一種提高紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種提高紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紅松(Pinuskoraiensis)是我國東北地區(qū)極其重要的優(yōu)質(zhì)用材樹種，也是發(fā)展前景巨大的堅果經(jīng)濟林樹種。體細胞胚胎發(fā)生是快速繁殖和人工種子研制的基礎(chǔ)，對遺傳改良有重要意義。進行紅松體細胞胚胎發(fā)生和不定芽發(fā)生研究，既可以為其生物學研究提供有效組培體系，又可以直接用于優(yōu)良種質(zhì)材料的無性擴繁。但現(xiàn)在進行紅松體細胞發(fā)生時，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率都較低，嚴重制約了紅松的體細胞胚胎發(fā)生方面的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是要解決現(xiàn)有紅松在進行體細胞胚胎發(fā)生時，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率低的問題，提供一種提高紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率的方法。
[0004]本發(fā)明一種提高紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率的方法按以下步驟進行:
[0005]一、材料的滅菌
[0006]將處于裂生多胚期的紅松球果滅菌后，剝?nèi)シN皮，再次滅菌，得到滅菌后的合子胚；
[0007]二、胚性愈傷誘導(dǎo)
[0008]將步驟一得到的滅菌后的合子胚接種于培養(yǎng)基中，在23?25°C的條件下，暗培養(yǎng)58?65d，得到胚性愈傷組織，其中培養(yǎng)基為DCR培養(yǎng)基+瓊脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖35g/L+NAA2mg/L+6-BA 1.5mg/L+酸水解酪蛋白 0.8g/L;培養(yǎng)基pH=5.8;
[0009]三、愈傷組織的繼代保持與增殖
[0010]將步驟二得到的胚性愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，得到增殖后的愈傷組織；
[0011]四、原胚的誘導(dǎo)
[0012]將增殖后的愈傷組織接種到培養(yǎng)基中進行原胚的誘導(dǎo)，在23?25°C的條件下，暗培養(yǎng)7?15d，得到帶有球形胚的愈傷組織;其中培養(yǎng)基為DCR培養(yǎng)基+酸水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺 500mg/+蔗糖 20g/L+瓊脂 6.5g/L+活性炭 2g/L+肌醇 4g/L; pH=5.8;
[0013]五、體細胞胚的發(fā)育與植株再生
[0014]將帶有球形胚的愈傷組織接種到培養(yǎng)基中進行體胚發(fā)育，完成轉(zhuǎn)胚過程，得到子葉胚；同時對獲得的子葉胚進行成熟誘導(dǎo)，得到成熟胚，然后進行萌發(fā)、植株再生與移栽成苗。
[0015]本發(fā)明通過培養(yǎng)基中各組分的合理配比與適宜的培養(yǎng)條件，使紅松在進行體細胞胚胎發(fā)生時，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率都得到了提高，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達到33.3%，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)肌醇對球形胚的誘導(dǎo)以及后期體胚發(fā)育與成熟有重要作用，通過加入肌醇使胚性愈傷褐化程度降低，且更有助于球形胚的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)胚率是不加肌醇的6-8倍。
【附圖說明】
[0016]圖1為實施例一中胚性愈傷組織的照片；
[0017]圖2為實施例一中早期原胚的照片；
[0018]圖3為實施例一中球形胚的照片；
[0019]圖4和圖5為實施例一中體細胞胚發(fā)育的照片。
【具體實施方式】
[0020]【具體實施方式】一:本實施方式一種提高紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率的方法按以下步驟進行:
[0021]一、材料的滅菌
[0022]將處于裂生多胚期的紅松球果滅菌后，剝?nèi)シN皮，再次滅菌，得到滅菌后的合子胚；
[0023]二、胚性愈傷誘導(dǎo)
[0024]將步驟一得到的滅菌后的合子胚接種于培養(yǎng)基中，在23?25°C的條件下，暗培養(yǎng)58?65d，得到胚性愈傷組織，其中培養(yǎng)基為DCR培養(yǎng)基+瓊脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖35g/L+NAA2mg/L+6-BA 1.5mg/L+酸水解酪蛋白 0.8g/L;培養(yǎng)基pH=5.8;
[0025]三、愈傷組織的繼代保持與增殖
[0026]將步驟二得到的胚性愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，得到增殖后的愈傷組織；
[0027]四、原胚的誘導(dǎo)
[0028]將增殖后的愈傷組織接種到培養(yǎng)基中進行原胚的誘導(dǎo)，在23?25°C的條件下，暗培養(yǎng)7?15d，得到帶有球形胚的愈傷組織;其中培養(yǎng)基為DCR培養(yǎng)基+酸水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺 500mg/+蔗糖 20g/L+瓊脂 6.5g/L+活性炭 2g/L+肌醇 4g/L; pH=5.8;
[0029]五、體細胞胚的發(fā)育與植株再生
[0030]將帶有球形胚的愈傷組織接種到培養(yǎng)基中進行體胚發(fā)育，完成轉(zhuǎn)胚過程，得到子葉胚；同時對獲得的子葉胚進行成熟誘導(dǎo)，得到成熟胚，然后進行萌發(fā)、植株再生與移栽成苗。
[0031]本實施方式中的紅松球果采集于黑龍江省葦河林業(yè)局青山林木種子園。
[0032]本實施方式通過培養(yǎng)基中各組分的合理配比與適宜的培養(yǎng)條件，使紅松在進行體細胞胚胎發(fā)生時，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率都得到了提高，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達到33.3%，本實施方式發(fā)現(xiàn)肌醇對球形胚的誘導(dǎo)以及后期體胚成熟有重要作用，通過加入肌醇使胚性愈傷褐化程度降低，且更有助于球形胚向成熟胚轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)胚率是不加肌醇的6-8倍。
[0033]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟一中處于裂生多胚期的紅松球果滅菌的方法為:將紅松球果洗凈，然后削去種鱗，再用質(zhì)量濃度為70%的酒精處理3?5min，然后用無菌水沖洗2?4次，再用質(zhì)量濃度10%次氯酸鈉浸泡20?30min。其它與【具體實施方式】一相同。
[0034]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:步驟一中再次滅菌的方法為:用質(zhì)量濃度為3%的雙氧水處理8min，無菌水沖洗2?4次。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0035]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是:步驟二中暗培養(yǎng)60d。其它與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0036]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是:步驟三中繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為DCR培養(yǎng)基+瓊脂6.5g/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖30g/L+2，4-D0.5g/L+6-BA 0.lg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L; pH=5.8。其它與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0037]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是:步驟三中繼代培養(yǎng)是在23?25°C的條件下，暗培養(yǎng)15d。其它與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0038]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一不同的是:步驟四中暗培養(yǎng)12d。其它與【具體實施方式】一至六之一相同。
[0039]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一不同的是:步驟五中暗培養(yǎng)70d。其它與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0040]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一至八之一不同的是:步驟五中體胚成熟誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DCR培養(yǎng)基+瓊脂7.lg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+蔗糖60g/L+脫落酸20mg/L+PEG400050g/L+IBA 0.2mg/L+活性炭2g/L；pH= 5.8。其它與【具體實施方式】一至八之一相同。
[0041 ]【具體實施方式】十:本實施方式與【具體實施方式】一至九之一不同的是:步驟五體胚成熟誘導(dǎo)是在23?25°C的條件下，暗培養(yǎng)60?80d，每3?4周繼代一次。其它與【具體實施方式】一至九之一相同。
[0042]下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0043]實施例1:本實施例提高紅松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)胚率的方法，按以下步驟進行:
[0044]—、材料的滅菌
[0045]將處于裂生多胚期的紅松球果洗凈，然后削去種鱗，再用質(zhì)量濃度為70%的酒精處理2min，然后用無菌水沖洗3次，再用質(zhì)量濃度10 %次氯酸鈉浸泡25min，之后于超凈工作臺下剝?nèi)シN