專利名稱：利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)是夾竹桃科(Apocynaceae)長(zhǎng)春花屬植物，其 含有100多種具有生物活性的萜類吲哚生物堿(TIAs)，如長(zhǎng)春堿(Vinblastine) 和長(zhǎng)春新堿(Vincristine)具有抗癌作用，阿嗎堿(Ajmalicine)和蛇根堿 (Serpentine)則能抗高血壓、具有抗菌鎮(zhèn)靜的效用。其中長(zhǎng)春堿的半合成衍生 物長(zhǎng)春瑞濱已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，是目前應(yīng)用最廣的抗腫瘤藥物。長(zhǎng)春花成 為最有經(jīng)濟(jì)和應(yīng)用價(jià)值的藥用模式植物。
在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，由于萜類吲哚生物堿在長(zhǎng)春花中含量極低，尤其是雙萜 類U引哚生物堿，如長(zhǎng)春堿在長(zhǎng)春花中的含量?jī)H為萬分之五，而長(zhǎng)春新堿的含量則 更低甚至常規(guī)手段難以檢測(cè)，因而大量提取獲得長(zhǎng)春花生物堿成為瓶頸；同時(shí)， 長(zhǎng)春花的代謝途徑極其復(fù)雜繁復(fù)，目前的化學(xué)合成工藝難以高效、低成本地獲得 所需的生物堿，這使長(zhǎng)春花藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受,。因此闡釋長(zhǎng)春花的代 謝途徑機(jī)理、提高其生物堿含量成為研究熱點(diǎn)。國(guó)外研究者長(zhǎng)期致力于應(yīng)用植物 生物反應(yīng)器，即利用長(zhǎng)春花的懸浮細(xì)胞系來大規(guī)模生產(chǎn)抗癌成分長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新 堿，但由于細(xì)胞系中無法合成長(zhǎng)春堿的前體物質(zhì)文多靈(Vindoline)，使得長(zhǎng)春 堿的合成受阻，因而收效甚微。利用基因代謝工程，即轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高生物堿在 長(zhǎng)春花中的產(chǎn)量以便產(chǎn)業(yè)化則成為極具前景的選擇。選取長(zhǎng)春花代謝途徑中的關(guān) 鍵酶基因或轉(zhuǎn)錄因子，使用分子生物學(xué)手段采取單基因或多基因轉(zhuǎn)化策略，直接 影響并調(diào)控長(zhǎng)春花植物體內(nèi)的代謝合成，從而提高作為次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物堿在 長(zhǎng)春花內(nèi)的產(chǎn)量。長(zhǎng)春花的再生體系則是轉(zhuǎn)基因策略中的關(guān)鍵技術(shù)。已有報(bào)道的 是長(zhǎng)春花毛狀根再生植株，主要應(yīng)用于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系，但通過毛狀 根再生出的植株是畸形不育的，不利于基因工程策略的實(shí)施。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)
4化法是目前應(yīng)用最為廣泛的植物轉(zhuǎn)基因方法，它通過侵染除毛狀根以外的外植體 (如葉片，莖段等)，誘導(dǎo)愈傷組織再生出正常的完整植株，從而得到轉(zhuǎn)基因株 系，目前為止直接通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)春花植株還未見報(bào)道，主要 原因就在于還無法建立起高效成熟的長(zhǎng)春花除毛狀根以外的外植體再生體系。雖 有利用長(zhǎng)春花體細(xì)胞的胚胎發(fā)生再生植株的研究報(bào)道，但通過此方法所需的再生 周期長(zhǎng)、體胚發(fā)生頻率低、不能達(dá)到同步化、發(fā)育過程中常常形成畸形或無根苗， 還未能建立起快速穩(wěn)定的利用體細(xì)胞胚胎再生的培養(yǎng)體系，使得長(zhǎng)春花的轉(zhuǎn)基因 工程受限。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，未見與本發(fā)明的利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生 植株的方法有關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再 生植株的方法。本發(fā)明的方法使得長(zhǎng)春花下胚軸的不定芽分化率達(dá)81%，不定芽 生根率為100%。
本發(fā)明涉及一種利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法，包括如下步驟 步驟一，取長(zhǎng)春花種子，置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出第一對(duì)子葉之時(shí)， 取下胚軸，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得愈傷組織；
步驟二，將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得綠色愈傷組織； 步驟三，將綠色愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得不定芽； 步驟四，取不定芽，置入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得試管苗； 步驟五，取試管苗，利用快速繁殖培養(yǎng)基進(jìn)行快速繁殖，得再生植株； g巾，
所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.0mg/L2， 4-二氯苯氧乙酸+1.0 mg/L a -萘乙酸+ 0. lmg/L玉米素+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3% 蔗糖+ 0.3%植物凝膠；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.8;
所述分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 5.0 mg/L 6-芐基腺嘌呤+ 0.5 mg/L a-萘乙酸+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0. 3%植物凝膠； 分化培養(yǎng)基的pH為5.8;
所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 1.75mg/L 6-芐基腺嘌呤+ 0.55mg/L 3-吲哚乙酸+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0.3% 植物凝膠；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5. 8;
所述生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基+O. 3mg/L a-萘乙酸+ 3%蔗糖+0. 3%植物 凝膠；生根培養(yǎng)基的pH為5.8;
所述快速繁殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 3%蔗糖+0. 3%植物凝膠。
步驟一中，所述置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為25土rc，每天光 照16h，培養(yǎng)10 12d。
步驟二中，所述培養(yǎng)為25土rC，每天光照16h，培養(yǎng)10 12d。
步驟三中，所述培養(yǎng)為培養(yǎng)1 2代，每代12 14d，培養(yǎng)溫度為25±1 。C，每天光照16h。
步驟四中，所述培養(yǎng)為25土rC,每天光照16h，培養(yǎng)15 20d。
步驟五中，所述快速繁殖具體為通過切割增殖手段在快速繁殖培養(yǎng)基中進(jìn) 行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度均為25土rC，每天光照16h。
本發(fā)明技術(shù)方案中涉及的MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基的具體組分可分別見 Murashige T和Skoog F在《Physiologia Plantar咖》(植物生理學(xué))1962年第 15巻第3期473 497頁上發(fā)表的題為《A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures》(一種用于煙草組織培養(yǎng)物快速生 長(zhǎng)和生物分析的改進(jìn)培養(yǎng)基)和TangK等在《Plant Science》(植物科學(xué))2001 年第160巻第6期1035 1042頁上發(fā)表的題為transgenic rice plants expressing the ferredoxin_like protein (API) from sweet pepper show enhanced resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae》(表達(dá)來源于舌甘椒 的鐵氧環(huán)類蛋白API的轉(zhuǎn)基因水稻顯示出對(duì)白葉枯病具有增強(qiáng)的抗性)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明篩選出適合長(zhǎng)春花下 胚軸不定芽分化和生根的培養(yǎng)基，長(zhǎng)春花下胚軸的不定芽分化率達(dá)81%，不定芽 生根率為100%，再生植株的移栽成活率為100%;長(zhǎng)春花下胚軸再生技術(shù)的建立， 為長(zhǎng)春花基因工程技術(shù)育種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，使通過基因調(diào)控其代謝途徑從而 獲得萜類吲哚生物堿高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)春花新品系成為可能，為解決萜類吲哚生物 堿藥源匱乏、滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)需要具有重要意義。


圖1為實(shí)施例綠色愈傷組織示意圖。
圖2為實(shí)施例不定芽示意圖。
圖3為實(shí)施例試管苗示意圖。
圖4為實(shí)施例長(zhǎng)春花再生植株株系示意圖。
圖5為實(shí)施例5長(zhǎng)春花植株示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于 下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 或按照制造廠商所建議的條件。如無特別說明，各種培養(yǎng)基配方中的百分?jǐn)?shù)均為 重量體積百分?jǐn)?shù)(w/v)。
實(shí)施例
步驟一，長(zhǎng)春花下胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)
將長(zhǎng)春花種子置于MS培養(yǎng)基上發(fā)芽4 5d后，在其剛長(zhǎng)出第一對(duì)子葉之時(shí)， 取下胚軸，剪成5 10mm長(zhǎng)的節(jié)段，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；所述愈傷組織 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 1.0mg/L 2， 4-二氯苯氧乙酸+ 1. 0mg/L a-萘乙酸 + 0. lmg/L玉米素+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0.3% 植物凝膠；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.8;經(jīng)過10 12天的光照培養(yǎng)，培養(yǎng) 溫度為25土rC，每天光照16h，可在外植體的剪切處形成透明較為疏松的塊狀 愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%;
步驟二，長(zhǎng)春花下胚軸愈傷組織的分化
之后將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，所述分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 5.0mg/L 6-芐基腺嘌呤+ 0.5mg/L (1-萘乙酸+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L 脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0. 3%植物凝膠；分化培養(yǎng)基的pH為5. 8;經(jīng)過10 12d的 光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25土rC，每天光照16h，可誘導(dǎo)出具有分化成芽點(diǎn)能力 的綠色愈傷組織，誘導(dǎo)率為95% (如圖1)。
步驟三，長(zhǎng)春花愈傷組織不定芽的分化
選取綠色愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 2代，每代12 14 d， 培養(yǎng)溫度為25土rC，每天光照16h;所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.75mg/L 6-芐基腺嘌呤+ 0.55 mg/L 3-吲哚乙酸+ 150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 0. 3。/。植物凝膠；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.8; 綠色愈傷組織表面逐漸形成芽點(diǎn)，芽點(diǎn)繼續(xù)生長(zhǎng)并分化形成不定芽(如圖2)， 并可長(zhǎng)高至1. 5 2. 5cm，不定芽分化率達(dá)85%以上。 步驟四，長(zhǎng)春花不定芽的生根
切取愈傷組織中分化出的不定芽，置入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，所述生 根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基+0. 3mg/L a -萘乙酸+ 3%蔗糖+0. 3%植物凝膠；生根 培養(yǎng)基的pH為5.8。培養(yǎng)溫度為25士rC，每天光照16h，經(jīng)過15 20d的光照 培養(yǎng)，可從不定芽基部分化出4 8條根(如圖3),根的分化率為100%， 30 d 后可長(zhǎng)成5 6cm高，具有3 6對(duì)葉片的試管苗。
步驟五，長(zhǎng)春花再生植株的快速繁殖及長(zhǎng)春花再生植株的移栽
選取生長(zhǎng)健壯的長(zhǎng)春花再生植株，通過切割增殖手段在快速繁殖培養(yǎng)基中進(jìn) 行培養(yǎng)，形成長(zhǎng)春花再生植株株系(如圖4);所述的快速繁殖培養(yǎng)基為MS培 養(yǎng)基+ 3%蔗糖+0. 3%植物凝膠，培養(yǎng)溫度均為25土rC，每天光照16h。
選取生長(zhǎng)健壯、繁殖系數(shù)高的株系，移栽到裝有移栽基質(zhì)的花盆中，所述的
移栽基質(zhì)成分為蛭石珍珠巖泥炭土為2: 1: 6 (體積比)。培養(yǎng)溫度為25
土rC，每天光照12h，通過馴化2 3周后可移栽至大田中，可獲得生長(zhǎng)正常的 長(zhǎng)春花植株(如圖5)，移栽成活率達(dá)100%。
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權(quán)利要求
1、一種利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，取長(zhǎng)春花種子，置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出第一對(duì)子葉之時(shí)，取下胚軸，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得愈傷組織；步驟二，將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得綠色愈傷組織；步驟三，將綠色愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得不定芽；步驟四，取不定芽，置入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得試管苗；步驟五，取試管苗，利用快速繁殖培養(yǎng)基進(jìn)行快速繁殖，得再生植株；其中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+1.0mg/L α-萘乙酸+0.1mg/L玉米素+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+0.3％植物凝膠；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.8；所述分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+5.0mg/L 6-芐基腺嘌呤+0.5mg/L α-萘乙酸+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+0.3％植物凝膠；分化培養(yǎng)基的pH為5.8；所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.75mg/L 6-芐基腺嘌呤+0.55mg/L3-吲哚乙酸+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+0.3％植物凝膠；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.8；所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+0.3mg/L α-萘乙酸+3％蔗糖+0.3％植物凝膠；生根培養(yǎng)基的pH為5.8；所述快速繁殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.3％植物凝膠。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法，其特征 是，步驟一中，所述置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為25土rc，每天光 照16h，培養(yǎng)10 12d。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法，其特征 是，步驟二中，所述培養(yǎng)為25土rC，每天光照16h，培養(yǎng)10 12d。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法，其特征是，步驟三中，所述培養(yǎng)為培養(yǎng)1 2代，每代12 14d，培養(yǎng)溫度為25±1 °C，每天光照16h。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法，其特征 是，步驟四中，所述培養(yǎng)為25士rC，每天光照16h，培養(yǎng)15 20d。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法，其特征 是，步驟五中，所述快速繁殖具體為通過切割增殖手段在快速繁殖培養(yǎng)基中進(jìn) 行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度均為25土rC，每天光照16h。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的利用長(zhǎng)春花下胚軸培育再生植株的方法，包括如下步驟取長(zhǎng)春花種子，置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出第一對(duì)子葉之時(shí)，取下胚軸，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得愈傷組織；將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得綠色愈傷組織；將綠色愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得不定芽；取不定芽，置入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得試管苗；取試管苗，利用快速繁殖培養(yǎng)基進(jìn)行快速繁殖，得再生植株。本發(fā)明的方法使得長(zhǎng)春花下胚軸的不定芽分化率達(dá)81％，不定芽生根率為100％。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101669446SQ20091019577
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者刑世海, 唐克軒, 潘琪芳, 荃 王, 王國(guó)豐, 芳 袁, 趙靜雅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)