專利名稱：一種調節(jié)時差反應的新方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到生理學及神經生物學領域。具體地說，本發(fā)明通過抑制Magedl分子 的活性來達到減輕時差反應，使生物體快速適應新的晝夜光照環(huán)境的目的。
背景技術：
隨著現代社會生活節(jié)奏的加快，及新的交通工具的發(fā)明，人們延續(xù)了幾千年的生 活方式正在發(fā)生著根本性的改變?，F代的生活方式對人們生理健康的影響也逐漸顯現。在人們的各種生理過程中，近日節(jié)律(即人們通常所說的生物鐘)所受的沖擊及 其所產生的后果尤為突出。近日節(jié)律是指生物體內自發(fā)維持的、周期接近24小時的生物節(jié) 律。它對生物體適應并預期周圍環(huán)境的晝夜變化起著重要作用，并且協(xié)調著體內其他生理 過程。但是在現代社會的很多方面，晝夜節(jié)律與新的作息方式的相互沖突正在越來越明顯 的困擾著人們。飛機的發(fā)明將環(huán)繞地球的時間從幾個月甚至一年縮短到了兩天，使得人們 短時間內穿梭于各個國家交流、活動成為了可能，但也帶來了之前從未有過的時差反應。很 多工廠所采用的24小時三班倒的工作制度大大提高了工廠的生產效率，但也帶來很多新 的問題，如夜班事故多發(fā)，長期從事這樣工作的人身體嚴重受損等等。因此，研究解決如何 有效的調控晝夜節(jié)律，使其更好的服務于人們，已成為一個日趨重要的課題。

發(fā)明內容
發(fā)明目的本發(fā)明希望通過遺傳學與分子生物學手段來發(fā)展一種新的可以有效調節(jié)生物鐘 的方法，使得在模擬的調時差反應中，生物體可以更快的適應新的日照環(huán)境。發(fā)明概述本發(fā)明發(fā)展了一套通過抑制Magedl分子的活性，從而減小生物體內核心生物鐘 振蕩幅度，達到更快速的調節(jié)生物鐘的目的。并在模擬的調時差反應中展示了這一方法具 有良好的效果。抑制Magedl分子的活性通過構建Magedl敲除小鼠實現，并通過分子生物 學手段在體內驗證了生物鐘核心分子振幅明顯下降。對所構建模型在調時差反映中的表現 我們通過小鼠跑輪實驗證實。


圖1為Magedl敲除小鼠的基因打靶載體策略、DNA基因型鑒定及蛋白確認結果。 a，基因打靶載體構建策略；b，PCR鑒定得到的陽性克隆，左圖為5’端，右圖為3’端結果；c， western結果，確認Magedl已敲除。圖2為Magedl敲除小鼠體內核心生物鐘分子Bmall的變化情況。圖3為一對代表性的Magedl敲除小鼠與野生型對照在近日節(jié)律周期測定過程中 的活動。圖4為一對代表性的Magedl敲除小鼠與野生型對照在模擬的調時差反映中的活動情況。
具體實施例方式1. Magedl敲除小鼠的構建我們首先在基因打靶載體上用PGK-Neo替換Magedl外顯子3_8部分，隨后將改造 好的載體線形化，電轉到小鼠的ES細胞中使之與ES細胞內的等位基因發(fā)生重組，用PCR和 Southern鑒定陽性克隆，然后將陽性克隆注射到假孕母鼠的囊胚中，獲得嵌合鼠。將嵌合鼠 回交到C57/BL6J 10代以上進行下面的分子生物學實驗及表性分析。具體敲除策略及基因 型鑒定、蛋白驗證結果見圖1。2. Magedl體內生物鐘核心分子組件振幅下降的驗證全身敲除Magedl的小鼠生長正常。我們將同窩出生的Magedl敲除與野生型對照 置于12小時光照12小時黑暗的環(huán)境中牽引一周，然后將光照條件改為持續(xù)黑暗，在持續(xù)黑 暗的第二天早8點至第三天早8點每隔4小時采集一次敲除小鼠與野生型對照的肝、肺樣 本，用于提取RNA及蛋白。將連續(xù)7個時間點的樣本用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取肝的總RNA，測 定OD并校正后用SuperScriptIII (Invitrogen公司)逆轉錄得到cDNA。將得到cDNA進行 熒光定量PCR反應，檢測小鼠體內生物鐘核心分子含量，并通過β-Actin進行校正。結果 見圖2。圖中可以明顯看到，Bmall分子的表達量明顯下降，峰谷值的差也大大減小。這表 明，在Magedl的敲除小鼠中，核心時鐘基因的振幅是明顯下降的。值得注意的是Bmall與 另一時鐘蛋白CLOCK形成的復合體負責了多個時鐘基因的轉錄。這暗示整個生物鐘的穩(wěn)定 性在缺乏Magedl時都受到減弱。3. Magedl敲除小鼠的晝夜節(jié)律周期變短，時差調節(jié)加快我們將Magedl敲除小鼠與同窩的野生對照置于帶有輪子的飼養(yǎng)籠中，用計算機 記錄小鼠的活動節(jié)律性。在最初的一周中，我們給小鼠12小時光照12小時黑暗的正常光照 條件對小鼠進行牽引，并讓其適應跑輪環(huán)境，然后我們將小鼠完全黑暗的環(huán)境中，記錄小鼠 的晝夜節(jié)律3個星期，對結果進行分析(見圖3)。結果表明，相比于野生型的23. 72士0. 16 小時，Magedl敲除的小鼠近日節(jié)律周期明顯變短，為23. 16士0. 19小時。同時，我們對兩組小鼠進行了模擬調時差反應實驗。在最初的一周中，我們將小鼠 置于每天早8點開燈，晚8點關燈的環(huán)境中牽引，并讓其適應跑輪環(huán)境，然后我們將開燈時 間與關燈時間均提前4小時，也即模擬了人們乘飛機向東飛行4個時區(qū)的事件。記錄的小 鼠活動表明，Magedl敲除小鼠2-3天內即可適應新的光照環(huán)境，而野生小鼠則要一周的時 間(見圖4)。這說明Magedl敲除小鼠在模擬的調時差事件中反應明顯更加快。
權利要求
黑色素瘤抗原家族蛋白，D，1(Melanoma Antigen，Family D，1，簡稱Maged1)作為一個新的調節(jié)哺乳動物晝夜節(jié)律的基因，其特征在于在Maged1敲除出的小鼠中，其晝夜節(jié)律周期變短；并且在模擬的時差反應中，對新光照條件的適應要快于野生型小鼠。
2.根據權利要求1所述的Magedl的特征，調節(jié)Magedl的表達作為一個新的治療時差 反應的方法。Magedl作為一個新的治療時差反應藥物的靶點。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的調節(jié)哺乳動物時差反應的方法，涉及到一種新的調節(jié)哺乳動物晝夜節(jié)律的蛋白Maged1，它對維持正常的生物鐘功能起著重要作用。在Maged1敲出的小鼠中，核心生物鐘分子振幅變小，其晝夜周期變短，在模擬的時差反應中調節(jié)速度加快。Maged1可作為治療人的時差反應的一個藥物靶點。
文檔編號A01K67/027GK101899494SQ20091002730
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權日2009年5月27日
發(fā)明者唐晶, 徐瓔, 王曉翰, 谷習文, 高翔 申請人:南京大學