專利名稱：三葉木通果種苗試管快速繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明涉及提高三葉木通果種苗快速繁殖技術領域的新方法，特別是涉及外植體 的處理方法。
背景技術：
三葉木通果[Akebia trifoliata(Thunb. )Koidz]是木通科木通屬的一種營養(yǎng)價 值較高的落葉或半落葉藤本野生水果，多分布在長江以南，在中國南部、長江流域和西北地 區(qū)均有分布與獼猴桃并稱野生水果大王，俗稱八月炸、八月瓜。長期以來，人們一直把木通 家族的根、莖、葉、種子視為中草藥，具有通筋活絡、解毒、生津止渴、消炎、除濕、瀉火以及通 乳等功效。其果實較大、果重150-250g，果腎型，果面紫紅色或明黃色，非常美觀。果肉乳白 透明，肉質細嫩，濃甜可口，香氣迷人，富含蛋白質、氨基酸、淀粉、可溶性糖及礦質元素均高 于蘋果、桔子、梨子等栽培品種的1 4倍，維生素Cd1A2^6等，與蘋果、桔子、梨子等含量 水平不相上下。其營養(yǎng)成分大體上與國內外專家高度重視的沙棘等野生水果相當，是頗受 人們喜愛的野生水果，是一種很有經濟價值的植物。三葉木通果實可鮮食或釀酒、制飲料。 此外，三葉木通種子中含有36. 84%的油脂，亞油酸含量高，富含有維生素，色清味香，是值 得開發(fā)的一種保健食用油脂。但野生果實皮厚，種子多，可食率較低，需要不斷改良才能栽 培利用。傳統(tǒng)的遺傳改良方法比較費時、費力，困難大，已經不能滿足三葉木通果產業(yè)發(fā)展 的需要。而運用植物細胞遺傳工程技術可極大縮短育種年限，加快育種進程，且更有目的地 獲得具有更理想性狀的新品種。三葉木通果優(yōu)良種苗的生產一般采用扦插法，但存在生根困難，成活率低，繁殖速 度慢等問題，利用細胞工程技術可以在短時間內大量繁殖優(yōu)良三葉木通果種苗，不僅可以 很好的解決三葉木通果種苗繁育的難題，而且也是利用細胞遺傳工程技術改良三葉木通果 性狀的前提和基礎。植物細胞在物理或化學方法的誘導下產生體細胞的變異，通過分化再 生得到變異改良的植株，其獲得的優(yōu)良植株的繁殖是新品種應用和推廣的基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的旨在提供一種為三葉木通果高效種苗繁殖技術體系的建立提供基 礎的，可提高三葉木通果種苗試管快速繁殖方法。本發(fā)明的目的是通過下述方式實現的1)將生長健壯的木質化程度較低的帶腋芽的三葉木通果莖段切割成1. 5cm左右 大小的莖段，消毒處理帶腋芽的莖段為外植體，接種于叢生芽誘導培養(yǎng)基誘導腋芽產生叢 生芽；2)將材料放置于25 士 2°C，黑暗培養(yǎng)；每隔25天左右更換一次新鮮誘導培養(yǎng)基；3)待叢生芽開始產生時放置在光照下培養(yǎng)，叢生芽長到3cm左右時及時將植株切 從基部切割，將植株轉移到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，25士2°C，光照培養(yǎng)至植株高7cm 左右；
4)將生根培養(yǎng)基上長7cm左右的三葉木通果苗從生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀將 試管苗切割成Icm左右的帶腋芽的莖段，將帶腋芽的莖段接種于生根培養(yǎng)基上進行生根培 養(yǎng)，25士2°C，光照培養(yǎng)至植株高7cm左右；5)將所得的植株再按照上述4中方法進行再次切割，帶腋芽莖段接種于生根培養(yǎng) 基上進行生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，25士2°C，照光，所得植株洗盡培養(yǎng)基后移栽至栽培 基質中進行生長即成。自從運用植物細胞工程技術對優(yōu)良植物種苗進行試管快繁以來，有關其植物種苗 試管快繁技術體系的建立、工廠化生產都有了十分廣泛的研究。但三葉木通果的試管快繁 技術，尤其是帶腋芽莖段直接生根成苗的快繁技術還未見報道。本發(fā)明具體實施過程為1.將生長健壯的木質化程度較低的帶腋芽的三葉木通果莖段切割成1. 5cm左右 大小的莖段，消毒處理為外植體，接種于叢芽誘導腋芽產生叢生芽，經75%酒精消毒30S 后，再用0. 升汞消毒8min，然后用無菌水沖洗4至5次，晾干后接種在叢生芽誘導培養(yǎng) 基上；誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基基礎上添加水解酪蛋白、椰子汁、TDZ，IBA和活性炭， 每隔25天更換一次新鮮誘導培養(yǎng)基；25士2°C黑暗培養(yǎng)。2.待叢生芽開始產生時放置在光照下培養(yǎng)，叢生芽長到3cm左右時及時將植株 從基部切割，將植株轉移到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，25士2°C光照培養(yǎng)至植株高7cm左 右，其生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了 IBA和活性炭。3.當三葉木通果苗長7cm左右時從生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀將試管苗切割成 Icm左右的帶腋芽的莖段，將帶腋芽的莖段接種于生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，25士2°C，光 照培養(yǎng)植株高7cm左右。其生根培養(yǎng)基又是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加IBA和活性 炭。4.所得的植株再按照3)的方法進行切割，帶腋芽莖段接種于生根培養(yǎng)基上進行 生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，25士2°C，照光；所得植株洗盡培養(yǎng)基后移栽至栽培基質中進 行生長。5.自接種后，每天觀察材料，每三天作一次紀錄，紀錄內容包括叢生芽萌動時間、 萌動數目數目、莖段萌芽時間、莖段發(fā)根時間、莖段萌芽率、莖段生根數、苗高5-7cm的時間 和質量；25士2°C，光照培養(yǎng)至苗高5-7cm，最后記錄每三角瓶中成苗數。叢生芽誘導率=(誘導叢生芽的外植體數/接種的外植體總數)X 100%莖段成苗率=(誘導莖段成苗的外植體數/接種的外植體總數)X 100%在上述過程中叢生芽誘導培養(yǎng)基中的TDZ濃度為0. 5-1. Omg/1，IBA濃度為Hmg/ 1 ；生根培養(yǎng)基中IBA濃度為2-6mg/l ；上述過程中的培養(yǎng)基用到的水解酪蛋白的濃度為300mg/l ；椰子汁的濃度為 IOOg/1 ；活性炭的濃度為0. 3g/l。
具體實施例方式提高三葉木通果種苗試管快速繁殖的新方法(1)從湖南張家界、湖南懷化、河南洛陽三地采集的三葉木通果優(yōu)良種苗種植在 溫室中，待三葉木通果苗長出30-40cm長的枝條時，挑選健壯的枝條，將帶腋芽的部分莖段切割下來后用自來水沖洗干凈。以帶腋芽的莖段為外植體，經75%酒精消毒30S后，再用 0. 1 %升汞消毒8min，然后用無菌水沖洗4至5次，晾干后用解剖刀進行切割，使帶腋芽部分 的長度大約為Icm左右，按照莖的自然生長方向分別插接在叢生芽誘導培養(yǎng)基上，每三角 瓶中接種5個外植體，每種外植體接種20瓶左右，25士2°C黑暗培養(yǎng)。叢生芽誘導培養(yǎng)基是 在MS基本培養(yǎng)基基礎上添加了 TDZ，IBA、水解酪蛋白、椰子汁，活性炭，每隔25天左右更換 一次新鮮培養(yǎng)基。(2)待叢生芽開始產生時放置在光照下培養(yǎng)，叢生芽長到3cm左右時及時將植株 切從基部切割，將植株轉移到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，每三角瓶中接種5個外植體。培 養(yǎng)過程的溫度都控制在25士2°C。(3)將生根培養(yǎng)基上長7cm左右的三葉木通果苗從生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀 將試管苗切割成Icm左右的帶腋芽的莖段，將帶腋芽的莖段接種于生根培養(yǎng)基上進行生根 培養(yǎng)，每三角瓶接種15個莖段左右。當植株高長到7cm左右，又從生根培養(yǎng)基中取出進行再 次切割，將帶腋芽莖段又接種于生根培養(yǎng)基上進行生根，這樣可多次重復，擴大繁殖系數。 25士2°C，照光培養(yǎng)。當植株數達到一定的基數后可將生根培養(yǎng)基上長根的試管苗植株洗盡 培養(yǎng)基后移栽至栽培基質中進行生長。(4)自接種后，每天觀察材料，每三天作一次紀錄，紀錄內容包括叢生芽萌動時間、 萌動數目數目、莖段萌芽時間、莖段發(fā)根時間、莖段萌芽率、莖段生根數、苗高5-7cm的時間 和質量；25士2°C，光照培養(yǎng)至苗高5-7cm，最后記錄每三角瓶中成苗數。叢生芽誘導率=(誘導叢生芽的外植體數/接種的外植體總數)X 100%莖段成苗率=(誘導莖段成苗的外植體數/接種的外植體總數)X 100%實驗結果表明從表1可以看出，三葉木通果帶腋芽莖段都能在叢生芽誘導培養(yǎng) 基上誘導出叢生芽，但誘導率在不同產地的材料中有差異，其中以河南洛陽三葉木通果的 誘導率最高，達到65. 38%,叢生芽誘導萌動時間為20-30天。利用試管苗切莖快速繁殖的 有生產價值，其帶腋芽莖段生根成苗70-90%，每植株平均生根數2-3之間(表2)。表1不同產地三葉木通果腋芽莖段叢生芽的誘導
品種處理方式接種數叢生芽誘導 數叢生芽誘導 率(％)叢生芽萌動時 間(天)湖南張家界 三葉木通帶腋芽莖段2107535. 7125湖南懷化三 葉木通帶腋芽莖段2306528. 2629河南洛陽三 葉木通帶腋芽莖段26017065. 3822表2三葉木通果試管苗帶腋芽莖段生根成苗的效果
權利要求
1.三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于A)將生長健壯的木質化程度較低的帶腋芽的三葉木通果莖段切割成1.5cm左右大 小的莖段，消毒處理帶腋芽的莖段為外植體，接種于叢生芽誘導培養(yǎng)基誘導腋芽產生叢生 芽；B)將材料放置于25士2°C，黑暗培養(yǎng)；每隔25天左右更換一次新鮮誘導培養(yǎng)基；C)待叢生芽開始產生時放置在光照下培養(yǎng)，叢生芽長到3cm左右時及時將植株切從基 部切割，將植株轉移到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，25士2°C，光照培養(yǎng)至植株高7cm左右；D)將生根培養(yǎng)基上長7cm左右的三葉木通果苗從生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀將試管 苗切割成Icm左右的帶腋芽的莖段，將帶腋芽的莖段接種于生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)， 25 士 2 °C，光照培養(yǎng)至植株高7cm左右；E)將所得的植株再按照上述4中方法進行再次切割，帶腋芽莖段接種于生根培養(yǎng)基上 進行生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，25士2°C，照光，所得植株洗盡培養(yǎng)基后移栽至栽培基質 中進行生長即成。
2.據權利要求1所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于所述方法A中 消毒處理是經75%酒精消毒30s后，再用0. 升汞消8min，然后用菌水沖洗4至5次，晾 干后接種在生芽誘導培養(yǎng)基上，所述方法A中叢生芽誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基基礎上 添加水解酷蛋白、椰子汁、TDZ、IBA和活性炭，每隔25天更換一次新鮮誘導培養(yǎng)基，25士2°C 黑暗培養(yǎng)，在其上述水解酷蛋白的濃度為300mg/l、椰子汁的濃度為100g/l、活性炭的濃度 為 0.3g/l。
3.據權利要求1所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于所述方法C中 生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加TBA和活性炭。
4.據權利要求1所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于所述方法D中 生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加IBA和活性炭。
5.據權利要求1(A中)或2所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于叢 生芽誘導培養(yǎng)基中的TDZ濃度為0. 5-1. Omg/1, IBA濃度為Hmg/l。
6.據權利要求IC中或3所述的三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，其特征在于生根培 養(yǎng)基中IBA濃度為2-6mg/l。
全文摘要
三葉木通果種苗試管快速繁殖方法，將三葉木通誘導產生叢生芽成培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，爾后在25±2℃光照培養(yǎng)植株高7cm左右，叢生根培養(yǎng)基中取出，用解剖刀將試管苗切割成1cm左右的帶腋芽的莖段生根培養(yǎng)，再光照植株高7cm左右，既再次光照移栽至栽培基質中進行生長。這種方法是用植物細胞遺傳工程技術可極大縮短育種年限，加快育種進程，且更有目的地獲得具有更理想性狀的新品種。
文檔編號A01H4/00GK102090327SQ20091022663
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權日2009年12月15日
發(fā)明者艾辛, 范立華 申請人:湖南農業(yè)大學