專利名稱：：團(tuán)頭魴與翹嘴紅鲌遠(yuǎn)緣雜交的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種魚類雜交方法，尤其涉及一種鯉科舶亞科魚類中的遠(yuǎn)緣雜交方法。
背景技術(shù)：
：雜交技術(shù)是改良魚類性狀常用的方法，親緣關(guān)系在種間或種間以上的雜交一般稱為遠(yuǎn)緣雜交。遠(yuǎn)緣雜交作為一種重要的魚類遺傳育種和性狀改良方法，它可以整合整套外源基因，從而改變雜交后代基因的表達(dá)調(diào)控，使得雜交后代可能在生長速度、抗逆性、抗病性以及肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢。如紅鯽與湘江野鯉的屬間遠(yuǎn)緣雜交形成的雜交后代具有生長速度快、肉質(zhì)鮮嫩、抗病力強(qiáng)、存活率高等優(yōu)點；紅鯽與團(tuán)頭魴的亞科間遠(yuǎn)緣雜交形成的雜交后代除具有鯽鯉雜交魚以上優(yōu)點外，體背還明顯增高，外形優(yōu)美，具有良好的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。如何利用和改進(jìn)現(xiàn)有的生物學(xué)技術(shù)和方法來對現(xiàn)有的自然魚種進(jìn)行遺傳改良以獲得形狀更為優(yōu)良、品種更加豐富和對遺傳研究更有意義的新型多倍體魚，就成為本領(lǐng)域技術(shù)人員長期面臨和需要解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種受精率高、孵化率高、后代性狀優(yōu)良、對遺傳育種具有重要意義的團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶遠(yuǎn)緣雜交的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶遠(yuǎn)緣雜交的方法，包括以下步驟首先挑選性腺成熟、無病無傷、體征良好的雌性團(tuán)頭魴(母本親魚)和雄性翹嘴紅舶(父本親魚)作為親魚進(jìn)行專池培育，然后在繁殖季節(jié)對所述親魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，選擇催產(chǎn)效果良好的親魚進(jìn)行人工干法授精，授精完成后的胚胎進(jìn)行培養(yǎng)皿靜水孵化，對孵化完成后的魚苗進(jìn)行飼養(yǎng)，再對飼養(yǎng)后的實驗魚進(jìn)行檢測、篩分，獲得團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶雜交三倍體魚和二倍體魚。上述團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶遠(yuǎn)緣雜交的方法，具體包括以下步驟1)親魚的選擇和培育在繁殖期前56個月，挑選體重lkg以上、性成熟特征明顯、體征良好的雌性團(tuán)頭魴和雄性翹嘴紅舶作為遠(yuǎn)緣雜交的親魚進(jìn)行專池培育，在繁殖期前一個月左右每隔23天流水剌激一次，以促進(jìn)所述親魚的性腺發(fā)育成熟；體征良好的親魚一般表現(xiàn)為體型好、體色鮮艷、體質(zhì)健壯、無病無傷；2)人工催產(chǎn)在所述繁殖期當(dāng)年的5月下旬至6月下旬，水溫穩(wěn)定在23°C25°C時，為所述親魚注射黃體素釋放激素類似物(LRH-A)與絨毛膜促性腺激素(HCG)的混合催產(chǎn)劑進(jìn)行催產(chǎn)，先注射母本親魚，所述LRH-A的用量為lOiig/kg，HCG的用量為600IU/kg;45h后再注射父本親魚，父本親魚的注射劑量減半；注射完畢后按1:(1.52.5)的數(shù)量比將母、父本親魚放入同一水面面積為80m2左右的產(chǎn)卵池中，然后根據(jù)水情及時向池中沖水，在產(chǎn)卵前34h注入一定水量后，停止注水，讓所述親魚在靜水中催產(chǎn)，直至其開始順利產(chǎn)卵和產(chǎn)精；注射時優(yōu)選采用胸鰭基部無鱗處腹腔一針注射法，以提高親魚的存活率；3)授精孵化挑選產(chǎn)卵量大、產(chǎn)卵質(zhì)量高的母本親魚和產(chǎn)精量大的父本親魚進(jìn)行人工干法授精，受精卵置于水溫為23°C24t:的培養(yǎng)皿中進(jìn)行靜水孵化；4)飼養(yǎng)魚苗全部孵出后，先于網(wǎng)箱中培育12天，待魚苗出現(xiàn)腰點、開始平游后將魚苗轉(zhuǎn)入預(yù)先培肥的池塘中飼養(yǎng)，34天后潑灑豆?jié){，每天潑灑23次，潑灑時力求細(xì)、勻，實驗魚長成后經(jīng)檢測、篩分獲得團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶雜交三倍體魚和二倍體魚。上述團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶遠(yuǎn)緣雜交的方法中，對所述長成后的實驗魚進(jìn)行檢測的具體方法是指利用流式細(xì)胞DNA含量測定法和外周血細(xì)胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法對實驗魚進(jìn)行DNA含量和染色體數(shù)目的檢測。本技術(shù)方案中用流式細(xì)胞DNA含量測定法和外周血細(xì)胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法來檢測實驗魚具有不殺死實驗魚、準(zhǔn)確、快速、試驗結(jié)果清晰的優(yōu)點。上述技術(shù)方案中的團(tuán)頭魴(Megalobramaamblyc印hala)屬于鯉科、舶亞科，魴屬中的二倍體魚(2n=48)，體高側(cè)扁，尾柄高而短，體型優(yōu)美，草食性，生長速度快，肉質(zhì)細(xì)嫩、腴美，脂肪豐富；翹嘴紅魚白(ErythroculterilishaeformisBleeker)隸屬于鯉科，舶亞科，舶屬中的二倍體魚(2n=48)，為大型淡水經(jīng)濟(jì)魚類，生長迅速，耐低氧，適應(yīng)性與抗病力極強(qiáng)，常年攝食(含嚴(yán)冬季節(jié))，肉質(zhì)潔白鮮嫩，營養(yǎng)價值高，深受人們的青睞。本發(fā)明通過反復(fù)實驗最終選擇團(tuán)頭魴為母本，翹嘴紅舶為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交獲得了具備多種雜交優(yōu)勢的新型三倍體、二倍體雜交魚類。相比同類雜交試驗，其受精率和孵化率得到了顯著提高。雜交后代整合了父母本體形優(yōu)美、生長迅速、肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)價值高等優(yōu)良性狀，并且成功地解決了遠(yuǎn)緣雜交后代不能存活或存活率較低的問題。此外，本發(fā)明方法獲得的新型多倍體雜交魚在魚類多倍體育種和生物進(jìn)化方面也具有重要意義。圖1為本發(fā)明實施例中團(tuán)頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)后代中二倍體魚的外形照片；圖2為本發(fā)明實施例中團(tuán)頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)后代中二倍體魚的染色體圖(2n=48);圖3為本發(fā)明實施例中團(tuán)頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)后代中三倍體魚的外形照片；圖4為本發(fā)明實施例中團(tuán)頭魴(早)X翹嘴紅舶(cP后代中三倍體魚的染色體圖(3n=72);圖5為本發(fā)明實施例中測定的團(tuán)頭魴的DNA含量圖；圖6為本發(fā)明實施例中測定的團(tuán)頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)后代中二倍體魚的DNA含量圖；圖7為本發(fā)明實施例中測定的團(tuán)頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)后代中三倍體魚的DNA含量圖。具體實施方式實施例在繁殖期前56個月，挑選體重lkg以上、性成熟特征明顯、體型好、體色鮮艷、體質(zhì)健壯、無病無傷的雌性團(tuán)頭魴和雄性翹嘴紅舶作為遠(yuǎn)緣雜交的親魚進(jìn)行專池培育，合理投喂飼料，特別是在繁殖期前一個月左右每隔23天流水剌激一次，以促進(jìn)親魚性腺良好發(fā)育。在繁殖期當(dāng)年的5月下旬至6月下旬，當(dāng)水溫穩(wěn)定在2325。C時，挑選體征良好、性腺發(fā)育良好的上述親魚注射LRH-A與HCG的混合催產(chǎn)劑進(jìn)行催產(chǎn)，先注射雌性團(tuán)頭魴，LRH-A的用量為10iig/kg，HCG的用量為600IU/kg;45h后再注射雄性翹嘴紅舶，劑量減半；注射完畢后立即按l:2左右的數(shù)量比將母、父本親魚放入同一水面面積為80rrf左右的產(chǎn)卵池中，以增加母、父本親魚的接觸機(jī)會，提高產(chǎn)卵率。然后據(jù)水情及時向池中沖水，尤其在產(chǎn)卵前34h，注入一定水量后，終止注水，讓魚在靜水中催產(chǎn)，直至其開始順利產(chǎn)卵和產(chǎn)精。同時，水面吊一紗窗網(wǎng)片，以檢測親魚的發(fā)情產(chǎn)卵情況。注射時采用胸鰭基部無鱗處腹腔一針注射法，以提高親魚的存活率。當(dāng)發(fā)現(xiàn)親魚在產(chǎn)卵池中呈"螺旋狀"追逐、紗窗網(wǎng)片上沾有適量卵粒后，開始拉網(wǎng)打撈親魚進(jìn)行檢測(注意要用軟質(zhì)網(wǎng)，操作要輕，水中檢測)，將催產(chǎn)效果良好的雌性團(tuán)頭魴與雄性翹嘴紅舶進(jìn)行人工干法授精，把精卵擠入干凈的瓷盆中，用干凈的羽毛迅速不停地攪拌23min，然后迅速用羽毛將受精卵均勻鋪于事先準(zhǔn)備好的裝有少量水的干凈培養(yǎng)皿中，密度控制在約8001000粒/培養(yǎng)皿，當(dāng)受精卵粘于培養(yǎng)皿上后用清水輕輕漂洗一遍，然后馬上放入室溫為23°C24°C的孵化房中加滿清水靜水孵化，孵化期間每天換水23次。魚苗全部孵出后，先于網(wǎng)箱中培育12天，待魚苗出現(xiàn)腰點、開始平游后將魚苗轉(zhuǎn)入預(yù)先培肥的池塘中飼養(yǎng)，34天后潑灑豆?jié){，每天潑灑23次，力求細(xì)、勻，直至魚苗長到能正常攝食。孵化期間，統(tǒng)計胚胎的受精率和孵化率。團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶遠(yuǎn)緣雜交魚的受精率和孵化率分別為78%和62%，相比同類雜交試驗，其受精率和孵化率得到了顯著地提高。魚苗飼養(yǎng)34個月后，隨即抽樣、測量分析其生物學(xué)形狀相關(guān)數(shù)據(jù)，并分別與團(tuán)頭魴和翹嘴紅舶成體魚的各項已知數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示表1:團(tuán)頭魴、翹嘴紅舶及其雜交后代的可數(shù)性狀比較(單位片或條)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注上表中大寫的羅馬數(shù)字代表硬棘條的數(shù)目，阿拉伯?dāng)?shù)字代表鰭條的數(shù)目。上述可數(shù)性狀相關(guān)數(shù)據(jù)表明兩種雜交后代魚在外型上均基本整合了其父、母本(團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶)的特征，如二倍體魴舶與三倍體魴舶的側(cè)線鱗數(shù)分別為6468、5661，介于團(tuán)頭魴的4952和翹嘴紅舶的8092之間；有的則偏父本遺傳，如側(cè)線上鱗片數(shù)分別為1315、1415，均超過了其母本9IO的范圍，而靠近父本的1620。另外，這兩種雜交后代魚的外形照片如圖l(二倍體)和圖3(三倍體)所示，從外形上比較可以發(fā)現(xiàn)，兩種雜交后代魚的頭部均與團(tuán)頭魴相似，而二倍體魴舶的體高、尾鰭偏像于翹嘴紅舶，三倍體魴舶的體高、尾鰭則偏像于團(tuán)頭魴，體形優(yōu)美，肉質(zhì)鮮嫩。這些均說明三倍體魴舶和二倍體魴舶是團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶的雜交后代。再用外周血細(xì)胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法對三倍體和二倍體雜交魚的體細(xì)胞染色體數(shù)目進(jìn)行抽樣檢測，發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶雜交后代中體背較矮者為二倍體(2n=48)，體背較高者為三倍體(3n=72)，二者的染色體圖分別如圖2和圖4所示。同時，以普通團(tuán)頭魴為參照，用流式細(xì)胞儀測定二倍體魴舶和三倍體魴舶紅細(xì)胞中的DNA含量，結(jié)果分別如圖5、6、7所示。分析圖中數(shù)據(jù)可知，團(tuán)頭魴、二倍體魴舶和三倍體魴舶的DNA平均含量分別為74.55、72.76和107.78，二倍體魴舶與對照團(tuán)頭魴的DNA平均含量比值為0.976，該比值與預(yù)計的1:l理論比值間無顯著差異；三倍體魴舶與對照團(tuán)頭魴的DNA平均含量比值為1.446，該比值與預(yù)計的1.5:1理論比值間無顯著差異。這些試驗結(jié)果與外周血細(xì)胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法獲得的結(jié)果是一致的。上述實施例中外周血細(xì)胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法操作步驟為1)在超凈工作臺中配制培養(yǎng)基，100ml培養(yǎng)基含以下成分84mlRPMH640(1640培養(yǎng)液)，15ml小牛血清，2支植物血凝素(PHA)，lml0.1%肝素鈉，以7.5%NaHC03(無菌)或1NHC1調(diào)pH至7.27.4;2)用注射器吸取少量滅菌肝素鈉溶液，于用碘酒消毒后的實驗魚尾部靜脈取血；3)按每10ml培養(yǎng)液中加入約0.2ml抗凝血的標(biāo)準(zhǔn)將抗凝血加入培養(yǎng)液中，于24°C5%的二氧化碳濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6872h，培養(yǎng)期間，定期輕搖勻，以使細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基；4)終止培養(yǎng)前24h，在培養(yǎng)液中用lml注射器滴加入10yg/ml的秋水仙堿，使終濃度為0.050.07iig/ml。以上步驟均需無菌操作。上述實施例中染色體制備步驟為1)將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入潔凈的10ml離心管中，以1000rpm離心5min，棄上清液；2)向離心管中加入低滲液9ml，混勻，低滲2530min;3)加入lml固定液，輕輕混勻后1000rpm離心5min，棄上清液；4)加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20min后1000rpm離心5min，棄上清液；5)重復(fù)步驟4一次；6)視最后細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞懸液(一般為12ml)后，吸取細(xì)胞懸液自2030cm高處滴片，輕吹散，空氣中自然干燥；7)Giemsa染液染色2040min，細(xì)水流沖洗載玻片背面去除染液，氣干后鏡檢、拍照。上述實施例中流式細(xì)胞DNA含量測定法步驟為用經(jīng)肝素潤濕的一次性注射器從魚尾靜脈血管采血約0.2mL，注入裝有0.8%生理鹽水的E卯endorf管中，在血液和生理鹽水混合液中力口入lmL細(xì)胞核提取液DAPI-A(nucleiextractionsolution,德國PartecGmbh提供)，處理時間1015min;樣品經(jīng)過20ym尼龍濾器(德國PartecGmbH提供)過濾；DNA染色液(DAPI-B，德國PartecGmbH提供)靜置于暗處染色樣品約510min，然后上機(jī)檢測。本實施例方法獲得的三倍體、二倍體雜交魚，不僅整合了父母本親魚的多項優(yōu)良性狀，還顯著提高了遠(yuǎn)緣雜交的受精率和孵化率，在生物進(jìn)化研究和魚類遺傳育種方面具有重要的生物學(xué)意義。權(quán)利要求一種團(tuán)頭魴與翹嘴紅鲌遠(yuǎn)緣雜交的方法，包括以下步驟首先挑選性腺成熟、無病無傷、體征良好的雌性團(tuán)頭魴和雄性翹嘴紅鲌作為親魚進(jìn)行專池培育，然后在繁殖季節(jié)對所述親魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，選擇催產(chǎn)效果良好的親魚進(jìn)行人工干法授精，授精完成后的胚胎進(jìn)行培養(yǎng)皿靜水孵化，對孵化完成后的魚苗進(jìn)行飼養(yǎng)，再對飼養(yǎng)后的實驗魚進(jìn)行檢測、篩分，獲得團(tuán)頭魴與翹嘴紅鲌雜交三倍體魚和二倍體魚。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶遠(yuǎn)緣雜交的方法，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟1)親魚的選擇和培育在繁殖期前56個月，挑選體重lkg以上、性成熟特征明顯、體征良好的雌性團(tuán)頭魴和雄性翹嘴紅舶作為遠(yuǎn)緣雜交的親魚進(jìn)行專池培育，在繁殖期前一個月每隔23天流水剌激一次，以促進(jìn)所述親魚的性腺發(fā)育成熟；2)人工催產(chǎn)在所述繁殖期當(dāng)年的5月下旬至6月下旬，水溫穩(wěn)定在23°C25t:時，為所述親魚注射黃體素釋放激素類似物與絨毛膜促性腺激素的混合催產(chǎn)劑進(jìn)行催產(chǎn)，先注射母本親魚，所述黃體素釋放激素類似物的用量為10i!g/kg，絨毛膜促性腺激素的用量為600IU/kg;45h后再注射父本親魚，父本親魚的注射劑量減半；注射完畢后按l:(1.52.5)的數(shù)量比將母、父本親魚放入同一水面面積為80m2的產(chǎn)卵池中，然后根據(jù)水情及時向池中沖水，在產(chǎn)卵前34h注入水量后，停止注水，讓所述親魚在靜水中催產(chǎn)，直至其開始順利產(chǎn)卵和產(chǎn)精；3)授精孵化挑選產(chǎn)卵量大、產(chǎn)卵質(zhì)量高的母本親魚和產(chǎn)精量大的父本親魚進(jìn)行人工干法授精，受精卵置于水溫為23°C24t:的培養(yǎng)皿中進(jìn)行靜水孵化；4)飼養(yǎng)魚苗全部孵出后，先于網(wǎng)箱中培育12天，待魚苗出現(xiàn)腰點、開始平游后將魚苗轉(zhuǎn)入預(yù)先培肥的池塘中飼養(yǎng)，34天后潑灑豆?jié){，每天潑灑23次，實驗魚長成后經(jīng)檢測、篩分獲得團(tuán)頭魴與翹嘴紅鉑雜交三倍體魚和二倍體魚。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的團(tuán)頭魴與翹嘴紅舶遠(yuǎn)緣雜交的方法，其特征在于對所述長成后的實驗魚進(jìn)行檢測的具體方法是指利用流式細(xì)胞DNA含量測定法和外周血細(xì)胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法對實驗魚進(jìn)行DNA含量和染色體數(shù)目的檢測。全文摘要本發(fā)明公開了一種團(tuán)頭魴與翹嘴紅鲌遠(yuǎn)緣雜交方法，包括以下步驟首先挑選性腺成熟、無病無傷、體征良好的雌性團(tuán)頭魴和雄性翹嘴紅鲌作為親魚進(jìn)行專池培育，然后在繁殖季節(jié)對親魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，選擇催產(chǎn)效果好的親魚進(jìn)行人工干法授精，授精完成后的胚胎進(jìn)行培養(yǎng)皿靜水孵化，對孵化完成后的魚苗進(jìn)行飼養(yǎng)，再用流式細(xì)胞DNA含量測定法和外周血細(xì)胞培養(yǎng)的染色體倍性檢測方法對飼養(yǎng)后的實驗魚進(jìn)行檢測，獲得團(tuán)頭魴與翹嘴紅鲌雜交形成的三倍體魚和二倍體魚。本發(fā)明的遠(yuǎn)緣雜交方法不僅獲得了性狀改善的二倍體和三倍體魚，而且顯著提高了遠(yuǎn)緣后代的受精率和孵化率，開辟了一種生產(chǎn)改良二倍體和三倍體魚的新途徑，在魚類遺傳育種方面具有重要生物學(xué)意義。文檔編號A01K61/00GK101720698SQ20091022715公開日2010年6月9日申請日期2009年12月9日優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日發(fā)明者何偉國,劉少軍,劉筠,張純,羅凱坤,肖軍,趙如榕,陶敏申請人:湖南師范大學(xué)