翹嘴紅鲌精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)中魚類細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，是在體外人工培養(yǎng)條件下，以翹嘴紅舶精巢組織為材料的一種精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]翹嘴紅舶作為養(yǎng)殖類魚種，是長江中下游流域重要的養(yǎng)殖品種，其人工繁育、養(yǎng)殖技術(shù)都已經(jīng)很成熟，但對其生殖發(fā)育的研宄較少。目前天然水域的翹嘴紅舶產(chǎn)量已很低，野生資源日益減少，因而開展翹嘴紅舶的生物學(xué)特性、人工繁殖、養(yǎng)殖技術(shù)等方面的研宄，對于品種的開發(fā)利用，保護(hù)天然翹嘴紅舶的野生資源等都有重要的意義。弄清楚其生殖發(fā)育規(guī)律，不但可豐富魚類發(fā)育學(xué)基礎(chǔ)理論，還可直接與生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合，如建立新型繁育模式、找出控制性別的有效方法等，提高經(jīng)濟(jì)效益。
[0003]生殖細(xì)胞來源于生殖干細(xì)胞的分化發(fā)育。精巢中精原干細(xì)胞(spermatogonialstem cells，SSCs)屬于成體生殖干細(xì)胞，既可自我更新，又可以分化形成各階段的生殖細(xì)胞直至成熟配子，在成體動物一生中都具有增殖分化的能力，因而其來源豐富，獲取方便，生產(chǎn)周期短，在生殖細(xì)胞研宄方面越來越引起關(guān)注。
[0004]Risley (J Exp Zool, 1979, 207 (I)) >Panda (Ther1genology, 2011, 76 (2))等米用膠原酶消化法分別成功從幼年非洲蛙魚、南亞野鯪精巢組織分離得到了其SSCs。另外也有研宄人員采用組織塊培養(yǎng)法從饅魚(Miura，Development, 2002，129 (11))、斑馬魚(Leal，Belo Horizonte, MG, Brazil.2006, 3:181.)精巢中成功分離得到SSCs，但該方法分離到的SSCs細(xì)胞較少，且雜細(xì)胞較多，不利于后期的純化。但未發(fā)現(xiàn)翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的發(fā)明專利申請。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是建立一種翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。特別是通過選取適當(dāng)發(fā)育階段的精巢組織、采用兩步酶消化法、加入適當(dāng)細(xì)胞因子的培養(yǎng)基等，使得翹嘴紅舶精原干細(xì)胞原代細(xì)胞體外生長更容易增殖，為翹嘴紅舶生殖發(fā)育研宄提供有效的細(xì)胞平臺。
[0006]本發(fā)明解決所述技術(shù)問題的方案為:一種翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟，
[0007](I)精巢組織的收集:無菌條件下收集7月齡翹嘴紅舶精巢，用含有雙抗的PBS中漂洗，剝離附屬組織；然后碾壓剩余的精巢組織使精巢組織分散；
[0008](2)精原干細(xì)胞的消化、分離:向分散的精巢組織中添加0.1% IV型膠原酶，25°C?30°C消化Ih?2h之后，收集消化液；消化液離心分離后棄上清，得到沉淀；沉淀用5?15倍體積的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，200目濾網(wǎng)過濾；濾液用含有10%FBS的培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化作用；之后濾液離心分離，棄上清，收集沉淀后的細(xì)胞；
[0009](3)精原干細(xì)胞的原代培養(yǎng):用DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸步驟(2)所得的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 16個/mL?5X 10 6個/mL，按照ImL/孔的量鋪于明膠包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，26°C培養(yǎng)，2h后加新鮮培養(yǎng)基lmL，以后每2.5d換液一次，3?4d可見呈葡萄串狀的精原干細(xì)胞。
[0010]作為改進(jìn)，所述步驟⑴在碾壓剩余的精巢組織前，先將精巢組織剪成體積為Imm3的小塊。
[0011]步驟(2)中，存在未能通過200目濾網(wǎng)的剩余組織塊，為充分消化組織塊，作為改進(jìn)，所述步驟(2)中經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，剩余組織塊再次經(jīng)5?15倍體積的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，過200目濾網(wǎng)之后，濾液再用含有10% FBS的培養(yǎng)基終止消化酶作用，之后濾液離心分離后棄上清，收集細(xì)胞，兩次收集到的細(xì)胞合并后進(jìn)行步驟(3)。
[0012]作為改進(jìn)，所述步驟(2)中離心分離的條件是在800rpm的速度下離心3min。
[0013]作為改進(jìn)，所述步驟(3)中的DMEM/F12完全培養(yǎng)基包含:10% FBS, 100 μ g/mL青霉素、鏈霉素，10 μ g/mL bFGF, LIF，15 μ g/mL HEPESo
[0014]本發(fā)明的有益效果是:建立了一種翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，取材方便、無需特定的細(xì)胞分離液、兩步酶法分離、培養(yǎng)條件有利于保持精原干細(xì)胞的特性、且精原干細(xì)胞可在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下進(jìn)行體外增殖，可用于后續(xù)生殖發(fā)育研宄。采用本發(fā)明所得到的主要是支持細(xì)胞和精原干細(xì)胞，雜細(xì)胞較少，支持細(xì)胞和精原干細(xì)胞兩者比例適當(dāng)，其中適量生長的支持細(xì)胞可為精原干細(xì)胞的生長提供必要的生長因子，有利于精原干細(xì)胞后期的增殖。本發(fā)明可推廣應(yīng)用于其他水產(chǎn)類生殖干細(xì)胞原代培養(yǎng)。
【附圖說明】
[0015]圖1為翹嘴紅舶各生長階段精巢組織切片(X400)，從左往右依次為4月齡、7月齡、10月齡的精巢組織切片。圖中可以看到:4月齡精巢太小，取材不方便；7月齡取材較容易，為分化生殖細(xì)胞比例相對較后期高；10月齡的精巢組織的生殖細(xì)胞分化程度較高，干細(xì)胞比例相對較低。
[0016]圖2為翹嘴紅舶SSCs培養(yǎng)(X 200)。A為培養(yǎng)24h的精原干細(xì)胞；B為培養(yǎng)3d的精原干細(xì)胞。箭頭所指為精原干細(xì)胞，梭形細(xì)胞為支持細(xì)胞。
[0017]圖3為翹嘴紅舶SSCs培養(yǎng)4d后AKP染色結(jié)果(A: X200，B: X400)。箭頭所指的為精原干細(xì)胞。
[0018]圖4為精原干細(xì)胞表面分子標(biāo)記Oct-4的檢測結(jié)果。M:DL 2000 DNA marker, 1-4:分別為培養(yǎng)2d、4d、6d、8d細(xì)胞的Oct-4基因RT-PCR電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1
[0020]本發(fā)明是一種翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟:
[0021](I)精巢組織的收集:無菌條件下收集8?10條7月齡翹嘴紅舶精巢，用含有雙抗的PBS中漂洗3遍，剝離脂肪、白膜等附屬組織；然后將剩余的精巢組織剪成Imm3的小塊，接著用2mL —次性注射器尾部進(jìn)行碾壓，使精巢組織盡量分散。
[0022](2)精原干細(xì)胞的消化、分離:向分散的精巢組織中添加0.1% IV型膠原酶，25°C?30°C消化Ih?2h之后，收集消化液；消化液離心分離后棄上清，得到沉淀；沉淀用5?15倍體積的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，200目濾網(wǎng)過濾；濾液用含有10%FBS的培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化作用；之后濾液離心分離，棄上清，收集沉淀后的細(xì)胞。
[0023]未能通過200目濾網(wǎng)的剩余組織塊，繼續(xù)經(jīng)5?15倍體積的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，過200目濾網(wǎng)之后，濾液再用含有10% FBS的培養(yǎng)基終止消化酶作用，之后濾液離心分離后棄上清，收集細(xì)胞，兩次收集到的細(xì)胞合并后進(jìn)行步驟(3)。
[0024]“沉淀用5?15倍體積的0.25%胰蛋白酶消化”是指:0.25%胰蛋白酶的體積是沉淀體積的5?15倍。“剩余組織塊繼續(xù)經(jīng)5?15倍體積的0.25%胰蛋白酶消化”是指:
0.25%胰蛋白酶的體積是剩余組織塊體積的5?15倍。
[0025]另外，0.25%胰蛋白酶中0.25%為質(zhì)量濃度，0.1% IV型膠原酶中0.1 %為質(zhì)量濃度，10% FBS中10%為體積濃度。
[0026](3)精原干細(xì)胞的原代培養(yǎng):用DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含10% FBS, 100 μ g/mL青霉素、鏈霉素，10 μ g/mL bFGF, LIF, 15 μ g/mL HEPES)重懸步驟⑵所得的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 16個/mL?5X 10 6個/mL，按照ImL/孔的量鋪于明膠包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，26°C培養(yǎng)，2h后加新鮮培養(yǎng)基lmL，以后每2.5d換液一次，3?4d可見呈葡萄串狀的精原干細(xì)胞。
[0027]細(xì)胞觀察鑒定:在100X和200X相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，其中精原干細(xì)胞較大、呈圓形、葡萄串狀，支持細(xì)胞呈纖維狀，較小的圓形細(xì)胞為處于不同分化階段的生殖前體細(xì)胞。觀察后采用生殖干細(xì)胞的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，包括堿性磷酸酶(AKP)活性鑒定、干細(xì)胞表面標(biāo)記物Oct-4的檢測等。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:包括以下步驟， (1)精巢組織的收集:無菌條件下收集7月齡翹嘴紅舶精巢，用含有雙抗的PBS中漂洗，剝離附屬組織；然后碾壓剩余的精巢組織使精巢組織分散； (2)精原干細(xì)胞的消化、分離:向分散的精巢組織中添加0.1%IV型膠原酶，25°C?.30°C消化Ih?2h之后，收集消化液；消化液離心分離后棄上清，得到沉淀；沉淀用5?15倍體積的0.25%胰蛋白酶消化1min?20min，200目濾網(wǎng)過濾；濾液用含有10% FBS的培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化作用；之后濾液離心分離，棄上清，收集沉淀后的細(xì)胞； (3)精原干細(xì)胞的原代培養(yǎng):用DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸步驟(2)所得的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 16個/mL?5X 10 6個/mL,按照ImL/孔的量鋪于明膠包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，26°C培養(yǎng)，2h后加新鮮培養(yǎng)基lmL，以后每2.5d換液一次，3?4d可見呈葡萄串狀的精原干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(I)在碾壓剩余的精巢組織前，先將精巢組織剪成體積為Imm3的小塊。
3.如權(quán)利要求1所述的翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(2)中經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，剩余組織塊再次經(jīng)5?15倍體積的0.25%胰蛋白酶消化1min?.20min，過200目濾網(wǎng)之后，濾液再用含有10% FBS的培養(yǎng)基終止消化酶作用，之后濾液離心分離后棄上清，收集細(xì)胞，兩次收集到的細(xì)胞合并后進(jìn)行步驟(3)。
4.如權(quán)利要求1所述的翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(2)中離心分離的條件是在800rpm的速度下離心3min。
5.如權(quán)利要求1所述的翹嘴紅舶精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(3)中的DMEM/F12完全培養(yǎng)基包含:10%?85，10(^8/1^青霉素、鏈霉素，1(^8/1^ bFGF、LIF，.15 μ g/mL HEPESo
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種翹嘴紅鲌精原干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟，(1)精巢組織的收集：無菌條件下收集7月齡翹嘴紅鲌精巢，用含有雙抗的PBS中漂洗后碾壓使精巢組織分散；(2)精原干細(xì)胞的消化、分離：向分散的精巢組織中添加0.1％IV型膠原酶，消化液離心得到沉淀；沉淀用0.25％胰蛋白酶消化；用含有10％FBS的培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞；(3)精原干細(xì)胞的原代培養(yǎng)：用含細(xì)胞因子的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸步驟(2)所得的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后鋪于明膠包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，26℃培養(yǎng)。本發(fā)明使得翹嘴紅鲌精原干細(xì)胞原代細(xì)胞體外生長更容易增殖，為翹嘴紅鲌生殖發(fā)育研究提供有效的細(xì)胞平臺。
【IPC分類】C12N5-076
【公開號】CN104830756
【申請?zhí)枴緾N201510228179
【發(fā)明人】劉莉, 曹訪, 采克俊
【申請人】湖州師范學(xué)院
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月7日