專(zhuān)利名稱(chēng)：：通過(guò)早期單個(gè)分離針葉樹(shù)體細(xì)胞胚增加萌發(fā)勢(shì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過(guò)早期單個(gè)分離針葉樹(shù)體細(xì)胞胚增加萌發(fā)頻率和萌發(fā)勢(shì)的方法。
背景技術(shù)：
：對(duì)于制造木制品的針葉樹(shù)例如松樹(shù)和樅樹(shù)的需求持續(xù)增加。對(duì)于提供足夠的針葉樹(shù)供應(yīng)的難題，提出的一種解決方法是鑒定具有所需特性、例如生長(zhǎng)快速的個(gè)體針葉樹(shù)，并通過(guò)體細(xì)胞克隆生產(chǎn)大量的、遺傳學(xué)同一的優(yōu)良樹(shù)種的無(wú)性繁殖系。體細(xì)胞克隆是從樹(shù)的體細(xì)胞組織產(chǎn)生遺傳學(xué)同一的樹(shù)的過(guò)程。樹(shù)的體細(xì)胞組織是雄性和雌性配子之外的樹(shù)組織。在體細(xì)胞克隆的一種方法中，將樹(shù)的體細(xì)胞組織培養(yǎng)在起始培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有激素、例如生長(zhǎng)素和/或細(xì)胞分裂素，以啟動(dòng)能夠發(fā)育成體細(xì)胞胚的胚胎發(fā)生細(xì)胞的形成。然后將胚胎發(fā)生細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)在促進(jìn)胚胎發(fā)生細(xì)胞增殖，形成子葉前胚(即不具有子葉的胚)的維持培養(yǎng)基中。然后將增殖的胚胎發(fā)生細(xì)胞培養(yǎng)在促進(jìn)子葉體細(xì)胞胚的發(fā)育和成熟的發(fā)育培養(yǎng)基中，子葉體細(xì)胞胚可以例如放置在人工種子中并播種在土壤中，在那里萌發(fā)產(chǎn)生針葉樹(shù)苗。樹(shù)苗可以移植到生長(zhǎng)位點(diǎn)進(jìn)行隨后的生長(zhǎng)，并最終收獲，以產(chǎn)生木材或木材衍生產(chǎn)品。或者，子葉體細(xì)胞胚也可以在萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)，然后轉(zhuǎn)移到土壤中進(jìn)一步生長(zhǎng)。針葉樹(shù)胚的體細(xì)胞克隆中一直存在的問(wèn)題，是刺激有效并且節(jié)約成本地形成能夠萌發(fā)產(chǎn)生植株的體細(xì)胞胚。優(yōu)選情況下，體外形成的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚，與在針葉樹(shù)種子中體內(nèi)形成的針葉樹(shù)合子胚，在物理(physically)和生理上是相似的、或一致的。因此，對(duì)于從針葉樹(shù)胚胎發(fā)生細(xì)胞生產(chǎn)活的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的方法，存在著持續(xù)的需求。
發(fā)明內(nèi)容一方面，提供了用于增加體外生產(chǎn)的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的萌發(fā)勢(shì)的方法。方法包括(a)在第一發(fā)育培養(yǎng)基中進(jìn)行第一段時(shí)間的培育后，從第一胚培養(yǎng)物中單個(gè)分離出多個(gè)單個(gè)的未成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚；以及(b)將多個(gè)單個(gè)分離的未成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚，與第二發(fā)育培養(yǎng)基相接觸，進(jìn)行第二段時(shí)間的培育。另一方面，提供了用于生產(chǎn)成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的方法。方法包括(a)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中或其上培養(yǎng)針葉樹(shù)體細(xì)胞，以產(chǎn)生胚胎發(fā)生細(xì)胞；(b)將步驟(a)中制備的胚胎發(fā)生細(xì)胞培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中或其上，使胚胎發(fā)生細(xì)胞增殖并形成針葉樹(shù)子葉前體細(xì)胞胚；(c)將步驟(b)中形成的針葉樹(shù)子葉前體細(xì)胞胚培養(yǎng)在第一發(fā)育培養(yǎng)基中或其上，進(jìn)行第一段時(shí)間的培育；(d)單個(gè)分離在步驟(c)中培育的多個(gè)針葉樹(shù)體細(xì)胞胚；以及(e)將多個(gè)分離的單個(gè)針葉樹(shù)體細(xì)胞胚培育在第二發(fā)育培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二段時(shí)間的培育。本發(fā)明的方法可用于制備具有增加的萌發(fā)頻率和萌發(fā)勢(shì)的成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚，它們可以通過(guò)例如遺傳或生物化學(xué)手段進(jìn)行表征，和/或如果需要的話，它們可以萌發(fā)以產(chǎn)生針葉樹(shù)。因此，例如，本發(fā)明的方法可用于更有效地生產(chǎn)具有一種或多種所需特征、例如快的生長(zhǎng)速度或改進(jìn)的木材質(zhì)量的個(gè)體針葉樹(shù)的無(wú)性繁殖系。當(dāng)通過(guò)參考下面的詳細(xì)描述并結(jié)合隨附的圖，對(duì)本發(fā)明有了更好的理解時(shí)，本發(fā)明的上述方面以及許多附隨優(yōu)點(diǎn)將變得更容易理解，在這些圖中圖l是針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的早期和晚期發(fā)育階段的圖解；圖2用圖形描述了一系列5個(gè)實(shí)驗(yàn)的萌發(fā)結(jié)果，其中在發(fā)育過(guò)程中，用手將胚轉(zhuǎn)移(單個(gè)分離)到新鮮或修改過(guò)的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼續(xù)發(fā)育，如實(shí)施例2中所述；圖3用圖形描述了在表5描述的處理?xiàng)l件下，在12周的發(fā)育結(jié)束時(shí)，三種基因型A、B和C中的每種的每個(gè)胚的干重的變化，如實(shí)施例3中所述；圖4用圖形描述了在表5描述的處理?xiàng)l件下，在12周的發(fā)育結(jié)束時(shí)，三種基因型A、B和C中的每種的每個(gè)胚的胚水分含量，如實(shí)施例3中所述；圖5用圖形描述了使用表5描述的發(fā)育處理?xiàng)l件產(chǎn)生的胚的萌發(fā)百分率，這是根據(jù)進(jìn)行每種處理的所有三種基因型(A、B和C)的合并的數(shù)據(jù)，如實(shí)施例3中所述；圖6用圖形描述了通過(guò)表5描述的處理，基因型A的類(lèi)別1、2和3萌發(fā)物和雙極萌發(fā)物的萌發(fā)百分率，如實(shí)施例3所述；圖7用圖形描述了通過(guò)表5中描述的處理，基因型A的類(lèi)別1的萌發(fā)物的萌發(fā)物根長(zhǎng)度、下胚軸長(zhǎng)度、子葉長(zhǎng)度、上胚軸長(zhǎng)度和上胚軸莖長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)，如實(shí)施例3中所述；圖8用圖形描述了通過(guò)表5中描述的處理，基因型B的類(lèi)別1、2和3萌發(fā)物和雙極萌發(fā)物的萌發(fā)百分率，如實(shí)施例3中所述；圖9用圖形描述了通過(guò)表5中描述的處理，基因型B的類(lèi)別1的萌發(fā)物的萌發(fā)物根長(zhǎng)度、下胚軸長(zhǎng)度、子葉長(zhǎng)度、上胚軸長(zhǎng)度和上胚軸莖長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)，如實(shí)施例3中所述；圖10用圖形描述了通過(guò)表5中描述的處理，基因型C的類(lèi)別1、2和3萌發(fā)物和雙極萌發(fā)物的萌發(fā)百分率，如實(shí)施例3中所述；以及圖11用圖形描述了通過(guò)表5中描述的處理，基因型C的類(lèi)別1的萌發(fā)物的萌發(fā)物根長(zhǎng)度、下胚軸長(zhǎng)度、子葉長(zhǎng)度、上胚軸長(zhǎng)度和上胚軸莖長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)，如實(shí)施例3中所述。7優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述除非在本文中專(zhuān)門(mén)定義，所有本文中使用的術(shù)語(yǔ)都與本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專(zhuān)業(yè)人員所理解的具有同樣的含義。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"發(fā)育階段"是指體細(xì)胞克隆過(guò)程中的時(shí)期，在此過(guò)程中，未成熟的胚中發(fā)生了組織發(fā)生和組織和器官的生長(zhǎng)，達(dá)到了能夠萌發(fā)成植株的全尺寸的成熟胚。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"未成熟胚"是指還不能萌發(fā)成植株的胚，包括處于早期發(fā)育階段的胚(即子葉前胚)和中期發(fā)育階段的胚(即具有子葉或下胚軸但還沒(méi)有發(fā)育完全的胚)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"解剖學(xué)成熟"是指具有已發(fā)生的子葉和下胚軸的胚。本文使用的術(shù)語(yǔ)"子葉胚"是指具有明確的、細(xì)長(zhǎng)的、帶有潛伏(latent)分生組織中心的雙極結(jié)構(gòu)的胚，在一端具有一個(gè)或多個(gè)清晰可見(jiàn)的子葉原基，在相反一端具有潛伏的胚根。本文使用的術(shù)語(yǔ)"子葉前胚"是指尚未具有子葉的胚。本文使用的術(shù)語(yǔ)"正常萌發(fā)物"是指在評(píng)估時(shí)存在植物的所有預(yù)期部分。植物的預(yù)期部分可以包括胚根、下胚軸、一個(gè)或多個(gè)子葉、以及上胚軸。在裸子植物的情況下，正常萌發(fā)物的特征為胚根具有超過(guò)3mm的長(zhǎng)度，并且與從自然(natural)種子萌發(fā)的胚的外觀相比沒(méi)有目測(cè)可察覺(jué)的畸形。本文使用的術(shù)語(yǔ)"胚根"是指植物胚的發(fā)育成產(chǎn)生的植株的初生根的部分。本文使用的術(shù)語(yǔ)"下胚軸"是指植物胚或苗的位于子葉下方但位于胚根上方的部分。本文使用的術(shù)語(yǔ)"上胚軸"是指苗莖位于子葉上方的部分。本文使用術(shù)語(yǔ)"胚性胚柄團(tuán)"或"ESM"是指放置在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基表面上，并留下來(lái)生長(zhǎng)最多三個(gè)月時(shí)間的細(xì)胞團(tuán)，其中營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或者包含在半固體凝膠中，或者作為液體包含在能夠提供物理支持的多孔基質(zhì)中。在三個(gè)月的培育期間，體細(xì)胞胚從顯微鏡下可見(jiàn)的前體細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)成可見(jiàn)的早期胚，并最終生長(zhǎng)為解剖學(xué)上成熟的胚。在培育幾周后，ESM的結(jié)構(gòu)典型地由帶有幾個(gè)與培養(yǎng)基直接接觸位于其上的胚的增殖墊狀物組成，但是大部分胚形成在仍然增殖的細(xì)胞團(tuán)的頂部或側(cè)面上。除非指明，所有表示成百分率的濃度值是單位體積的重量百分率。按照本發(fā)明的方法，意外地發(fā)現(xiàn)了在體細(xì)胞胚生產(chǎn)的中期發(fā)育階段單個(gè)分離未成熟的胚(也被稱(chēng)為早期單個(gè)分離)，然后將單個(gè)分離的胚在發(fā)育培養(yǎng)基上培育一段附加的時(shí)間，產(chǎn)生了與完成發(fā)育階段后單個(gè)分離的胚(成熟胚)相比，以增加的萌發(fā)頻率和/或萌發(fā)勢(shì)萌發(fā)的胚，正如在實(shí)施例2和實(shí)施例3中更詳細(xì)描述并在圖2-11中顯示的。按照前面的描述，一方面，提供了用于增加在體外生產(chǎn)的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的萌發(fā)勢(shì)的方法。方法包括(a)在第一發(fā)育培養(yǎng)基中進(jìn)行第一段時(shí)間的培育后，從第一胚培養(yǎng)物中分離出多個(gè)單個(gè)的未成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚，以及(b)將多個(gè)分離的未成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚，與第二發(fā)育培養(yǎng)基相接觸，進(jìn)行第二段時(shí)間的培育。本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)來(lái)自任何針葉樹(shù)的子葉體細(xì)胞胚，例如9松屬的成員，例如火炬松(Pinustaeda)和輻射松(Radiatapine)。同樣地，例如綠縱(Douglasfir)胚也可以通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)。按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的成熟針葉樹(shù)體細(xì)胞胚群，與按照不包括在發(fā)育過(guò)程中單個(gè)分離未成熟胚、但其它方面都一致的對(duì)照方法生產(chǎn)的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚群相比，具有較高的萌發(fā)成針葉樹(shù)植株的效率。根據(jù)本發(fā)明的方法，在單個(gè)分離之前，將未成熟胚的第一培養(yǎng)物在第一發(fā)育培養(yǎng)基中，進(jìn)行第一段時(shí)間的培育。如圖1中所示，體細(xì)胞胚的發(fā)育階段可以分成包括組織發(fā)生(即從未分化的細(xì)胞形成不同組織)的早期階段，包括器官生長(zhǎng)和下胚軸發(fā)育和子葉發(fā)育的開(kāi)始的中期階段，以及包括器官生長(zhǎng)的完成、下胚軸和子葉發(fā)育的完成(即解剖學(xué)成熟)和儲(chǔ)存產(chǎn)物沉積的晚期階段。具體來(lái)說(shuō)，未成熟胚的早期發(fā)育包括根的初始發(fā)育、根冠發(fā)育的開(kāi)始、中柱原分生組織的分化、以及苗端形成。中期發(fā)育包括下胚軸發(fā)育和子葉發(fā)育的起始，晚期發(fā)育包括下胚軸發(fā)育和子葉發(fā)育的完成，產(chǎn)生了解剖學(xué)上成熟的胚。根據(jù)本發(fā)明的方法，未成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚、例如子葉前針葉樹(shù)體細(xì)胞胚，可以從針葉樹(shù)體細(xì)胞、例如從針葉樹(shù)胚獲得的細(xì)胞制備。例如，來(lái)自針葉樹(shù)胚的細(xì)胞可以用激素誘導(dǎo)，形成胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)(ESMs)，它們可以按照本發(fā)明進(jìn)行處理，產(chǎn)生成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚。ESMs可以從例如從種子中取出的子葉前胚制備。例如，將種子表面消毒，取出子葉前胚，然后將其培養(yǎng)在允許形成ESMs的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上或其中，該ESMs包括在出芽或分裂繁殖過(guò)程中的早期胚。典型情況下，將ESMs培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中，形成子葉前體細(xì)胞胚。ESM培養(yǎng)條件以及適合的誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)基的非限制性實(shí)例在下面進(jìn)一步描述。在本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在單個(gè)分離前，將包含未成熟胚、例如含有多個(gè)子葉前體細(xì)胞胚的ESM的第一培養(yǎng)物，在第一促10進(jìn)子葉胚發(fā)育的發(fā)育培養(yǎng)基中或其上，進(jìn)行第一段時(shí)間的培養(yǎng)。在某些實(shí)施方案中，第一段培育時(shí)間的長(zhǎng)度，足以在第一胚培養(yǎng)物中，在多個(gè)胚的一部分(例如至少一個(gè)胚，至少10%的胚，至少25%、至少50%、超過(guò)50%或至少75%的胚)上形成至少一種下列結(jié)構(gòu)一個(gè)或多個(gè)具有子葉原基的胚；一個(gè)或多個(gè)具有子葉的胚；一個(gè)或多個(gè)具有4+子葉的胚；或一個(gè)或多個(gè)具有帶有出現(xiàn)的下胚軸和根區(qū)的不同子葉的胚。在一個(gè)或多個(gè)胚上一種或多種結(jié)構(gòu)(例如子葉原基或子葉)的形成，可以通過(guò)對(duì)培養(yǎng)的胚進(jìn)行目測(cè)檢測(cè)或成像分析來(lái)確定。目測(cè)檢測(cè)或成像分析可以任選地在5-10X的放大倍數(shù)下進(jìn)行。第一段培育時(shí)間可以根據(jù)基因型的不同而不同。在某些實(shí)施方案中，第一段培育期的長(zhǎng)度從至少6周到至少8周，例如從7到8周。在第一發(fā)育培養(yǎng)基上的第一次培育可以在l(TC到3(TC，例如從15°〇到25°C，或例如從2(TC到23'C的溫度下進(jìn)行。用于具體基因型的第一段培育時(shí)間，可以使用實(shí)施例3中描述的方法來(lái)確定。在第一段培育時(shí)間結(jié)束時(shí)，例如，當(dāng)在一部分胚上觀察到存在一個(gè)或多個(gè)子葉原基時(shí)，或經(jīng)過(guò)至少6周的時(shí)間后，方法包括了從第一胚培養(yǎng)物中單個(gè)分離多個(gè)的單個(gè)胚。按照本發(fā)明的方法，可以使用任何從第一胚培養(yǎng)物中物理分離單個(gè)胚的手段，來(lái)單個(gè)分離胚。例如，在胚性胚柄團(tuán)(ESM)培養(yǎng)物的情況下，可以使用物理分離方法，例如洗去ESM(例如通過(guò)水性液體的壓力控制的噴射進(jìn)行噴射單個(gè)分離)、真空吸去ESM、振動(dòng)、或從ESM中挑出胚。其它可用的單個(gè)分離方法的非限制性的例子包括根據(jù)物理屬性例如尺寸、形狀，通過(guò)例如篩網(wǎng)過(guò)濾或分揀胚，或根據(jù)其它的物理屬性例如表面粗糙度、疏水性、密度或質(zhì)量過(guò)濾或分揀胚。在某些實(shí)施方案中，單個(gè)分離步驟還包括根據(jù)一種或多種選擇標(biāo)準(zhǔn)挑取單個(gè)胚。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員或計(jì)算機(jī)化的成像系統(tǒng)可以使用目測(cè)評(píng)估篩選標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)一種或多種形態(tài)特征來(lái)選擇胚，這些特征包括但不限于胚的尺寸、形狀(例如軸對(duì)稱(chēng))、表面質(zhì)地、顏色(例如沒(méi)有可見(jiàn)的發(fā)綠)、不存在裂開(kāi)的下胚軸，以及沒(méi)有半透明的子葉。也可以根據(jù)與化學(xué)或外部結(jié)構(gòu)吸附、反射率、透射率或通過(guò)使用近紅外光譜術(shù)(NIR)的發(fā)射光譜相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)選擇胚，例如在題為"用于體細(xì)胞胚的分類(lèi)方法(MethodsforClassificationofSomaticEmbryos)"的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2004/0072143中描述的，該專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖艘秊閰⒖?。理想的胚，可以使用任何適合的儀器例如鑷子，從第一胚培養(yǎng)物(例如胚性胚柄團(tuán))中單個(gè)地挑出(通過(guò)手動(dòng)或自動(dòng)的過(guò)程)。胚的挑取可以手動(dòng)進(jìn)行，或通過(guò)自動(dòng)化的過(guò)程進(jìn)行，例如在題為"用于植物胚的收獲和多階段篩選的自動(dòng)系統(tǒng)和方法(AutomatedSystemandMethodforHarvestingandMultistageScreeningofPlantEmbryos)"的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2004/0267457中描述的，該專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖艘秊閰⒖?。在方法的某些?shí)施方案中，將挑出的胚直接放置在第二發(fā)育培養(yǎng)基表面上，或放置在與第二發(fā)育培養(yǎng)基接觸的多孔基質(zhì)上，第二發(fā)育培養(yǎng)基可以是固體或液體形式的?？捎糜诒景l(fā)明方法的各種不同實(shí)施方案的多孔基質(zhì)，典型情況下孔徑在大約5微米到大約1200微米的范圍內(nèi)，例如從大約50到500微米，例如從大約70到大約150微米，例如大約100微米。多孔基質(zhì)典型為平面的，可以是任何所需的形狀或所選的維度，使其易于操作并適合于與第二發(fā)育培養(yǎng)基相接觸。示例的多孔材料包括可消毒的和有足夠強(qiáng)抗當(dāng)將材料抬起，以便將單個(gè)分離的胚轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞胚生產(chǎn)過(guò)程的隨后階段、例如層化時(shí)發(fā)生的撕裂?？捎玫亩嗫撞牧系睦影ǖ幌抻谀ぁ⒛猃埨w維、編織的篩網(wǎng)(例如尼龍、不銹鋼或塑料)、以及聚合物纖維。在某些實(shí)施方案中，單個(gè)分離的胚被轉(zhuǎn)移到第二發(fā)育培養(yǎng)基中，或與第二發(fā)育培養(yǎng)基接觸的多孔基質(zhì)中，采用的方式使得單個(gè)分離的胚彼此不物理接觸。正如在實(shí)施例2和實(shí)施例3中描述的，己經(jīng)顯示了與胚性胚柄團(tuán)中的其它胚一起發(fā)育的胚，經(jīng)歷了對(duì)全胚發(fā)育具有抑制性的微環(huán)境。在某些實(shí)施方案中，將單個(gè)分離的胚與以前接觸過(guò)細(xì)胞的(用過(guò)的)第二發(fā)育培養(yǎng)基相接觸。在某些實(shí)施方案中，將單個(gè)分離的胚與第二發(fā)育培養(yǎng)基相接觸，第二發(fā)育培養(yǎng)基是以前接觸過(guò)細(xì)胞的第一發(fā)育培養(yǎng)基，例如在第一次培育期間使用的接觸過(guò)細(xì)胞的發(fā)育培養(yǎng)基。例如，在胚性胚柄團(tuán)培養(yǎng)物在第一發(fā)育培養(yǎng)基上培育的情況下，在第一段培育時(shí)間后，可以通過(guò)噴射單個(gè)分離方法將多個(gè)未成熟單個(gè)胚單個(gè)分離，導(dǎo)致將單個(gè)單個(gè)分離的胚轉(zhuǎn)移到以前接觸過(guò)細(xì)胞的第一發(fā)育培養(yǎng)基的表面上。按照本發(fā)明的方法，在單個(gè)分離后，將單個(gè)分離的未成熟胚與第二發(fā)育培養(yǎng)基接觸第二段培育時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，第二段培育時(shí)間的長(zhǎng)度足以使多個(gè)被單個(gè)分離的胚的至少一部分(例如至少一個(gè)胚，至少10%的胚，至少25%、至少50%、超過(guò)50%或至少75%的胚)達(dá)到解剖學(xué)成熟(即具有發(fā)育的子葉和下胚軸)。第二段培育時(shí)間可以根據(jù)基因型的不同而不同。在某些實(shí)施方案中，第二段培育期的長(zhǎng)度為至少3周，例如從3到5周。在某些實(shí)施方案中，胚在發(fā)育培養(yǎng)基上培育的總時(shí)間長(zhǎng)度(包括第一段培育時(shí)間和第二段培育時(shí)間)為至少12周。在第二發(fā)育培養(yǎng)基上的第二次培育可以在1(TC到3(TC，例如從15'C到25°C，或例如從2(TC到23°C的溫度下進(jìn)行。用于具體基因型的第二段培育時(shí)間，可以使用實(shí)施例3中描述的方法來(lái)確定。第一和第二發(fā)育培養(yǎng)基典型地含有支持體細(xì)胞胚的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。適合的發(fā)育培養(yǎng)基典型情況下不包含生長(zhǎng)促進(jìn)激素，例如生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。在某些實(shí)施方案中，第一和第二發(fā)育培養(yǎng)基具有同樣的配方。在某些實(shí)施方案中，第一和第二發(fā)育培養(yǎng)基具有不同的配方。第一和/或第二發(fā)育培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度可以被調(diào)整到位于所需范圍內(nèi)的值，例如大約250mM/Kg到大約450mM/Kg。典型情況下，在本發(fā)明的方法中，350mM或更高的重量克分子滲透濃度是有利的。適合的發(fā)育培養(yǎng)基的例子BM3顯示在本文的實(shí)施例1中。適合的發(fā)育培養(yǎng)基的另一個(gè)例子devB顯示在本文的實(shí)施例3中。在方法的某些實(shí)施方案中，第二發(fā)育培養(yǎng)基具有的重量克分子滲透濃度(例如從350mM/Kg到450mM/Kg)高于第一發(fā)育培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度(例如從300mM/Kg到400mM/Kg)。在某些實(shí)施方案中，選擇第二發(fā)育培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度以匹配第一段培育時(shí)間結(jié)束時(shí)第一發(fā)育培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度。在某些實(shí)施方案中，第一和/或第二發(fā)育培養(yǎng)基含有濃度為1%到15y。的PEG。在某些實(shí)施方案中，第一發(fā)育培養(yǎng)基含有濃度為7%到10%(例如7%、8%、9°/。、10%)的PEG。在某些實(shí)施方案中，第二發(fā)育培養(yǎng)基含有濃度為8%到15%(例如8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%)的PEG。在某些實(shí)施方案中，第二發(fā)育培養(yǎng)基含有比第一發(fā)育培養(yǎng)基更高濃度的PEG。麥芽糖可以包含在第一和/或第二發(fā)育培養(yǎng)基中，作為體細(xì)胞胚的主要或唯一糖源。可用的麥芽糖濃度在大約1%到大約2.5%的范圍內(nèi)。第一和/或第二發(fā)育培養(yǎng)基可以含有結(jié)冷膠。結(jié)冷膠是以例如名稱(chēng)GELRITE和PHYTAGEL銷(xiāo)售的膠凝劑。如果在發(fā)育培養(yǎng)基中包含結(jié)冷膠，其存在的濃度典型為低于大約0.5%，典型情況下濃度為大約0%到大約0.4%。第一和第二發(fā)育培養(yǎng)基典型為固體培養(yǎng)基，盡管一種或兩種也可以是液體培養(yǎng)基。第一和/或第二發(fā)育培養(yǎng)基可以包含用于誘導(dǎo)培養(yǎng)基的吸附劑成分，例如本文描述的活性炭。示例的成熟培養(yǎng)基在實(shí)施例3中顯示為devB。在某些實(shí)施方案中，第一和/或第二發(fā)育培養(yǎng)基還包含蔗糖和/或脫落酸。發(fā)育培養(yǎng)基中脫落酸的濃度可以在0.5mg/L到500mg/L之間。在本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案中，發(fā)育培養(yǎng)基中脫落酸的濃度在1mg/L到100mg/L之間。在某些實(shí)施方案中，發(fā)育培養(yǎng)基中脫落酸的濃度在5mg/L到20mg/L之間。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，第一和/或第二發(fā)育培養(yǎng)基含有蔗糖作為主要的或唯一的可代謝糖源?？捎玫恼崽菨舛仍诖蠹s1%到大約6%的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，在第二發(fā)育培養(yǎng)基中培育后，將單個(gè)分離的胚在層化培養(yǎng)基中或其上，在大約rC到大約l(TC的溫度下培養(yǎng)大約1周到大約6周的時(shí)間。典型情況下，層化培養(yǎng)基與發(fā)育培養(yǎng)基相似或一致，但是不含脫落酸，并具有較低濃度的結(jié)冷膠，典型情況下低于大約0.5%。層化培養(yǎng)基可以含有蔗糖作為主要或唯一可代謝糖源。示例的層化培養(yǎng)基在實(shí)施例1中顯示為BM5。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的方法，包括下列步驟(a)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中或其上培養(yǎng)針葉樹(shù)體細(xì)胞，以產(chǎn)生胚胎發(fā)生細(xì)胞；(b)將步驟(a)中制備的胚胎發(fā)生細(xì)胞培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中或其上，使胚胎發(fā)生細(xì)胞增殖并形成針葉樹(shù)子葉前體細(xì)胞胚；(c)將步驟(b)中形成的針葉樹(shù)子葉前體細(xì)胞胚培養(yǎng)在第一發(fā)育培15養(yǎng)基中或其上，進(jìn)行第一段時(shí)間的培育；(d)單個(gè)分離在步驟(c)中培育的多個(gè)針葉樹(shù)體細(xì)胞胚；以及(e)將多個(gè)單個(gè)分離的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚培育在第二發(fā)育培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二段時(shí)間的培育。因此，在某些實(shí)施方案中，將針葉樹(shù)體細(xì)胞培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中或其上，以產(chǎn)生胚胎發(fā)生細(xì)胞。胚胎發(fā)生細(xì)胞是能夠產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)子葉針葉樹(shù)體細(xì)胞胚、包括例如針葉樹(shù)胚性胚柄團(tuán)的細(xì)胞。誘導(dǎo)培養(yǎng)基典型情況下包含無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度典型為大約160mg/kg或甚至更低，但是也可以高達(dá)170mM/kg。誘導(dǎo)培養(yǎng)基典型情況下包含生長(zhǎng)激素?？梢园谡T導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)激素的例子是生長(zhǎng)素(例如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D))和細(xì)胞分裂素(例如6-苯甲基氨基嘌呤(BAP))。生長(zhǎng)素可以例如1mg/L到200mg/L的濃度使用。細(xì)胞分裂素可以例如0.1mg/L至U10mg/L的濃度使用。誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以包含吸附性成分，特別是當(dāng)使用非常高濃度的生長(zhǎng)激素時(shí)。吸附劑成分可以是任何在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的濃度下對(duì)胚胎發(fā)生細(xì)胞沒(méi)有毒性，并且能夠吸附生長(zhǎng)催進(jìn)激素以及在胚發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的、存在于培養(yǎng)基中的有毒化合物的成分?？捎玫奈叫猿煞值姆窍拗菩缘睦影ɑ钚蕴俊⒖扇苄跃垡蚁┻量┩橥?、不溶性聚乙烯吡咯垸酮、活性氧化鋁以及硅膠。吸附性成分可以例如大約0.1g/L到大約5g/L的量存在。可用于本發(fā)明的實(shí)踐的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的例子是本文實(shí)施例1中提出的BM,培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基典型情況下為固體，可以通過(guò)包含膠凝劑進(jìn)行固化。典型情況下，將針葉樹(shù)體細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中或其上，培養(yǎng)從3周到10周，例如6周到8周的時(shí)間，培養(yǎng)溫度為l(TC到30°C，例如15°C到25°C，或例如20°C到23°C。維持培養(yǎng)基可以是固體培養(yǎng)基，或者它可以是液體培養(yǎng)基，其可16以進(jìn)行攪拌以促進(jìn)胚胎發(fā)生組織的生長(zhǎng)和繁殖。維持培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度典型情況下高于誘導(dǎo)培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度，典型為180-400mM/kg。維持培養(yǎng)基可以含有支持胚胎發(fā)生組織的營(yíng)養(yǎng)物，可以包含催進(jìn)細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)生組織生長(zhǎng)的激素，例如一種或多種生長(zhǎng)素和/或細(xì)胞分裂素。典型情況下，維持培養(yǎng)基中的激素濃度低于它們?cè)谡T導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度。一般來(lái)說(shuō)，希望、但不是必需在維持培養(yǎng)基中包含麥芽糖作為唯一或主要的可代謝糖源?？捎玫柠溠刻菨舛鹊睦邮窃诖蠹s1%到大約2.5%的范圍內(nèi)。適合的維持培養(yǎng)基的例子是在本文實(shí)施例1中顯示的BM2培養(yǎng)基。典型情況下，將針葉樹(shù)胚胎發(fā)生細(xì)胞每周一次轉(zhuǎn)移到新鮮維持培養(yǎng)基中。如上所述，將從針葉樹(shù)胚胎發(fā)生細(xì)胞形成的子葉前針葉樹(shù)體細(xì)胞，在第一發(fā)育培養(yǎng)基中或其上，進(jìn)行第一段時(shí)間的培養(yǎng)，單個(gè)分離，然后在第二發(fā)育培養(yǎng)基上進(jìn)行第二段時(shí)間的培養(yǎng)?？捎玫陌l(fā)育培養(yǎng)基和培育時(shí)間描述同上。在第二發(fā)育培養(yǎng)基中培養(yǎng)以后，可以任選地將子葉體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到層化培養(yǎng)基，進(jìn)行另一段時(shí)間的培養(yǎng)。使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的針葉樹(shù)子葉體細(xì)胞胚，如果需要的話，可以任選地萌發(fā)形成針葉樹(shù)植株，這些植株可以生長(zhǎng)成針葉樹(shù)。也可以將子葉胚放置在人工種子中，用于隨后的萌發(fā)。針葉樹(shù)子葉體細(xì)胞胚可以在例如固體萌發(fā)培養(yǎng)基上、例如在本文的實(shí)施例1中描述的萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)。然后可以將萌發(fā)的植株轉(zhuǎn)移到土壤中用于進(jìn)一步的生長(zhǎng)。例如，可以將萌發(fā)的植株栽培在溫室的土壤中，允許其生長(zhǎng)直到移植到戶外位點(diǎn)。典型情況下，對(duì)針葉樹(shù)子葉體細(xì)胞胚進(jìn)行光照以刺激萌發(fā)。本發(fā)明的方法產(chǎn)生的成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚群，與按照不包括在發(fā)育過(guò)程中單個(gè)分離未成熟胚的步驟、但其它方面都一致的方法生產(chǎn)的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚群相比，具有以較高頻率萌發(fā)的能力(即產(chǎn)生了更高產(chǎn)率的萌發(fā)物)。本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案產(chǎn)生的成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的萌發(fā)效率，與按照不包括在發(fā)育過(guò)程中單個(gè)分離未成熟子葉針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的步驟、但其它方面都一致的方法生產(chǎn)的成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的萌發(fā)效率相比，高至少100%(例如高100%到200%)，正如在下面的實(shí)施例2-3中進(jìn)一步描述的和圖1-11中顯示的。下面的實(shí)施例僅僅說(shuō)明了現(xiàn)在考慮到的實(shí)施本發(fā)明的最佳方案，但是不應(yīng)該被解釋為限制了本發(fā)明。實(shí)施例1本實(shí)施例描述了使用發(fā)育后單個(gè)分離從火炬松生產(chǎn)體細(xì)胞松樹(shù)胚的方法。方法在受精后4到5周，將含有合子胚的雌性配子體從種子中取出。除去種皮，但是除了切除珠心端之外，不將胚從周?chē)呐渥芋w中進(jìn)一步剖出。球果(cone)在使用前儲(chǔ)存在4'C。就在取出未成熟的胚之前，將種子進(jìn)行滅菌，首先清洗，用去污劑處理，然后在15%11202中滅菌IO分鐘。在每次處理后將外植體用無(wú)菌蒸餾水充分清洗。表1和2顯示了用于生產(chǎn)松樹(shù)體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基的示例組成。表1火炬松(PinusTaeda)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BM)成分濃度(mg/L)NH4N03150.0KN03卯9.9KH2P04136.1Ca(N03)2'4H20236.2CaCl2-4H2050.0MgS04'7H20246.5Mg(N03)2'6H20256.5MgCl2'6H2050.0KI4.15H3B0315.5MnS04-H2010.5ZnS04.7H2014.4NaMo04-2H200.125CuS045H200,125CoCl2-6H200.125FeS04-7H2027.86Na2EDTA37.36麥芽糖30,000肌醇200酪蛋白氨基酸500L-谷氨酰胺1000硫胺素鹽酸鹽1.00鹽酸吡眵醇0.50煙酸0.50甘氨酸2.00脫乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)十1600將pH調(diào)整到5.7+如果需要固體培養(yǎng)基時(shí)使用19表2用于不同階段處理的培養(yǎng)基成分BMt—誘導(dǎo)培養(yǎng)基BM+2,4-D(15nM)+激動(dòng)素(2nM)+BAP(2pM)BM2—維持培養(yǎng)基BM+2，4-D(5pM)+激動(dòng)素(0.5pM)+BAP(0.5pM)。當(dāng)需要固體培養(yǎng)基時(shí)加入脫乙酰吉蘭糖膠(1600mg/L)。稀釋培養(yǎng)基BM+10mg/mL脫落酸+100-1000mg/mL附加的肌醇，+2.5%麥芽糖。加入下面的氨基酸混合物L(fēng)-脯氨酸(100mg/L),L-天冬酰胺(100mg/L)，L-精氨酸(50mg/L)，L-丙氨酸(20mg/L)和L-絲氨酸(20mg/L)。優(yōu)選情況下不存在維持激素。BM3—發(fā)育培養(yǎng)基ABM+25mg/L脫落酸+12%PEG-800O+8OOmg/L附加的肌醇+0.1%活性炭+1%葡萄糖+2.5%麥芽糖。加入下面的氨基酸混合物L(fēng)-脯氨酸(100mg/L)，L-天冬酰胺(100mg/L)，L-精氨酸(50mg/L)，L-丙氨酸(20mg/L)和L-絲氨酸(20mg/L)。當(dāng)需要固體培養(yǎng)基時(shí)加入脫乙酰吉蘭糖膠(2500mg/L)。BM5—層化培養(yǎng)基通過(guò)省略脫落酸和PEG-8000而修改的BM3。當(dāng)需要固體培養(yǎng)基時(shí)加入脫乙酰吉蘭糖膠(2500mg/L)。BM6—萌發(fā)培養(yǎng)基通過(guò)用2%蔗糖代替麥芽糖而修改的BM。肌醇被減少到100.0mg/L，谷氨酰胺和酪蛋白氨基酸被減少到0.0mg/L。FeS04'7H20被減少到13.9mg/L，Na2EDTA減少到18.6mg/L。加入瓊脂到0.8°/。，加入活性炭到0.25%。誘導(dǎo)將無(wú)菌的帶有完整胚的配子體放置在固體BMi培養(yǎng)基上，在22。C到25。C的環(huán)境中，以24小時(shí)的暗光周期(darkphotoperiod)保持3到5周。時(shí)間的長(zhǎng)度取決于所培養(yǎng)的具體基因型。在這段時(shí)間結(jié)束時(shí)，形成了白色的粘質(zhì)團(tuán)，與初始的外植體相連。典型情況下，顯微鏡檢査發(fā)現(xiàn)與團(tuán)相連的大量早期胚。它們一般來(lái)說(shuō)特征為具有長(zhǎng)的薄壁的胚柄，連接有具有濃密的細(xì)胞質(zhì)和大的細(xì)胞核的小頭。20誘導(dǎo)培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度在某些情況下可以高達(dá)150mM/kg，典型為大約120mM/kg或甚至更低(例如110mM/kg)。子葉前胚的維持和繁殖將從誘導(dǎo)階段產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)取出的早期胚首先放置在BM2膠化的維持和繁殖培養(yǎng)基上。該培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基的差別在于生長(zhǎng)激素(生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素二者)降低了至少一整個(gè)數(shù)量級(jí)。該培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度為130mM/kg或以上(典型情況下對(duì)于火炬松來(lái)說(shuō)在大約120-150mM/kg的范圍內(nèi))。溫度和光照周期還是22r到25°C，在暗處24小時(shí)。將胚在BM2固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-14天，然后轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基上進(jìn)一步傳代培養(yǎng)。該液體培養(yǎng)基與BM2具有同樣的成分，但是缺少膠凝劑。在固體維持期結(jié)束時(shí)的胚典型情況下與來(lái)自誘導(dǎo)階段的胚在外觀上相似。在液體維持培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)5到6周后，形成了高等的早期胚。它們的特征為光滑的胚頭部，據(jù)估計(jì)典型情況下具有超過(guò)100個(gè)個(gè)體細(xì)胞，具有多個(gè)胚柄。胚的發(fā)育將早期未成熟胚轉(zhuǎn)移到固體發(fā)育培養(yǎng)基上。發(fā)育培養(yǎng)基完全不含生長(zhǎng)激素，或者它們的存在只有非常低的水平。典型情況下包含有脫落酸以促進(jìn)進(jìn)一步發(fā)育。此外，在該培養(yǎng)基中包含吸附劑成分是有利的。吸附劑成分可以選自許多具有高的表面積和/或受控的孔徑的化學(xué)材料，例如活性炭，可溶或不溶形式的聚乙烯吡咯烷酮，活性氧化鋁和硅膠。吸附劑成分通常存在的濃度為大約0.1-5g/L，更常見(jiàn)為大約0.25-2.5g/L。可以包含濃度為大約0.25%的結(jié)冷膠。該發(fā)育培養(yǎng)基的滲透壓可以升高到顯著超過(guò)維持培養(yǎng)基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，重量克分子滲透濃度高達(dá)350mM/kg或甚至更高，是有利的。優(yōu)選情況下，發(fā)育在完全黑暗下在22'C到25t:下進(jìn)行，直到子葉胚已經(jīng)發(fā)育(例如達(dá)到解剖學(xué)成熟)。層化在發(fā)育培養(yǎng)基上7到12周后，單個(gè)分離子葉胚，并轉(zhuǎn)移到層化培養(yǎng)基BM5中。該培養(yǎng)基與發(fā)育培養(yǎng)基相似，但是缺少脫落酸、PEG-8ooo和結(jié)冷膠。將胚在層化培養(yǎng)基上，在大約rc到大約l(TC之間，在暗處培育3到6周。干燥將仍然在其濾紙支持物上的成熟的胚從襯墊上抬起，放置在水上方的封閉的容器中，相對(duì)濕度97%，放置大約3周的時(shí)間。萌發(fā)通過(guò)將仍然在濾紙支持物上的干燥的成熟胚，在用液體萌發(fā)培養(yǎng)基飽和的襯墊上放置大約24小時(shí)，將干燥的成熟胚重新水合。然后將胚單個(gè)地放置在用于萌發(fā)的固體BM6培養(yǎng)基上。這是缺少生長(zhǎng)激素的基本培養(yǎng)基，通過(guò)減少蔗糖、肌醇和有機(jī)氮進(jìn)行了修改。將胚在BM6培養(yǎng)基上，在23'C到25X:以及16小時(shí)光-8小時(shí)暗的光照周期的環(huán)境條件下，培育大約10周，直到產(chǎn)生的小植株具有發(fā)育完好的胚根和下胚軸以及綠色的子葉結(jié)構(gòu)和上胚軸。因?yàn)榻档土颂堑臐舛?，萌發(fā)培養(yǎng)基的滲透壓可能進(jìn)一步低于發(fā)育培養(yǎng)基。正常情況下它要低大約150mM/kg(例如大約100mM/kg)。結(jié)果使用本實(shí)施例中描述的方法，對(duì)于火炬松的三種代表性基因型獲得的典型萌發(fā)頻率如下基因型A:萌發(fā)頻率22%?；蛐虰:萌發(fā)頻率12%?；蛐虲:萌發(fā)頻率62%。實(shí)施例2本實(shí)施例描述了一系列實(shí)驗(yàn)，被設(shè)計(jì)用于測(cè)試未成熟胚的早期單個(gè)分離(在發(fā)育階段)對(duì)萌發(fā)頻率的影響。方法進(jìn)行了如下6種不同的實(shí)驗(yàn)，以測(cè)試早期單個(gè)分離的效果實(shí)驗(yàn)2.1方法將火炬松基因型A的胚性胚柄團(tuán)培養(yǎng)物在固體發(fā)育培養(yǎng)基上培育12周，并對(duì)胚進(jìn)行評(píng)估。在12周時(shí)，將一組小胚(108個(gè)胚)留在同一發(fā)育培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培育2周，將第二組小胚(108個(gè)胚)轉(zhuǎn)移到不含ESM的新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(配方相同)上，繼續(xù)培育2周。在附加的培育時(shí)間結(jié)束時(shí)(總共在發(fā)育培養(yǎng)基上14周)，對(duì)來(lái)自第一和第二組的胚進(jìn)行胚的尺寸和萌發(fā)百分率的評(píng)估。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果概述在表3中。意外地發(fā)現(xiàn)，不被擾動(dòng)地保留在發(fā)育培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培育2周的第一組小胚(108個(gè)胚)，在發(fā)育培養(yǎng)基上從第12周到第14周期尺寸沒(méi)有生長(zhǎng)，它們的萌發(fā)百分率為零。相反，意外地發(fā)現(xiàn)，在12周時(shí)單個(gè)分離(手工挑取)并轉(zhuǎn)移到不含ESM的新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(原來(lái)的配方)上并繼續(xù)培育2周的第二組小胚(108個(gè)胚)，尺寸繼續(xù)生長(zhǎng)，并以與較早收獲的胚(在12周時(shí)收獲的大的或小的胚)匹配的比率萌發(fā)。因此，顯示出將第一組小胚不受擾動(dòng)地留下，并在ESM中繼續(xù)保持2周，抑制了胚的活力和萌發(fā)潛能。實(shí)驗(yàn)2.2。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)施是作為成像實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照，以確定在發(fā)育過(guò)程中從發(fā)育培養(yǎng)基中取出未成熟的基因型A的火炬松胚，并放回到同一發(fā)育培養(yǎng)基上(以前接觸過(guò)細(xì)胞)，是否將改變發(fā)育的過(guò)程。在本實(shí)驗(yàn)中，將生長(zhǎng)在固體發(fā)育培養(yǎng)基上的未成熟胚，在發(fā)育培養(yǎng)基上的第5、6、7、8、9、10和12周時(shí)單個(gè)分離(手工挑取)，并放回到同一(以前接觸過(guò)細(xì)胞的)不含ESM的發(fā)育培養(yǎng)基上。每種處理試驗(yàn)了7塊胚的平板。在發(fā)育培養(yǎng)基上培育總共12周后，將胚層化2周。然后評(píng)估胚的萌發(fā)百分率。23結(jié)果本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果概述在表3中。正如表3中所示，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在實(shí)驗(yàn)2.1(如上所述)中的意外發(fā)現(xiàn)，即在發(fā)育階段單個(gè)分離未成熟胚對(duì)萌發(fā)有顯著的有益效果，最適的萌發(fā)百分率(86%)來(lái)自于在第8周從發(fā)育培養(yǎng)基單個(gè)分離(挑取)并重新放置在同一不含ESM的發(fā)育培養(yǎng)基上的胚。在發(fā)育培養(yǎng)基上培育10或12周時(shí)單個(gè)分離的胚的萌發(fā)百分率僅為48%。正如在上面的實(shí)施例I中描述的，在胚的層化時(shí)，在發(fā)育培養(yǎng)基上12周后的單個(gè)分離是標(biāo)準(zhǔn)的操作。因此，本發(fā)明的方法產(chǎn)生的萌發(fā)百分率是使用標(biāo)準(zhǔn)方法時(shí)常規(guī)獲得的萌發(fā)百分率的大約兩倍。實(shí)驗(yàn)2.3。本實(shí)驗(yàn)使用火炬松胚的三種不同基因型A、B和D進(jìn)行，以觀察在發(fā)育培養(yǎng)基上培育8周后轉(zhuǎn)移到不同的新培養(yǎng)基是否具有有益的效應(yīng)。將基因型A、B和D的每種胚的三個(gè)搖瓶涂布在平板上，每個(gè)搖瓶每種處理各10個(gè)平板。將胚或者在第8周時(shí)挑取并轉(zhuǎn)移到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基上，或者在12周時(shí)全體一起轉(zhuǎn)移(在尼龍支持物上)到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基上。對(duì)于兩種條件來(lái)說(shuō)，將新鮮發(fā)育培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度調(diào)整到與轉(zhuǎn)移出胚的培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度相當(dāng)。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果概述在表3中。正如在表3中所示，基因型A和B的結(jié)果非常明顯地顯示出，在8周時(shí)轉(zhuǎn)移到其重量克分子滲透濃度已經(jīng)調(diào)整到與它所離開(kāi)的舊培養(yǎng)基中相當(dāng)?shù)男迈r發(fā)育培養(yǎng)基，與在12周時(shí)全體一起轉(zhuǎn)移相比，更加有利?；蛐虳產(chǎn)生的"正常"胚對(duì)于決定性測(cè)試來(lái)說(shuō)太少，但是當(dāng)將第2類(lèi)萌發(fā)物包含在分析中時(shí)，似乎早期單個(gè)分離顯示出相反的萌發(fā)趨勢(shì)(p=0.075)，第8周轉(zhuǎn)移不如標(biāo)準(zhǔn)的12周時(shí)收獲。但是，如果將較低的胚產(chǎn)量/ml也考慮在內(nèi)時(shí)，那么這種降低是顯著的，正如通過(guò)萌發(fā)物產(chǎn)量/ml所測(cè)量的。注意到基因型B在8周轉(zhuǎn)移后也顯示出胚產(chǎn)量/ml的明顯降低，但是它的萌發(fā)物產(chǎn)量/ml仍然增加很多。基因型A的每ml胚產(chǎn)量不受影響。24在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，也確定了使用與上述相同的培養(yǎng)基進(jìn)行全體一起轉(zhuǎn)移(不單個(gè)分離)，不影響萌發(fā)百分率(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)驗(yàn)2.4。使用了更多的火炬松基因型(基因型A、C和D)以及固體或液體發(fā)育培養(yǎng)基，重復(fù)了上述實(shí)驗(yàn)2.2?；蛐虯使用每種處理9塊平板進(jìn)行試驗(yàn)。基因型C使用每種處理26塊平板進(jìn)行試驗(yàn)?；蛐虳使用每種處理9塊平板進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果概述在表3中。對(duì)于基因型A來(lái)說(shuō)，確定了在第8周時(shí)轉(zhuǎn)移時(shí)最適的，對(duì)照胚(在12周時(shí)收獲)的萌發(fā)僅僅為第8周轉(zhuǎn)移的胚的萌發(fā)的大約一半。還觀察到了在第8周轉(zhuǎn)移后基因型B和D的低的萌發(fā)率。實(shí)驗(yàn)2.5。進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)，對(duì)火炬松基因型A和C在8周和12周時(shí)的單個(gè)分離進(jìn)行了比較，使用噴射分離法進(jìn)行單個(gè)分離(而不是手工挑取)，然后在各種不同培養(yǎng)基條件下培育，包括重新放置在使用過(guò)的培養(yǎng)基(以前接觸過(guò)細(xì)胞的)或含有新鮮滲透壓調(diào)節(jié)劑的新鮮培養(yǎng)基上。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在表3中。由于低的萌發(fā)百分率，結(jié)果是統(tǒng)計(jì)學(xué)不顯著的，因此是無(wú)結(jié)論的。低的萌發(fā)率可能是由于噴射分離方法包含了突然的滲透壓變化以及其它與手工轉(zhuǎn)移的差別。但是，觀察到了轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上的胚，與放置在使用過(guò)的培養(yǎng)基上的胚相比，萌發(fā)物的根長(zhǎng)了60%(p=0.003)。噴射分離方法可以進(jìn)行修改，使用等滲溶液代替水，以避免與將胚暴露于突然的滲透壓變化有關(guān)的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)2.6。進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)以比較在第7周和第9周時(shí)單個(gè)分離胚(手工挑取)并轉(zhuǎn)移到新鮮固體培養(yǎng)基上對(duì)萌發(fā)頻率的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)單個(gè)分離后的發(fā)育培養(yǎng)基沒(méi)有進(jìn)行滲透壓調(diào)整，以匹配單個(gè)分離前的發(fā)育培養(yǎng)基。胚的轉(zhuǎn)移從同樣的平板上連續(xù)進(jìn)行，允許進(jìn)行精確的分板比較。12周的對(duì)照包含沒(méi)有從中取出胚的平板。還包括了其它的對(duì)照，其中胚在第7或第9周時(shí)從發(fā)育培養(yǎng)基上直接轉(zhuǎn)移到層化培養(yǎng)基上，然后用水調(diào)制并萌發(fā)(如實(shí)施例l中描述)。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在表3中。觀察到了在第7周單個(gè)分離后的萌發(fā)百分率為72%,與此相比，第9周時(shí)單個(gè)分離的萌發(fā)百分率是43%，沒(méi)有單個(gè)分離的12周對(duì)照的萌發(fā)百分率是12°/。。觀察到的差異是巨大和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。此外，第7周單個(gè)分離的胚在發(fā)育結(jié)束時(shí)的胚的干重，是對(duì)照萌發(fā)物的干重(沒(méi)有低于最小水分含量要求以下)的3倍，與對(duì)照萌發(fā)物相比根的長(zhǎng)度長(zhǎng)54%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總體概述所有5個(gè)使用胚的人工單個(gè)分離(手工挑取)的實(shí)驗(yàn)，當(dāng)胚在發(fā)育階段過(guò)程中被單個(gè)分離，并轉(zhuǎn)移到發(fā)育培養(yǎng)基(以前接觸過(guò)細(xì)胞的培養(yǎng)基或新鮮培養(yǎng)基)中繼續(xù)發(fā)育時(shí)，都顯示出了對(duì)胚質(zhì)量的一種或多種度量的顯著效應(yīng)(例如，較高的萌發(fā)百分率、較高的每ml萌發(fā)物產(chǎn)率、萌發(fā)物的根的較快的生長(zhǎng)以及較大的胚干重方面的顯著改進(jìn))。這些試驗(yàn)的結(jié)果概述在表3和圖2中。圖2用圖形描述了5個(gè)實(shí)驗(yàn)(2.1，2.2，2.3，2.4和2.6)的萌發(fā)結(jié)果，其中胚在發(fā)育過(guò)程中通過(guò)手工進(jìn)行轉(zhuǎn)移，并且使用了在圖例中指示的每種基因型("G")(基因型A、B、D或E)。如圖2所示，最適合于單個(gè)分離的周似乎是在第7周到第10周之間，并觀察到了某些基因型的具體的變化。具體來(lái)說(shuō)，注意到基因型A在所有5個(gè)實(shí)驗(yàn)中顯示出了大的改進(jìn)?；蛐虰在測(cè)試了它的實(shí)驗(yàn)中顯示出大的改進(jìn)?；蛐虳在測(cè)試了它的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中顯示出降低，但是對(duì)照產(chǎn)生了非常低的萌發(fā)百分率?；蛐虴在測(cè)試了它的一個(gè)實(shí)驗(yàn)中顯示出中度的降低?；蛐虲只在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試，由于噴射單個(gè)分離引入的混淆效應(yīng)，沒(méi)有獲得26結(jié)論性結(jié)果。這一系列實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，與ESM—起或在其上發(fā)育的胚，經(jīng)歷了對(duì)整個(gè)胚發(fā)育具有抑制性的微環(huán)境，在發(fā)育過(guò)程中的單個(gè)分離增加了被單個(gè)分離的胚的萌發(fā)勢(shì)。盡管不希望受到理論的束縛，但也有可能胚的胚柄叢本身分泌了其它抑制胚的發(fā)育的化合物。也有可能ESM中的胚是間接獲取營(yíng)養(yǎng)的，并與其它組織競(jìng)爭(zhēng)，使得與直接接觸培養(yǎng)基的胚相比，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)速度和培養(yǎng)基成分的化學(xué)組分減少了。表3:實(shí)驗(yàn)2.1到2.6的結(jié)果的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例3本實(shí)施例證實(shí)了當(dāng)在胚發(fā)育期間單個(gè)分離未成熟胚時(shí)觀察到的萌發(fā)頻率的急劇增加，以及在具有各種不同的脫乙酰吉蘭糖膠/PEG濃度的發(fā)育培養(yǎng)基上培育分離后胚的效果?；驹?實(shí)驗(yàn)的設(shè)置是為了檢查在發(fā)育后總體一起移動(dòng)或在發(fā)育中期單個(gè)挑取(單個(gè)分離)到新鮮培養(yǎng)基上的胚的萌發(fā)百分率的效應(yīng)。方法子葉前胚的誘導(dǎo)和維持來(lái)自三種不同基因型(火炬松的A、B和C)的體細(xì)胞胚按照實(shí)施例1中的描述進(jìn)行誘導(dǎo)，并維持在維持培養(yǎng)基M2中(表2的BM培養(yǎng)基+1.1mg/L2,4D;0.1mg/mL6-BAP，0.1mg/mL激動(dòng)素，以及1mg/mLABA)。單個(gè)分離前胚的發(fā)育將來(lái)自每種基因型(A、B和C)的子葉前胚鋪在1/2尺寸(3.91升)的食品制備物盒(CambroCompany)之上，盒中含有600ml下面的表4中描述的半固體發(fā)育培養(yǎng)基B(devB)。在每個(gè)盒中加入24個(gè)單獨(dú)的IOO微米尼龍方形篩網(wǎng)(1.5xl.5英寸)，允許在發(fā)育的第7-8周時(shí)可以不擾動(dòng)地移除整個(gè)培養(yǎng)物。使在l升搖瓶中、在維持培養(yǎng)基M2中生長(zhǎng)的每種基因型(A、B和C)的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚細(xì)胞沉降。通過(guò)在搖瓶上畫(huà)一道線來(lái)測(cè)量沉降的細(xì)胞體積(SCV)，通過(guò)使用多孔玻璃管吸取，抽出沉降細(xì)胞上方的上清液。然后將沉降細(xì)胞重新懸浮在洗滌培養(yǎng)基中，使其再次沉降，將一滴0.5mlSCV加到每個(gè)方形篩網(wǎng)上。每種基因型鋪4個(gè)1/2金寶(cambro)盒，每個(gè)盒上鋪有12mlsSCV。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>發(fā)育中期評(píng)估和單個(gè)分離在發(fā)育7或8周后，根據(jù)基因型，將鋪板的胚或者單個(gè)分離(從ESM細(xì)胞團(tuán)中分別移出)到不同的devB培養(yǎng)基的修改過(guò)的培養(yǎng)基中，或者將整個(gè)培養(yǎng)物方塊(尼龍篩網(wǎng))整體移動(dòng)到新鮮的或以前使用過(guò)的(接觸過(guò)細(xì)胞的)devB培養(yǎng)基上，或者不觸動(dòng)培養(yǎng)物(對(duì)照)。將每種基因型(A、B和C)按照下面表5中列出的處理?xiàng)l件進(jìn)行處理，每種處理8個(gè)平行樣。表5:發(fā)育中期單個(gè)分離處理?xiàng)l件處理編號(hào)目測(cè)成熟的子葉胚的處理單個(gè)分離后培養(yǎng)基條件脫乙酰吉蘭糖膠濃度(g/L)%PEG1胚保持在原始的金寶(cambro)盒中(未碰過(guò)的、未單個(gè)分離的對(duì)照)胚維持在原始發(fā)育培養(yǎng)基(devB)中2.5g/L(devB)10%10g/L(devB)2將胚單個(gè)分離(挑取〉并返回到與胚胎發(fā)育時(shí)相同的發(fā)育培養(yǎng)基平板上以前使用過(guò)的發(fā)育培養(yǎng)基(devB)(胚鋪在培養(yǎng)基上的尼龍膜上)2.5g/L(devB)0%(devB)將帶有鋪板的ESM的整個(gè)尼龍膜移動(dòng)到新鮮的發(fā)育培養(yǎng)基(devB)上新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)0.2510%4將胚單個(gè)分離(挑取)，移動(dòng)到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基上新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(沒(méi)有膜，胚直接鋪在培養(yǎng)基上)0.2510%5將胚單個(gè)分離(挑取).移動(dòng)到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)上的膜上新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(胚鋪在培養(yǎng)基上的尼龍膜上)0.25100/o將胚單個(gè)分離(挑取)，移動(dòng)到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)上新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)(胚鋪在培養(yǎng)基上的尼龍膜上)0.3010%8將胚單個(gè)分離(挑取)，移動(dòng)到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)上新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)(胚鋪在培養(yǎng)基上的尼龍膜上)0.305%9將胚單個(gè)分離(挑取)，移動(dòng)到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)上新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)(胚鋪在培養(yǎng)基上的尼龍膜上)0.302.5%10將胚單個(gè)分離(挑取)，移動(dòng)到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)上新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)(胚鋪在培養(yǎng)基上的尼龍膜上)0.3510%11將胚單個(gè)分離(挑取)，移動(dòng)到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)上新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)(胚鋪在培養(yǎng)基上的尼龍膜上)0.355%12將胚單個(gè)分離(挑取).移動(dòng)到新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)上新鮮發(fā)育培養(yǎng)基(devB)(胚鋪在培養(yǎng)基上的尼龍膜上)0.352-5%31在分離時(shí)，手工挑取所有目測(cè)成熟的子葉胚。被挑取的成熟胚的標(biāo)準(zhǔn)如下所有胚具有4+子葉，沒(méi)有可見(jiàn)的發(fā)綠(這包括所有綠色色調(diào))，存在顯著的具有下胚軸和存在的根區(qū)的子葉，下胚軸沒(méi)有裂開(kāi)，以及沒(méi)有半透明的子葉。所有胚，無(wú)論大小，只要滿足標(biāo)準(zhǔn)就被挑取。一個(gè)技術(shù)員使用解剖鏡(5-10X放大倍數(shù))在一個(gè)時(shí)間挑取一整塊鋪板的胚。單個(gè)分離后發(fā)育將挑取的胚在表5中顯示的不同處理?xiàng)l件下進(jìn)行處理，并在表5中顯示的各種不同培養(yǎng)基上繼續(xù)培育4到5周，使得總共在發(fā)育培養(yǎng)基上的總培育時(shí)間為12周(包括單個(gè)分離前和單個(gè)分離后培育時(shí)間)。發(fā)育后測(cè)量在發(fā)育結(jié)束時(shí)(第12周)，在移動(dòng)到層化培養(yǎng)基之前進(jìn)行測(cè)量。對(duì)于每種基因型和處理來(lái)說(shuō)，干重("DW")和水分含量("MC")測(cè)量三份平行樣。每個(gè)胚的干重測(cè)量結(jié)果顯示在圖3中。每個(gè)胚的胚水分含量的結(jié)果顯示在圖4中。層化在發(fā)育12周后，將所有胚或完整培養(yǎng)物移動(dòng)到層化液體培養(yǎng)基中(單個(gè)聚酯襯墊上20misBM5)，并放置在寒冷處，在培養(yǎng)基上在4'C下放置4周。在水上調(diào)制在層化結(jié)束時(shí)，將所有用于萌發(fā)的胚移動(dòng)到放置在小的皮氏培養(yǎng)皿中的干濾紙上。然后將皮氏培養(yǎng)皿在500mls水上放置12-13天。萌發(fā)然后將所有胚在萌發(fā)盒中的100mls萌發(fā)培養(yǎng)基BM6(表2)上萌32發(fā)6周(l周在暗處，其它時(shí)間在光照房間中)，然后評(píng)估萌發(fā)類(lèi)別，并對(duì)類(lèi)別1和2的萌發(fā)物進(jìn)行器官測(cè)量。評(píng)估萌發(fā)物的萌發(fā)頻率和萌發(fā)勢(shì)萌發(fā)百分率、干重和水分含量按照下面的描述進(jìn)行評(píng)估。每個(gè)技術(shù)員在同一天一次處理種植在一個(gè)完整區(qū)塊上的萌發(fā)。類(lèi)別1萌發(fā)物("catl"):出現(xiàn)根以及最少5片上胚軸葉片，每片最少5mm。類(lèi)別1萌發(fā)物可以移植到溫室環(huán)境中。類(lèi)別2萌發(fā)物("cat2"):出現(xiàn)根以及上胚軸(雙極)，但是上胚軸不滿足類(lèi)別1中提出的數(shù)量或長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)。雙極類(lèi)別("雙極"):是類(lèi)別1和2的組合。類(lèi)別3萌發(fā)物("cat3"):是只出現(xiàn)根的胚，沒(méi)有上胚軸。對(duì)類(lèi)別1和類(lèi)別2的萌發(fā)物的根、下胚軸、子葉、上胚軸簇和上胚軸莖的長(zhǎng)度進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果在發(fā)育結(jié)束時(shí)，對(duì)不同處理?xiàng)l件下單個(gè)分離和培育的胚的胚干重和水分含量進(jìn)行了檢測(cè)。圖3顯示了對(duì)于三種基因型A、B和C的每種來(lái)說(shuō)，在表4描述的處理?xiàng)l件下，在發(fā)育12周結(jié)束時(shí)，每個(gè)胚的干重。圖3中的每個(gè)條代表三個(gè)樣品的平均值。如圖3中所示，胚的單個(gè)分離對(duì)于胚干重的顯著增加來(lái)說(shuō)是必需的。例如，對(duì)比處理1和3(未單個(gè)分離)與處理4、5和7-12(單個(gè)分離的)。將胚單個(gè)分離到以前使用過(guò)的培養(yǎng)基中(處理2)，給出了介于處理l(未單個(gè)分離，同樣培養(yǎng)基)和處理3(未單個(gè)分離，移動(dòng)到新鮮培養(yǎng)基中)之間的中間結(jié)果。單個(gè)分離造成的干重增加的程度隨基因型而變化，基因型A對(duì)單個(gè)分離最具響應(yīng)性。圖4用圖形顯示了胚的水分含量與處理和基因型的關(guān)系。每個(gè)條代表三個(gè)樣品的平均值。正如圖4中所示，在來(lái)自所有處理的胚中測(cè)量到的水分含量都高于55%，最大的高于60%。萌發(fā)數(shù)據(jù)合并的基因型分析的結(jié)果圖5用圖形顯示了基于每種處理的所有三種基因型(A、B和C)的合并的數(shù)據(jù)，關(guān)于萌發(fā)類(lèi)別1、2、3和雙極萌發(fā)物的萌發(fā)百分率。誤差線等于90%置信區(qū)間。正如在圖5中顯示的，在處理1(未觸動(dòng)的對(duì)照)和處理2(單個(gè)分離到用過(guò)的培養(yǎng)基中)之間，以及在處理l和處理4(單個(gè)分離到新鮮培養(yǎng)基中)之間，觀察到了萌發(fā)百分率的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(P《0.001)。但是，在處理1和處理3(全ESM膜(未單個(gè)分離的)移動(dòng)到新鮮培養(yǎng)基中)之間沒(méi)有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(p=0.22)。這些結(jié)果證明，單個(gè)分離步驟而不是培養(yǎng)基的差異，是本實(shí)驗(yàn)測(cè)試的參數(shù)中增加萌發(fā)頻率的最關(guān)鍵參數(shù)。表6顯示了類(lèi)別1萌發(fā)物的根長(zhǎng)度、下胚軸長(zhǎng)度、子葉長(zhǎng)度、上胚軸長(zhǎng)度和上胚軸莖長(zhǎng)度的合并的基因型數(shù)據(jù)。表6:類(lèi)別l萌發(fā)物器官長(zhǎng)度，合并的基因型<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*表示與處理1統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異的值(p-0.05或以下)。表6中的數(shù)據(jù)證明了在處理1(對(duì)照)和處理2(單個(gè)分離到用過(guò)的培養(yǎng)基中)之間，以及在處理1和處理4(單個(gè)分離到新鮮培養(yǎng)基中)之間，器官長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。但是，在處理1和處理3(全ESM膜(未單個(gè)分離的)移動(dòng)到新鮮培養(yǎng)基中)之間沒(méi)有觀察到顯著差異。這些結(jié)果與上面描述的圖5中觀察到的相一致。其中特別值得注意的是根的長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(p=0.05)的增加，在處理2或4(以及其它單個(gè)分離的處理)中，與處理1或處理3(未單個(gè)分離的對(duì)照)相比，為1.6倍，而觀察到的差異不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p=1.0)。萌發(fā)數(shù)據(jù)個(gè)體基因型分析的結(jié)果圖6用圖形顯示了通過(guò)處理，對(duì)于類(lèi)別l、2和3萌發(fā)物和雙極萌發(fā)物來(lái)說(shuō)，基因型A的萌發(fā)百分率。誤差線等于90%置信區(qū)間。圖7用圖形顯示了通過(guò)處理，基因型A的類(lèi)別1的萌發(fā)物的萌發(fā)物根長(zhǎng)度("根")、下胚軸長(zhǎng)度("下胚軸")、子葉長(zhǎng)度("子葉")、上胚軸長(zhǎng)度("上胚軸")和上胚軸莖長(zhǎng)度("莖")的數(shù)據(jù)。圖8用圖形描述了通過(guò)處理，基因型B的類(lèi)別1、2和3萌發(fā)物和雙極萌發(fā)物的萌發(fā)百分率。誤差線等于90%置信區(qū)間。圖9用圖形描述了通過(guò)處理，基因型B的類(lèi)別1的萌發(fā)物的萌發(fā)物根長(zhǎng)度、下胚軸長(zhǎng)度、子葉長(zhǎng)度、上胚軸長(zhǎng)度和上胚軸莖長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)。圖10用圖形描述了通過(guò)處理，基因型C的類(lèi)別1、2和3萌發(fā)物和雙極萌發(fā)物的萌發(fā)百分率。誤差線等于90%置信區(qū)間。圖ll用圖形描述了通過(guò)處理，基因型C的類(lèi)別1的萌發(fā)物的萌發(fā)物根長(zhǎng)度、下胚軸長(zhǎng)度、子葉長(zhǎng)度、上胚軸長(zhǎng)度和上胚軸莖長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)。結(jié)果概述當(dāng)結(jié)果來(lái)自于個(gè)體基因型時(shí)，所有測(cè)試的三種基因型(A、B和C)的合并的數(shù)據(jù)顯示出同樣的趨勢(shì)。在處理1與處理2和處理4之間觀察到了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(p=<.001)但是在處理1與處理3之間沒(méi)有觀察到顯著差異(p=0.22)。這些結(jié)果證明，在本實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的參數(shù)中，在發(fā)育過(guò)程中的早期單個(gè)分離，而不是培養(yǎng)基的差異，是增加萌發(fā)百分率和萌發(fā)勢(shì)的最關(guān)鍵變量。對(duì)于萌發(fā)物的萌發(fā)勢(shì)來(lái)說(shuō)，基因型合并數(shù)據(jù)顯示，在用處理1和2或4、而不是處理3進(jìn)行處理后，器官長(zhǎng)度之間存在顯著差異。特別值得注意的是根的長(zhǎng)度增加的顯著差異(p=0.05)，在處理2或4(以及其它處理)中，與處理1和3相比，為1.6倍，而在處理1和處理3之間沒(méi)有差別(p=1.0)。對(duì)于萌發(fā)物萌發(fā)勢(shì)測(cè)量來(lái)說(shuō)，用于尋找質(zhì)量改進(jìn)的最適合的類(lèi)別是類(lèi)別1萌發(fā)，它相當(dāng)于可移植到溫室環(huán)境中的胚。在圖3中顯示的處理l-4中干重差異的樣式，與圖6中顯示的類(lèi)別1萌發(fā)的萌發(fā)百分率緊密相關(guān)。例如，如圖6中所示，通過(guò)在發(fā)育期間單個(gè)分離胚并將單個(gè)分離36的胚轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，與未單個(gè)分離的、未觸動(dòng)的對(duì)照相比，基因型A的萌發(fā)百分率增加了超過(guò)40個(gè)基點(diǎn)。來(lái)自個(gè)體基因型的數(shù)據(jù)與上述的合并數(shù)據(jù)具有同樣的趨勢(shì)。萌發(fā)百分率結(jié)果證明，分別顯示在圖6、圖8和圖10中的所有二種基因型(A、B和C)對(duì)表5中顯示的處理?xiàng)l件具有相同的反應(yīng)，盡管在未觸動(dòng)的對(duì)照(處理l，表5)中萌發(fā)的基礎(chǔ)水平不同。在測(cè)試的三種基因型中，基因型B的萌發(fā)百分率是最低的，但是對(duì)于處理l-4來(lái)說(shuō)，相對(duì)樣式與基因型A和C相似(參見(jiàn)圖8和9)。在最佳的早期單個(gè)分離處理4中，與未觸動(dòng)的、未單個(gè)分離的對(duì)照(參見(jiàn)圖8)相比，觀察到了34個(gè)基點(diǎn)的增加。如圖10中所示，基因型C的對(duì)照胚的萌發(fā)百分率(60+%)，高于基因型A的(顯示在圖6中)，在單個(gè)分離并將胚轉(zhuǎn)移到原始或新鮮培養(yǎng)基之后，與未觸動(dòng)的(未單個(gè)分離的)對(duì)照相比，增加了20個(gè)基點(diǎn)。對(duì)于基因型C來(lái)說(shuō)，通過(guò)早期單個(gè)分離到舊的或新鮮的培養(yǎng)基中，類(lèi)別l萌發(fā)物的器官長(zhǎng)度也增加，如圖ll中所示。同樣地，對(duì)于處理l-4來(lái)說(shuō)，類(lèi)別l萌發(fā)物的萌發(fā)物形態(tài)(圖7)也與干重和萌發(fā)數(shù)據(jù)匹配(對(duì)于其它處理來(lái)說(shuō)程度低些)。表7:每種測(cè)試的基因型的未單個(gè)分離的(處理l)與單個(gè)分離的(處理4)胚的萌發(fā)百分率(類(lèi)別l)的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>這些結(jié)果證明了令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即從胚性胚柄團(tuán)(ESM)早期單個(gè)分離，在測(cè)試的三種基因型中增加了萌發(fā)的成功率，也增加了萌發(fā)物的萌發(fā)勢(shì)。盡管已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了說(shuō)明和描述，但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)它們進(jìn)行各種不同的改變，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1.用于增加體外產(chǎn)生的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的萌發(fā)勢(shì)的方法，該方法包括(a)在第一發(fā)育培養(yǎng)基中進(jìn)行第一段時(shí)間的培育后，從第一胚培養(yǎng)物中單個(gè)分離出多個(gè)單個(gè)的未成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚；以及(b)將多個(gè)單個(gè)分離的未成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚，與第二發(fā)育培養(yǎng)基相接觸，進(jìn)行第二段時(shí)間的培育。2.權(quán)利要求l的方法，其中第一胚培養(yǎng)物是胚性胚柄團(tuán)。3.權(quán)利要求l的方法，其中第一段培育時(shí)間，是其長(zhǎng)度足夠在第一胚培養(yǎng)物中的多個(gè)未成熟針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的一部分上形成一或多個(gè)子葉原基的時(shí)間。4.權(quán)利要求l的方法，其中第一段培育時(shí)間為至少6周。5.權(quán)利要求l的方法，其中第一段培育時(shí)間為7周到8周。6.權(quán)利要求l的方法，其中第二段培育時(shí)間的長(zhǎng)度足夠使多個(gè)單個(gè)分離的未成熟針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的至少一部分達(dá)到解剖學(xué)上的成熟。7.權(quán)利要求l的方法，其中第二段培育時(shí)間為3周到5周。8.權(quán)利要求l的方法，其中第一段培養(yǎng)時(shí)間和第二段培養(yǎng)時(shí)間的組合，總時(shí)間為至少12周。9.權(quán)利要求l的方法，其中單個(gè)分離步驟包括從第一胚培養(yǎng)物中挑取多個(gè)單個(gè)的未成熟針葉樹(shù)體細(xì)胞胚。10.權(quán)利要求9的方法，其中多個(gè)胚的挑取是基于選自胚的尺寸、胚的形狀、胚的表面質(zhì)地和胚的顏色的標(biāo)準(zhǔn)。11.權(quán)利要求2的方法，其中單個(gè)分離步驟包括從多個(gè)單個(gè)的未成熟針葉樹(shù)體細(xì)胞胚中取出胚性胚柄團(tuán)。12.權(quán)利要求ll的方法，其中單個(gè)分離步驟包括從多個(gè)單個(gè)胚中洗掉至少一部分胚性胚柄團(tuán)。13.權(quán)利要求l的方法，其中與第二發(fā)育培養(yǎng)基接觸的單個(gè)分離的未成熟針葉樹(shù)體細(xì)胞胚彼此之間沒(méi)有體接觸。14.權(quán)利要求l的方法，還包括在步驟(b)之前將單個(gè)分離的未成熟針葉樹(shù)體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到多孔基質(zhì)上。15.權(quán)利要求l的方法，其中第一發(fā)育培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度在300mM/Kg到400mM/Kg的范圍內(nèi)。16.權(quán)利要求l的方法，其中第一發(fā)育培養(yǎng)基含有濃度為大約1%到大約10e/。的PEG。17.權(quán)利要求l的方法，其中第二發(fā)育培養(yǎng)基的重量克分子滲透濃度在350mM/Kg到450mM/Kg的范圍內(nèi)。18.權(quán)利要求l的方法，其中第二發(fā)育培養(yǎng)基含有濃度范圍為大約7。/o到大約15。/。的PEG。19.權(quán)利要求l的方法，其中針葉樹(shù)體細(xì)胞胚是火炬松。20.用于生產(chǎn)成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的方法，包括(a)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中或其上培養(yǎng)針葉樹(shù)體細(xì)胞，以產(chǎn)生胚胎發(fā)生細(xì)胞；(b)將步驟(a)中制備的胚胎發(fā)生細(xì)胞培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中或其上，使胚胎發(fā)生細(xì)胞增殖并形成針葉樹(shù)子葉前體細(xì)胞胚；(c)將步驟(b)中形成的針葉樹(shù)子葉前體細(xì)胞胚培養(yǎng)在第一發(fā)育培養(yǎng)基中或其上，進(jìn)行第一段時(shí)間的培育；(d)單個(gè)分離在步驟(C)中培育的多個(gè)針葉樹(shù)體細(xì)胞胚；以及(e)將多個(gè)單個(gè)分離的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚培育在第二發(fā)育培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二段時(shí)間的培育。全文摘要本申請(qǐng)一方面，提供了用于增加在體外生產(chǎn)的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚的萌發(fā)勢(shì)的方法。所述方法包括(a)在第一發(fā)育培養(yǎng)基中進(jìn)行第一段時(shí)間的培育后，從第一胚培養(yǎng)物中單個(gè)分離出多個(gè)單個(gè)的未成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚，以及(b)將多個(gè)單個(gè)分離的未成熟的針葉樹(shù)體細(xì)胞胚，與第二發(fā)育培養(yǎng)基相接觸，進(jìn)行第二段時(shí)間的培育。文檔編號(hào)A01H4/00GK101686644SQ200880021670公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日發(fā)明者巴莫德·K·古普塔,羅杰·蒂米斯,蘇珊·D·雷菲爾德,詹姆斯·A·格羅布申請(qǐng)人:韋爾豪澤公司