障材料浸漬和涂覆酸性和堿性離子交換物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)pH介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
此外，本發(fā)明材料和組合物的細(xì)胞殺死過(guò)程的作用機(jī)制還包括在靶細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞裂解之前發(fā)生早期和晚期細(xì)胞凋亡。該觀察結(jié)果還支持以下觀點(diǎn)與現(xiàn)有技術(shù)中已知的其它材料和組合物不同，本發(fā)明的材料和組合物通過(guò)導(dǎo)致破壞細(xì)胞pH穩(wěn)態(tài)并因此導(dǎo)致細(xì)胞死亡的“滴定樣過(guò)程”來(lái)發(fā)揮其細(xì)胞殺死作用。
實(shí)施例10 維持pH的抗菌硅氧烷片 制備含有酸性和堿性離子交換珠之混合物的硅氧烷基質(zhì)。所述組合物含有40％的Amberlite TM 1200IRA(OH-形式)(Rohm and Haas)和60％的Amberlit IR 120(H+形式)(Rohm and Haas)。將該離子交換珠混合物以40％硅橡膠(GE)和60％Amberlite TM混合物的比例摻入惰性硅橡膠溶液中，沉積在小的玻璃罐的內(nèi)表面上并在80℃聚合12小時(shí)。
如下測(cè)試經(jīng)涂覆罐的抗菌活性制備輸入濃度為660cfu/ml的大腸桿菌(E.coli)。將5ml TSB+大腸桿菌加到罐中。24小時(shí)后，從所述罐中取樣并進(jìn)行十進(jìn)位稀釋并鋪在TSA板上。在30℃孵育24小時(shí)后，對(duì)菌落計(jì)數(shù)。
結(jié)果 表5“中性材料(NEUTRAL)”的抗菌活性
含有抗菌材料“中性材料”的管內(nèi)的PH值等于7。
圖21和22分別表示對(duì)組合物A和B的活性測(cè)試。
對(duì)于滲漏實(shí)驗(yàn)而言，將100mg抗菌材料“中性材料”加到5ml無(wú)菌水中。在30℃孵育48小時(shí)。通過(guò)ICP法測(cè)定鉀離子、硅酮離子、鈉離子和硫酸根離子。
表6滲漏(mg/l)來(lái)自18.03.08的1440308號(hào)的實(shí)驗(yàn) 元素 滲漏(mg/l) S1.15 Si ＜0.002 Na 0.32 K0.29 表6的結(jié)果顯示從所述涂層中釋放出來(lái)的物質(zhì)可忽略不計(jì)。
實(shí)施例11 非滲漏的生物活性聚合物(Suflon TM) 通過(guò)下述方法合成復(fù)合型酸性聚合物將正辛烷(20％)乳液(CAS[116-14-3]Du Pont)中的Teflon(四氟乙烯)單體與正己烷(Frutarom，Israel)中采用酸性溶液(27％)(Sigma貨號(hào)No.659592-25ML)形式的隨機(jī)交聯(lián)聚苯乙烯磺酸鹽混合。
將所述混合物以一定比例沉積在高壓鍋中并于50℃和10個(gè)大氣壓下發(fā)生共聚反應(yīng)。
利用0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)使所得溶液沉積并壓制成0.5mm厚的片。
如下測(cè)試所述聚合物對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抗菌作用將40mg活性聚合物片段沉積在TSB中的1ml經(jīng)稀釋細(xì)菌(1.E+0.4cfu/ml)中。對(duì)照管僅含有TSB中的細(xì)菌。將管于30℃下在定軌搖床中保持24小時(shí)，然后取樣用于cfu和pH測(cè)量。
結(jié)果如下 表7Suflon TM的抗菌活性
結(jié)果表明在Suflon TM存在下對(duì)大腸桿菌增殖的抑制為4log。
對(duì)于滲漏實(shí)驗(yàn)而言，將5ml無(wú)菌水(對(duì)照)和在5ml無(wú)菌水中的40mg Suflon TM于30℃在15ml的聚丙烯管中孵育24小時(shí)。利用Spectrolab Ltd(IL)的ICP MS法分析這兩個(gè)水樣。
表8 ICP分析
結(jié)果顯示從聚合物基質(zhì)中釋放出來(lái)的物質(zhì)可忽略不計(jì)。
ICP分析顯示在含有活性聚合物樣品的水中未發(fā)現(xiàn)Na、K和S，證明所述聚合物組合物不滲漏任何成分。
實(shí)施例12 硅氧烷片的抗菌活性 制備表現(xiàn)出殺菌活性的兩種類型的硅氧烷樹(shù)脂 組合物A10％2-苯基-5-苯并咪唑-磺酸(Sigma 43716625ml)；5％磺化的聚(苯乙烯ran-乙烯)(Poly(styrene ran-ethylene)，sulfonated)(Sigma 659401-25ML)；80％Siloprene LSR 2060(GE)；5％增塑劑RE-AS-2001(MFK Inc)。將所述混合物鋪展在玻璃板(厚度1g/10cm2)上并于200℃聚合3小時(shí)。將所聚合的片從玻璃上剝下來(lái)并進(jìn)行測(cè)試。
組合物B15％2-苯基-5-苯并咪唑-磺酸(Sigma 43716625ml)；80％Siloprene LSR 2060(GE)；5％增塑劑RE-AS-2001。將所述混合物鋪展在玻璃板(厚度1g/10cm2)上并于200℃聚合3小時(shí)。將所聚合的片從玻璃上剝下來(lái)并進(jìn)行測(cè)試。
使大腸桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜，并以1∶104稀釋。將組合物A和組合物B的100mg硅氧烷片切下，置于Eppendorf管中。將1ml稀釋的培養(yǎng)物加到所述管中。于室溫下旋轉(zhuǎn)該管，于0小時(shí)和24小時(shí)取樣。將樣品進(jìn)行十進(jìn)制稀釋，接種在TSA板上，24小時(shí)后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。
對(duì)于滲漏實(shí)驗(yàn)而言，將每片為100mg的組合物A和組合物B的硅氧烷片置于5ml無(wú)菌水中。于30℃下孵育48小時(shí)。通過(guò)ICP法測(cè)定K、Na、S和Si。
表9組合物A的ICP分析(變化)
表2組合物B的ICP分析(變化)
結(jié)果顯示從聚合物基質(zhì)中釋放出來(lái)的物質(zhì)可忽略不計(jì)。
圖21和22分別表示組合物A和B的活性測(cè)試。圖23表示為白色念珠菌(ATCC 10231)的測(cè)試微生物。
因此，這些PSS系統(tǒng)表現(xiàn)出高效的殺菌作用，同時(shí)LTC環(huán)境中的滲漏和pH變化可忽略不計(jì)。
實(shí)施例13 含PSS的硅氧烷片的殺生活性的再生 制備表現(xiàn)出殺菌活性的兩種類型的硅氧烷樹(shù)脂。將有效量的酸(在此為抗壞血酸(維生素C))與含有有效量的聚苯乙烯磺酸鈉的離子交換劑以及其它類型的PSS一起使用。發(fā)現(xiàn)所述酸通過(guò)提供質(zhì)子而使鹽形式的PSS再生。
此外，提供了制備用品，例如用于食品、飲料(例如果汁)、洗劑、霜?jiǎng)┑陌鷰?bandage)和包裝，利用有效量的酸使PSS活性再生。
實(shí)施例14 細(xì)胞間pH對(duì)比細(xì)胞內(nèi)pH 材料和方法 所述組合物含有40％的Amberlite TM 1200IRA(OH-形式)(Rohm and Haas)和60％的Amberlite IR 120(H+形式)(Rohm andHaas)。將該離子交換珠混合物以40％硅橡膠(GE)和60％AmberliteTM混合物的比例摻入惰性硅橡膠溶液中，沉積在小玻璃罐的內(nèi)表面上并在80℃下聚合12小時(shí)。如上文所述使用大腸桿菌。類似地，如上文所述制備PAAG珠和經(jīng)PAAG涂覆的和未涂覆的二氧化硅珠。將儲(chǔ)液貯存在+4℃冰箱中備用。如上文所述使用急性T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞系——克隆E6-1。將Jurkat細(xì)胞維持在添加有1mmol丙酮酸鈉、10％FBS和青霉素-鏈霉素-兩性霉素(1∶100)的RPMI-1640培養(yǎng)基中。使用市售的pH依賴型染料。
結(jié)果 通過(guò)將pH指示劑染料摻入細(xì)胞內(nèi)證實(shí)細(xì)胞內(nèi)pH顯著改變。由于細(xì)胞內(nèi)pH改變而觀察到染料顏色改變。
權(quán)利要求
1.不溶性質(zhì)子庫(kù)或質(zhì)子源(PSS)，其可用于通過(guò)接觸來(lái)殺死活的靶細(xì)胞(LTC)或者破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用；所述PSS包含(i)提供緩沖能力的質(zhì)子源或質(zhì)子庫(kù)；以及(ii)提供質(zhì)子傳導(dǎo)性和/或電勢(shì)的裝置；其中所述PSS有效破壞LTC限定體積內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡和/或破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH。
2.權(quán)利要求1的PSS，其中所述質(zhì)子傳導(dǎo)性通過(guò)水滲透性和/或通過(guò)潤(rùn)濕性來(lái)提供，尤其是其中所述潤(rùn)濕性通過(guò)親水性添加劑來(lái)提供。
3.權(quán)利要求2的PSS，其中所述質(zhì)子傳導(dǎo)性或潤(rùn)濕性通過(guò)固有性質(zhì)子傳導(dǎo)材料(IPCM)和/或固有性親水性聚合物(IHP)來(lái)提供，尤其是通過(guò)選自以下的IPCM和/或IHP來(lái)提供磺化四氟乙烯共聚物；選自二氧化硅、聚硫醚砜(SPTES)、苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯(S-SEBS)、聚醚-醚-酮(PEEK)、聚(亞芳基-醚-砜)(PSU)、聚偏氟乙烯(PVDF)接枝的苯乙烯、聚苯并咪唑(PBI)和聚磷腈的磺化材料，用交聯(lián)聚苯乙烯磺酸鹽(PSS鹽)離子交換樹(shù)脂的微米級(jí)懸浮顆粒澆鑄聚苯乙烯磺酸鹽溶液所制備的質(zhì)子交換膜；市售的Nafion TM及其衍生物。
4.權(quán)利要求1的PSS，其包含兩個(gè)或更多個(gè)二維(2D)或三維(3D)的PSS，每個(gè)所述PSS由含有高度解離的陽(yáng)離子和/或陰離子基團(tuán)(HDCA)的材料組成，所述基團(tuán)以有效地將LTC環(huán)境中的pH變化降至最小的方式進(jìn)行空間組織；每種所述HDCA任選地以有效將LTC環(huán)境中pH變化降至最小的特定2D、拓?fù)湔郫B的2D表面或3D方式進(jìn)行空間組織；此外任選地，所述進(jìn)行空間組織的HDCA的至少一部分以選自以下的方式進(jìn)行2D或3D排布(i)交錯(cuò)；(ii)重疊；(iii)綴合；(iv)均勻或不均勻混合以及(iv)平鋪。
5.權(quán)利要求1的PSS，其中所述PSS有效地破壞限定體積內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)同時(shí)有效維持所述LTC環(huán)境的完整性；此外，其中所述環(huán)境的完整性通過(guò)選自以下的參數(shù)來(lái)表征所述環(huán)境功能性、化學(xué)性質(zhì)；可溶物濃度，可能除了質(zhì)子或羥基濃度以外；生物學(xué)相關(guān)的參數(shù)；生態(tài)學(xué)相關(guān)的參數(shù)；物理參數(shù)，尤其是顆粒大小分布、流變學(xué)和粘稠度；安全性參數(shù)，尤其是毒性，或者影響LD50或ICT50的參數(shù)；嗅覺(jué)或感官參數(shù)(例如顏色、味道、氣味、質(zhì)地、概念性外觀等)；或上述的任意組合。
6.權(quán)利要求1的PSS，其可用于破壞所述LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用，同時(shí)既(i)有效維持所述LTC環(huán)境的pH又(ii)最小程度地影響所述LTC環(huán)境的完整性，使得從所述PSS滲漏到LTC環(huán)境中的離子化或中性原子、分子或顆粒(AMP)降至最低。
7.權(quán)利要求1的PSS，其可用于破壞所述LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用，同時(shí)較少破壞至少一個(gè)第二限定體積(例如非靶細(xì)胞(NTC))內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡。
8.權(quán)利要求7的PSS，其中通過(guò)以下方式中的一種或多種來(lái)實(shí)現(xiàn)區(qū)分所述LTC與NTC(i)提供差異性離子能力；(ii)提供差異性pH值；(iii)優(yōu)化PSS與靶細(xì)胞大小比例；(iv)提供所述PSS的差異性2D、拓?fù)湔郫B的2D表面或3D空間構(gòu)型；(v)提供在每一指定體積內(nèi)具有所定義能力的臨界數(shù)目的PSS顆粒(或可用的表面)；以及(vi)提供尺寸排阻工具/裝置。
9.權(quán)利要求1的PSS，其中所述PSS是含有羧酸和/或磺酸基團(tuán)的天然有機(jī)酸，尤其是選自由松香/松脂、松木樹(shù)脂、酸性和堿性萜類提供的松香酸(C20H30O2)的組合物。
10.權(quán)利要求1的PSS，其還包含有效量的添加劑。
11.一種產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求1的至少一種不溶性非滲漏PSS；所述PSS位于所述產(chǎn)品的內(nèi)表面和/或外表面上，其可用于通過(guò)接觸來(lái)破壞LTC至少一部分內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，同時(shí)有效維持所述表面的pH和功能。
12.權(quán)利要求11的產(chǎn)品，其可用于通過(guò)接觸來(lái)殺死細(xì)胞，其包含具有指定功能的至少一個(gè)質(zhì)子可滲透外表面，所述表面至少部分地由PSS組成或者用PSS鋪層于所述表面的局部和/或下面，從而破壞所述LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持所述LTC環(huán)境的pH和所述功能。
13.權(quán)利要求11的產(chǎn)品，其包含表面以及一個(gè)或多個(gè)質(zhì)子可滲透的外層，所述各層被置于所述表面的至少一部分上，其中所述層至少部分地由PSS組成或鋪成，從而破壞所述LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持所述LTC環(huán)境的pH和所述功能。
14.權(quán)利要求13的產(chǎn)品，其包含(i)至少一個(gè)PSS和(ii)一個(gè)或多個(gè)保護(hù)性屏障，其為所述PSS提供長(zhǎng)期持續(xù)的活性；優(yōu)選地，其中至少一個(gè)屏障是適于避免重離子擴(kuò)散的聚合物保護(hù)性屏障；此外優(yōu)選地，其中所述聚合物是離聚物屏障，特別是市售的Nafion TM。
15.權(quán)利要求1的PSS，其適于避免產(chǎn)生LTC抗性和針對(duì)抗性突變的選擇。
16.用于殺死活的靶細(xì)胞(LTC)或者破壞所述LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用的方法，該方法包括以下步驟
a.提供至少一種具有(i)提供緩沖能力之質(zhì)子源或質(zhì)子庫(kù)以及(ii)提供質(zhì)子傳導(dǎo)性和/或電勢(shì)之裝置的PSS；
b.使所述LTC與所述PSS接觸；以及
c.利用所述PSS有效破壞所述LTC內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，同時(shí)有效維持所述LTC環(huán)境的pH。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述步驟(a)還包括以下步驟向所述PSS提供水滲透性和/或潤(rùn)濕性的，特別是其中所述質(zhì)子傳導(dǎo)性和潤(rùn)濕性至少部分地通過(guò)向所述PSS提供親水性添加劑來(lái)獲得。
18.權(quán)利要求16的方法，其還包括以下步驟向所述PSS提供固有性質(zhì)子傳導(dǎo)材料(IPCM)和/或固有性親水性聚合物(IHP)，尤其是通過(guò)選自以下的所述IPCM和/或IHP來(lái)提供磺化四氟乙烯共聚物；選自二氧化硅、聚硫醚砜(SPTES)、苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯(S-SEBS)、聚醚-醚-酮(PEEK)、聚(亞芳基-醚-砜)(PSU)、聚偏氟乙烯(PVDF)接枝的苯乙烯、聚苯并咪唑(PBI)和聚磷腈的磺化材料；用交聯(lián)聚苯乙烯磺酸鹽(PSS鹽)離子交換樹(shù)脂的微米級(jí)懸浮顆粒澆鑄聚苯乙烯磺酸鹽溶液所制備的質(zhì)子交換膜；市售的Nafion TM及其衍生物。
19.權(quán)利要求16的方法，其還包括以下步驟
c.提供兩種或多種二維(2D)或三維(3D)的PSS，每種所述PSS由含有高度解離的陽(yáng)離子和/或陰離子基團(tuán)(HDCA)的材料組成；以及
d.以使LTC環(huán)境的pH變化降至最小的方式對(duì)所述HDCA進(jìn)行空間組織。
20.權(quán)利要求19的方法，其還包括以下步驟以使LTC環(huán)境的pH變化降至最小的特定2D或3D方式對(duì)每種所述HDCA進(jìn)行空間組織。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述組織步驟是以選自以下的方式來(lái)提供的(i)使所述HDCA交錯(cuò)；(ii)使所述HDCA重疊；(iii)使所述HDCA綴合；(iv)使所述HDCA均勻或不均勻混合；以及(v)使其平鋪。
22.權(quán)利要求16的方法，其還包括以下步驟通過(guò)PSS破壞LTC至少一部分內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，同時(shí)既(i)有效維持所述LTC環(huán)境的pH，又(ii)最小程度地影響所述LTC環(huán)境的完整性；所述方法尤其地通過(guò)使從PSS滲漏到所述環(huán)境中的離子化或電中性原子、分子或顆粒(AMP)降至最低來(lái)提供。
23.權(quán)利要求16的方法，其還包括以下步驟優(yōu)先破壞至少一個(gè)第一限定體積(例如活的靶細(xì)胞(LTC))內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，同時(shí)較少破壞至少一個(gè)第二限定體積(例如非靶細(xì)胞(NTC))內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)。
24.權(quán)利要求23的區(qū)分方法，其中通過(guò)下述步驟中的一個(gè)或多個(gè)來(lái)實(shí)現(xiàn)所述LTC與NTC之間的區(qū)分(i)提供差異性離子能力；(ii)提供差異性pH值；(iii)優(yōu)化PSS與LTC的大小比例；(iv)在PSS整體頂部上設(shè)計(jì)所述PSS邊界的差異性空間構(gòu)型；(v)提供在每一指定體積內(nèi)具有所定義能力的臨界數(shù)目的PSS顆粒(或可用的表面)；以及(vi)提供尺寸排阻工具/裝置。
25.用于制備產(chǎn)品的方法，其包括以下步驟提供權(quán)利要求1的PSS；將所述PSS置于所述產(chǎn)品的表面之上或之上；以及通過(guò)將所述PSS與LTC接觸來(lái)破壞所述LTC至少一部分的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，同時(shí)有效維持所述表面的pH和功能。
26.權(quán)利要求25的方法，其還包括以下步驟
a.提供至少一個(gè)質(zhì)子可滲透的外表面；
b.向所述表面的至少一部分提供至少一種PSS的和/或?qū)⒅辽僖环NPSS鋪層于所述表面之上或之下；從而殺死LTC或者破壞所述LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用，同時(shí)有效維持所述LTC環(huán)境的pH和功能。
27.權(quán)利要求25的方法，其還包括以下步驟
a.向至少一個(gè)質(zhì)子可滲透的外表面提供指定功能；
b.將一個(gè)或多個(gè)質(zhì)子可滲透的外層置于所述表面至少一部分的局部和/或下面；所述一個(gè)或多個(gè)層至少部分地由至少一種PSS組成或鋪成；以及
c.殺死LTC或者破壞所述LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用，同時(shí)有效維持所述LTC環(huán)境的pH和表面功能。
28.權(quán)利要求16的方法，其包括以下步驟
a.提供至少一種PSS；以及
b.向所述PSS提供至少一個(gè)保護(hù)性屏障，從而獲得長(zhǎng)期持續(xù)的作用。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述提供屏障的步驟是通過(guò)使用適于避免重離子擴(kuò)散的聚合物保護(hù)性屏障來(lái)實(shí)現(xiàn)的，優(yōu)選通過(guò)提供作為離聚化屏障的所述聚合物來(lái)實(shí)現(xiàn)，特別是通過(guò)應(yīng)用市售的Nafion TM產(chǎn)品來(lái)實(shí)現(xiàn)。
30.用于誘導(dǎo)LTC群的至少一部分發(fā)生細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括以下步驟
a.得到權(quán)利要求1的至少一種PSS；
b.使所述PSS與LTC接觸；以及
c.有效破壞所述LTC內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，使得所述LTC發(fā)生細(xì)胞凋亡，同時(shí)有效維持所述LTC環(huán)境的pH。
31.用于避免產(chǎn)生LTC抗性和針對(duì)抗性突變的選擇的方法，該方法包括以下步驟
a.得到權(quán)利要求1的至少一種PSS；
b.使所述PSS與LTC接觸，以及
c.有效破壞所述LTC內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡，使得避免產(chǎn)生LTC抗性和針對(duì)抗性突變的選擇，同時(shí)有效維持所述LTC的環(huán)境pH。
32.治療患者的方法，其包括以下步驟
a.得到非天然的醫(yī)療植入物或醫(yī)療設(shè)備；
b.向所述植入物提供權(quán)利要求1的至少一種PSS，其適于破壞LTC內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡；
c.將所述植入物植入患者體內(nèi)，或者將所述植入物施用到所述患者表面使得該植入物與至少一種LTC接觸；以及
d.破壞所述LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持所述LTC環(huán)境的pH。
33.治療患者的方法，其包括以下步驟
a.以使所述PSS與至少一種LTC接觸的方式向患者施用有效量的權(quán)利要求1的PSS；以及
b.破壞所述LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用，同時(shí)有效維持所述LTC環(huán)境的pH。
34.使權(quán)利要求1的PSS再生的方法，其包括選自以下步驟的至少一個(gè)步驟(i)使所述PSS再生；(ii)使其緩沖能力再生；以及(iii)使其質(zhì)子傳導(dǎo)性再生。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了不溶性質(zhì)子庫(kù)或質(zhì)子源(proton sink or source，PSS)，其可用于通過(guò)接觸來(lái)殺死活的靶細(xì)胞(living target cell，LTC)或者破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)過(guò)程和/或細(xì)胞間相互作用。所述PSS包含(i)提供緩沖能力的質(zhì)子源或質(zhì)子庫(kù)；以及(ii)提供質(zhì)子傳導(dǎo)性和/或電勢(shì)的裝置。所述PSS有效地破壞LTC限定體積內(nèi)的pH穩(wěn)態(tài)和/或電平衡和/或破壞LTC的關(guān)鍵性細(xì)胞間相互作用同時(shí)有效維持LTC環(huán)境的pH。本發(fā)明還提供了包含所述PSS的產(chǎn)品，并提供了用于殺死LTC的有效方法。
文檔編號(hào)A01P1/00GK101784195SQ200880018623
公開(kāi)日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月3日
發(fā)明者什穆埃爾·比克什潘, 格萊布·齊爾伯施泰因 申請(qǐng)人:奧普龍私人有限公司