一種橡膠樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種橡膠樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株 再生的方法。本發(fā)明以橡膠樹古銅期或淡綠期的芽條或芽條被摘頂后由其側(cè)芽萌發(fā)3-4周 的幼嫩側(cè)枝的帶腋芽的莖段為外植體，通過體細(xì)胞發(fā)生途徑獲得橡膠樹再生植株。
【背景技術(shù)】
[0002] 橡膠樹（HeveabrasiliensisMuell-Arg)屬大戟科橡膠屬，是多年生的異花授粉 喬木，在熱帶地區(qū)廣泛種植。其所產(chǎn)的天然橡膠是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，在國民經(jīng)濟(jì) 中占有舉足輕重的地位。
[0003] 通過體細(xì)胞發(fā)生途徑來獲得再生植株是植物組培苗工廠化生產(chǎn)和遺傳轉(zhuǎn)化的重 要方法?，F(xiàn)有技術(shù)中，橡膠樹體細(xì)胞發(fā)生途徑獲得再生植株主要采用花藥培養(yǎng)和內(nèi)珠被培 養(yǎng)。
[0004] 橡膠樹花藥培養(yǎng)技術(shù)是以處于單核期的橡膠樹雄花為外植體，剝離雄蕊，接種于 誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，再將愈傷組織接種于誘導(dǎo)體胚培養(yǎng)基誘導(dǎo)體胚發(fā)生，最 后將成熟胚狀體接種于植株再生培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出完整小植株。
[0005] 橡膠樹內(nèi)珠被培養(yǎng)技術(shù)是以橡膠樹授粉后45-75天的幼果中的內(nèi)珠被為外植體， 誘導(dǎo)愈傷組織，再經(jīng)愈傷組織分化體胚，最后由成熟的胚狀體分化成植株。
[0006] 上述兩種再生技術(shù)體系均存在如下缺點(diǎn)：①易受取材季節(jié)制約，不能長期進(jìn)行培 養(yǎng)。橡膠樹每年開花三次，分為春花、夏花和秋花，每次花期較短，一般為半個(gè)月，能進(jìn)行花 藥培養(yǎng)的時(shí)間較短。眾所周知，橡膠樹的春花的自然授粉較高，而夏花、秋花的自然授粉較 低，因此內(nèi)珠被的取材時(shí)間一般為春花自然授粉后45-75d，也就是在中國海南每年的5月 中旬至6月中旬為采樣進(jìn)行內(nèi)珠被培養(yǎng)的最佳時(shí)期，這種較短的取材時(shí)間嚴(yán)重制約了內(nèi)珠 被的培養(yǎng)。②橡膠樹的植株再生極度依賴于基因型。在花藥培養(yǎng)中，僅限于海墾2、熱研 88-13等少數(shù)幾個(gè)品種成功建立花藥培養(yǎng)體系。在內(nèi)珠被培養(yǎng)中，也僅限于PB260等少數(shù) 幾個(gè)品種成功建立內(nèi)珠被培養(yǎng)體系。而對于大量的其它品種由于體胚發(fā)生能力差而不能 成功建立體細(xì)胞發(fā)生體系（孫愛花等，橡膠樹花藥的培養(yǎng)，植物生理學(xué)通訊，2006,42(4): 785-789;黃天帶等，橡膠樹內(nèi)珠被研宄進(jìn)展，生命科學(xué)研宄，2011，15 (2) :176-183)。這些 缺點(diǎn)制約了橡膠樹組培苗工廠化生產(chǎn)和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，因此必須在橡膠樹中建立一 種高效、不受采樣時(shí)間限制和非基因依賴性的體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)體系，為組培苗工廠化 生產(chǎn)和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供新技術(shù)途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種橡膠樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株 再生的方法。本發(fā)明利用橡膠樹的芽條及其側(cè)芽生長不受季節(jié)影響的優(yōu)勢，以幼嫩芽條和 芽條的幼嫩側(cè)枝中的腋芽為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)、體胚發(fā)生和植株再生途徑，本發(fā)明 的方法不受采樣時(shí)間限制和非基因依賴性，是一種高效的橡膠樹體細(xì)胞發(fā)生培養(yǎng)體系。
[0008] 本發(fā)明通過下屬技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種橡膠樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的方法，其最佳實(shí)施方案包括下列步驟：
[0010] (1)外植體的選取、消毒和剝離：選取橡膠樹古銅期或淡綠期的芽條或芽條被摘 頂后由其側(cè)芽萌發(fā)3-4周齡的幼嫩側(cè)枝，用剪刀剪除葉片，將枝條切成1-1. 5cm帶有腋芽的 莖段。將帶有腋芽的莖段用洗潔精清洗5分鐘，再用自來水沖洗30分鐘，濾紙吸干，然后用 70%的酒精消毒30-60秒，0. 15%升汞溶液消毒8-12分鐘，用無菌水沖洗5遍，用無菌濾紙 吸干。將消毒好的莖段于無菌條件下置于超凈工作臺的體視顯微鏡中，小心剝離出橡膠樹 腋芽點(diǎn)外植體。
[0011] (2)愈傷組織誘導(dǎo)：將剝離出的橡膠樹腋芽點(diǎn)接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于 24-28 °C暗培養(yǎng)50-70天。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加2, 4-D(2， 4_二氯苯氧乙酸）10mg/L，NAA(萘乙酸）2mg/L，6-BA(6-芐基氨基嘌呤）0? 5mg/L，蔗糖 4〇g/L，椰子水5%(V/V)，Phytagel2. 2g/L;補(bǔ)充蒸餾水至1L。滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至 5. 8-6. 2〇
[0012] (3)體胚（胚狀體）誘導(dǎo)：將愈傷組織接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中于24-28°C暗培 養(yǎng)50-70天。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將MS培養(yǎng)基中大量元素的 濃度降為80%，微量元素濃度增加1倍，附加6-BA0. 5mg/L，KT(細(xì)胞激動(dòng)素）2mg/L，NAA lmg/L，GA3赤霉素）0? 5mg/L，活性碳 0? 1 % (W/V)，鹿糖 40g/L，Phytagel2. 2g/L;補(bǔ)充蒸餾 水至1L。滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8-6. 2。
[0013] (4)植株誘導(dǎo)：將成熟的胚狀體接種于植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于24_28°C，光照強(qiáng)度 為2000Lux條件下培養(yǎng)40-50天。植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將MS培 養(yǎng)基中大量元素的濃度降為80%，附加KTlmg/L，GA3lmg/L，活性碳0. 1% (W/V)，蔗糖30g/ L，Phytagel2. 2g/L;補(bǔ)充蒸餾水至1L。滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至5. 8-6. 2。
[0014]申請人公開了一種適用于橡膠樹芽條或芽條摘頂后萌發(fā)的帶腋芽莖段的體細(xì)胞 胚胎發(fā)生和植株再生的培養(yǎng)基，按下述成分和配制方法配制：
[0015] (1)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加2, 4-D10mg/L，萘乙 酸 2mg/L，6-芐基氨基嘌呤 0? 5mg/L，蔗糖 40g/L，椰子水 5 % (V/V)，Phytagel2. 2g/L; pH5. 8~6. 2 ；
[0016] (2)胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將MS培養(yǎng)基中大量元素的 濃度降為80 %，微量元素濃度增加1倍，附加6-芐基氨基嘌呤0. 5mg/L，細(xì)胞激動(dòng)素2mg/ L，萘乙酸lmg/L,赤霉素 0.5mg/L，活性碳 0.1% (W/V)，鹿糖 40g/L，Phytagel2.2g/L; pH5. 8~6. 2 ；
[0017] (3)植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將MS培養(yǎng)基中大量元素的 濃度降為80%，附加細(xì)胞激動(dòng)素lmg/L，赤霉素lmg/L，活性碳0. 1 % (W/V)，蔗糖30g/L， Phytagel2. 2g/L;pH5. 8-6. 2。
[0018] 本發(fā)明建立的一種橡膠樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的方法及其培養(yǎng)基可以在 橡膠樹離體繁殖中應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 1.本發(fā)明所采用的外植體來源不受采樣季節(jié)限制，可以長年進(jìn)行橡膠樹組織和細(xì) 胞培養(yǎng)的橡膠樹的芽條及其側(cè)芽，克服了現(xiàn)有技術(shù)的外植體取材時(shí)間上的制約。
[0021] 2.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明克服了橡膠樹的基因型的制約，建立了橡膠樹非基因 型依賴的體細(xì)胞高效再生培養(yǎng)體系。
[0022] 3.本發(fā)明為橡膠樹芽條或芽條摘頂后萌發(fā)的帶腋芽莖段的組織培養(yǎng)快速成苗提 供了高效工廠化育苗技術(shù)，對我國橡膠樹戰(zhàn)略發(fā)展具有重要意義