專利名稱：Tt1基因在提高植物產(chǎn)量中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TTl基因在提高植物產(chǎn)量中的用途。
背景技術(shù)：
預(yù)計(jì)本世紀(jì)30年代，我國(guó)人口將增加到16億，需要糧食6. 5億噸左右，人均耕地 將減少到1畝左右，面對(duì)人口逐年增加、耕地面積逐年減少，糧食自給成為人類的緊迫問 題。解決這一問題行之有效的手段就是通過農(nóng)作物品種改良提高糧食單產(chǎn)。水稻是人類賴以生存的最重要的糧食作物，今天，全球50%以上的人口靠水稻果 腹。但在水稻生產(chǎn)中，由于病蟲草的危害和不良?xì)夂蚺c環(huán)境的影響，嚴(yán)重制約了水稻的高 產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)產(chǎn)，從而直接威脅到人類的生存與發(fā)展；同時(shí)隨著發(fā)展中國(guó)家城市化和農(nóng)用土 地的退化，耕作用地面積將會(huì)持續(xù)減少，僅依靠現(xiàn)有常規(guī)雜交選育法提高產(chǎn)量的困難越來 越大?；贒NA水平的植物基因工程研究為21世紀(jì)新的“綠色革命”提供了新的技術(shù)平臺(tái)。 利用基因工程技術(shù)，大規(guī)模發(fā)掘可用基因，不但可以大幅度提高農(nóng)作物生產(chǎn)率，而且還能選 育出抗干早、耐鹽堿、抗病蟲和其他性狀優(yōu)良的農(nóng)作物，從而解決人類、資源和環(huán)境之間日 益尖銳的矛盾，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。隨著水稻基因組學(xué)和分子遺傳學(xué)研究的快速發(fā)展，尋找水稻增產(chǎn)基因已取得大的 發(fā)展。分蘗是影響水稻產(chǎn)量的一種重要農(nóng)藝性狀，水稻形成的分蘗數(shù)是決定穗數(shù)的前提，而 穗數(shù)又是構(gòu)成產(chǎn)量的重要基礎(chǔ)。影響水稻分蘗發(fā)生的栽培條件和生理機(jī)制已有廣泛深入的 研究，但關(guān)于水稻如何控制分蘗發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制，目前尚不清楚。水稻的分蘗按結(jié)實(shí)多少 可分為有效分蘗和無效分蘗。在生產(chǎn)上也不是分蘗越多越好，據(jù)有關(guān)研究資料表明，一棵直 播的水稻可分蘗120 130個(gè)，但如果不能完全結(jié)實(shí)則成無效分蘗，為了爭(zhēng)取更多的有效分 蘗必須爭(zhēng)取多的有效分蘗。至今尚鮮有報(bào)道發(fā)現(xiàn)有效分蘗數(shù)增多而株高不受影響或者降低 的水稻突變體。在申請(qǐng)人之前遞交的中國(guó)專利申請(qǐng)200810045667.8中記載了分離自油菜 的新基因，命名為TT1。將該基因轉(zhuǎn)入水稻中，可提高水稻有效分蘗數(shù)、千粒重以提高產(chǎn)量， 同時(shí)降低株高以抗倒伏。油菜是我國(guó)播種面積最大、地區(qū)分布最廣的油料作物。在幾種主要油料作物中，油 菜具有以下幾個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)①品種類型多，適應(yīng)范圍廣，對(duì)自然條件要求不嚴(yán)?？偟恼f來， 油菜是喜涼作物，對(duì)熱量要求不高，對(duì)土壤的要求也不嚴(yán)，酸、堿、中性土壤均能種植。因此 油菜具有地區(qū)上廣泛分布的可能性。②它是油、肥兼收，用地、養(yǎng)地結(jié)合的作物。③油菜可以 利用冬閑地種植，不與糧棉爭(zhēng)地。在糧棉生產(chǎn)任務(wù)重而人多地少、耕地安排較緊張的地區(qū)， 擴(kuò)大油菜種植較其他作物更為容易。新中國(guó)50年來，油菜作為最主要的油料和經(jīng)濟(jì)作物發(fā)展穩(wěn)中有升，新品種推廣實(shí) 現(xiàn)了三次革命。進(jìn)入90年代，無論是種植面積、單產(chǎn)水平和總產(chǎn)量均繼續(xù)保持快速增長(zhǎng)的 勢(shì)頭，但由于傳統(tǒng)育種方式過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，造成近幾年油菜產(chǎn)量增加達(dá)到瓶頸期。通過 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，全國(guó)20多個(gè)科研單位近二十年的協(xié)作科技攻關(guān)以及中國(guó) 一加拿大或澳大利亞、美國(guó)等重大國(guó)際合作研究，致力于研發(fā)出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、性狀優(yōu)良的優(yōu)
3質(zhì)新品種。可見利用基因工程方法獲得的油菜轉(zhuǎn)基因植株，使其成為生產(chǎn)上可以應(yīng)用的新 品種就成為當(dāng)今繼續(xù)提高油菜產(chǎn)量的新途徑。多年生黑麥草原產(chǎn)西南歐、北非和西南亞的溫帶。目前世界各國(guó)均有栽培。在我 國(guó)主要分布于華東、華中和西南等地，以長(zhǎng)江流域的高山地區(qū)生長(zhǎng)最好。多年生黑麥草質(zhì)優(yōu) 良，葉量豐富，莖葉柔嫩，適口性好，是馬、牛、羊、兔草食家畜的優(yōu)質(zhì)牧草；也是養(yǎng)魚的好飼 料?？汕囡?、青貯或調(diào)制干草，也適于放牧利用。多年生黑麥草是一草多用的優(yōu)良牧草。由 于其根系發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)迅速，耕地種植可增加種植地的土壤有機(jī)質(zhì)，改善種植地土壤的物理結(jié) 構(gòu)；坡地種植，可護(hù)坡固土，防止土壤侵蝕，減少水土流失。因而選擇高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆牧草品 種就顯得十分重要。本領(lǐng)域需要開發(fā)出能夠提高作物產(chǎn)量的備選基因，以運(yùn)用基因工程技術(shù)提高作物產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高植物產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種新的有 效選擇。本發(fā)明解決該技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了 TTl基因在提高植物產(chǎn)量中的用途。其中，上述TTl基因的核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。也能提高植物產(chǎn)量性。本發(fā)明同時(shí)提供了 TTl基因編碼的多肽在提高植物產(chǎn)量中的用途。上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。本發(fā)明還提供了一種培育產(chǎn)量植物的方法。該方法包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成所述TTl基因的重組 載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因產(chǎn)量植株及其后代，所述 后代包括植物種子及植物組織。其中，上述植物可為一般的各種農(nóng)作物，如常見禾本科或十字花科植物。其中的禾 本科植物如小麥、水稻等農(nóng)作物和黑麥草等牧草物，十字花科植物如油菜、甘藍(lán)等作物。本發(fā)明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，該 基因來源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因?yàn)檎T餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方法，篩選到油菜中 的一個(gè)EST序列，再根據(jù)這段篩選到的序列，通過5’RACE的方法獲得序列表中SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。然后根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，從油菜cDNA中擴(kuò)增SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。在本發(fā)明中，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個(gè)核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO. 1所編碼的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指所述序列中有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同 氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO. 1同 源性低至約89%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO. 1 中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生序列”的含義還包括能在中度 嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO. 1核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該 術(shù)語還包括與SEQ IDN0. 1中的核苷酸序列的同源性至少80 %，較佳地至少89 %，更佳地至 少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。在本發(fā)明中的相同功能是指提高植物的產(chǎn)量。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的SEQ ID NO. 1相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1 90個(gè)，較佳地1 60個(gè)，更佳地1 20個(gè)，最佳地1 10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為 10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其編碼的 多肽也能提高植物的產(chǎn)量。本發(fā)明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領(lǐng)域 已知的各種載體，尤其是真核表達(dá)載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發(fā)明用上述重組載 體轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞，篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)量植株及其 后代，所述后代包括植物種子及植物組織。本發(fā)明中所述的“可操作地連于”表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠 影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽 的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動(dòng)子控制序 列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位 置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前 導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TTl基因在提高植物產(chǎn)量方面的用途，在 本發(fā)明的實(shí)施例中也通過實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)入了 TTl基因并過表達(dá)的植物較野生型的各項(xiàng)產(chǎn)量 相關(guān)指標(biāo)，如種子數(shù)，有了顯著的提高。本發(fā)明培育出高產(chǎn)量植物的方法也簡(jiǎn)便而有效，為 提高植物產(chǎn)量提供了新的有效選擇，具有好的應(yīng)用前景。


圖1、轉(zhuǎn)基因水稻植株中潮霉素hpt基因的PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。從左至右依次為分 子量 Maker (Μ,片段從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，陽性對(duì) 照(+)，野生型陰性對(duì)照(_)，待檢測(cè)植株1 6號(hào)。圖2、轉(zhuǎn)基因水稻植株中TTl基因的PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。從左至右依次為分子 量 Maker (Μ,片段從上到下依次為 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，陽性對(duì)照 (+)，野生型陰性對(duì)照(_)，待檢測(cè)植株1 5號(hào))。圖3、轉(zhuǎn)基因水稻植株中TTl基因的RT-PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。從左至右依次為分子量 Maker (M，片段大小依次為 2000bp ； 1000 ；750bp ；500bp ；250bp ； 100bp)，l 號(hào)為野生型陰
性對(duì)照，2 5號(hào)為待檢測(cè)植株。圖4、水稻的外觀直接比較。1 3為轉(zhuǎn)基因陰性植株；4 6為轉(zhuǎn)基因陽性植株。圖5、TTl基因過量表達(dá)甘藍(lán)型油菜的PCR檢測(cè)結(jié)果。從左至右依次為分子量 Marker (M，片段大小依次為 2000bp ； 1000 ；750bp ；500bp ；250bp ； IOObp)，1 4 為 TTl 基因
過量表達(dá)甘藍(lán)型油菜。圖6、轉(zhuǎn)基因黑麥草植株中TTl基因的PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。從左至右依次為分子 量 Maker (Μ,片段從上到下依次為 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，陽性對(duì)照 ⑴，野生型陰性對(duì)照㈠，空白對(duì)照(0)，待檢測(cè)植株1 6號(hào))。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例并結(jié)合附圖，進(jìn)一步說明而不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的 常規(guī)條件，例如Sambrook，Russell的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實(shí)施 例中，所用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大 腸桿菌(E. coli)采用Dffia菌株，菌株均購自于Qiagen公司。載體pBI 121購自于Clontech 公司。其余化學(xué)實(shí)際均為市售分析純。下述實(shí)施例中，“SEQ ID N0:1”單獨(dú)出現(xiàn)時(shí)，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可理解1其為“SEQ ID NO 1所示核苷酸序列”的簡(jiǎn)稱。實(shí)施例一使用TTl基因增加水稻產(chǎn)量一、TTl基因的克隆及獲取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因?yàn)檎T餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方 法(見Clontech公司所公開的資料)，篩選到油菜中的一個(gè)EST序列(SEQ ID N0:2所示)， 再根據(jù)這段篩選到的序列，通過5’RACE (見Takara公司所公開的資料)的方法獲得本發(fā)明 所述提高植物經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，上游引物(SEQID N0. 3) :5，-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID N0. 4) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。然后經(jīng)PCR從油菜cDNA中擴(kuò)增SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。PCR程序如下195 0C4min (預(yù)變性)
295 0C30s(變性)
353 0C30s(復(fù)性)
472 0C50s(延伸)
52 4步驟循環(huán)30次
672 0C5min (終延伸)
74 0C保存。 對(duì)PCR產(chǎn)物純化(見Qiagen公司所公開的PCR產(chǎn)物純化資料)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，得到 序列SEQ ID NO 1的基因片段。
二、過表達(dá)TTl基因的水稻植株制備1、采用的水稻材料(Oryza sativa L.)為粳稻日本晴，為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究 所保存。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大腸 桿菌(E. coli)采用Dffia菌株。根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建目的基因過量表達(dá)重組質(zhì)粒。上游引物(SEQID NO. 5) :5，-CGC GGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO. 6) :5，-CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。用上述引物，經(jīng)PCR，從油菜cDNA中擴(kuò)增完整的SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列， PCR程序如下1. 95°C 4min (預(yù)變性)2. 95°C30s (變性)3. 53°C 30s (復(fù)性)4. 72°C 50s (延伸)5. 2 4步驟循環(huán)30次6. 72 "C5min(終延伸)7.4V保存。對(duì)PCR產(chǎn)物純化(見Qiagen公司所公開的資料)，然后用BamHl與Mcl酶切，膠 回收，與載體PBI121連接(連接位點(diǎn)=BamHl與Mel)，獲含SEQ ID NO 1的過量表達(dá)重組 質(zhì)粒。在大腸桿菌DH5ci中繁殖后，提取質(zhì)粒(見Qiagen公司公開資料)，將含SEQ ID NO 1的過量表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。2、外植體培養(yǎng)方法幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代取田間開花后12-15天的水稻未成熟穎果，剝殼后 在75%酒精中浸泡1分鐘，用無菌水沖洗干凈后，0. 升汞滅菌20分鐘，再用無菌水沖洗 干凈。在超凈工作臺(tái)上晾干，用鑷子剝?nèi)∮着呓臃N在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB+2，4-D 2. 5mg/L)上， 于^TC下暗培養(yǎng)。一周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)情況并進(jìn)行繼代，以后每2周繼代一次。成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代選取外觀健康，飽滿，無病斑的成熟種子脫去穎 殼，75%酒精中浸泡1分鐘，用無菌水沖洗干凈后，0. 1 %升汞滅菌20分鐘，再用無菌水沖洗 干凈。在超凈工作臺(tái)上晾干，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于26°C下暗培養(yǎng)。2周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織 的誘導(dǎo)情況并進(jìn)行繼代，以后每2周繼代一次。3、水稻基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法3. 1、工程菌的活化用無菌牙簽在平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，放在IOmlYEP培養(yǎng)液(酵母提取物 (YeastExtract) IOg+ 姨蛋白腺(Tryptone) 5g+NaCl IOg+ 力口 /K 至 1L+Rif 50 μ g/mL+Hyg 25 μ g/mL)中培養(yǎng)；或著取保存于_20°C冰箱無菌農(nóng)桿菌菌液50-100 μ 1于2ml的含相應(yīng) 抗生素的YEP培養(yǎng)基上，250r/min, 培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)液300 μ 1于3ml的含相應(yīng) 抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，在250r/min，28°C的條件下遮光振動(dòng)培養(yǎng)，至菌液達(dá)0D600 = 0.5左右，即可用于轉(zhuǎn)化。上述含目的基因的菌液在無菌的50ml的離心管中以5000r/min離心5分鐘后回 收菌體，用30ml的NBCO (NB+2，4_D 2. Omg/L+AS (乙酰丁香酮)100 μ mol/L)液體培養(yǎng)基重懸含目的基因的菌體。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的，顆粒狀胚性愈傷組織用無菌鑷子將其適當(dāng)夾 小，創(chuàng)造傷口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染時(shí)間為10 30min，之后放入有濾紙的平皿 中吸干多余菌液。3. 2、共培養(yǎng)將吸干菌液的愈傷置于NBC0(NB+2，4-D 2. Omg/L+AS (乙酰丁香酮)100 μ mol/L) 固體培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)培養(yǎng)基上放1層濾紙，濾紙上放愈傷組織。22-25°C暗培養(yǎng)2-3天，直 至愈傷組織上出現(xiàn)少量菌斑為止。3. 3、脫菌與篩選共培養(yǎng)的愈傷組織放在廣口瓶中，用無菌水清洗至清澈，再浸泡于含Cef (頭孢霉 素)500mg/l NBCO液體培養(yǎng)基中，在搖床上中速振蕩30-60min，棄液，將愈傷組織用無菌濾 紙吸干或在超凈工作臺(tái)上吹干后接放在一篩培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)三周，再轉(zhuǎn)入二篩培養(yǎng)基上暗 培養(yǎng)三周，溫度控制在25 27°C。3. 4、分化與生根選擇將兩次篩選后新長(zhǎng)出的抗性愈傷組織接種到預(yù)分化培養(yǎng)基(NB+KTlmg/ L+NAAO. 25mg/L)上，暗培養(yǎng) 10 天。再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/ L+6-BAlmg/L+Hyg(潮霉素)25mg/L)上光照培養(yǎng)，用日光燈每天照明12小時(shí)，溫度控制在 25 27°C。約1 2個(gè)月，可獲得2cm左右高的幼苗。將幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當(dāng) 根長(zhǎng)到2cm左右高時(shí)取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽于大田。3. 5、轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)3. 5. 1、取一小片再生植株新鮮葉片，抽提總DNA (見Qiagen公司所公開的資料)， 以提取的DNA做模板，分別進(jìn)行檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因水稻植株中潮霉素hpthpt基因的PCR檢測(cè)潮霉素hpt基因的PCR引物序列為上游引物hpt-l(SEQ ID NO. 7) 5，-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3，下游引物hpt-2(SEQ ID NO. 8)5，-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3，PCR程序如下1. 95°C 4min (預(yù)變性)2. 95°C30s (變性)3. 53°C 30s (復(fù)性)4. 72°C50s (延伸)5. 2 4步驟循環(huán)37次6. 72 "C5min (終延伸)7. 40C保存以上PCR反應(yīng)完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1，若有有目標(biāo)條帶出現(xiàn) 則代表目的基因已轉(zhuǎn)入水稻中。轉(zhuǎn)基因水稻植株中TTl基因的PCR檢測(cè)TT1基因的PCR引物序列為TTl-KSEQ ID NO. 9) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，TT1-2(SEQ ID NO. 10) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATATTG-3，
PCR程序如下1. 95°C 4min (預(yù)變性)2. 95°C 30s (變性)3. 53°C 30s (復(fù)性)4. 72°C 50s (延伸)5. 2 4步驟循環(huán)37次6. 72 "C5min (終延伸)7.4V保存以上PCR反應(yīng)完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖2。有目標(biāo)條帶出現(xiàn)則代 表目的基因已轉(zhuǎn)入水稻中。RT-PCR 檢測(cè)提取了經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性的植株和野生型植株，抽提植株的總RNA(見Qiagen公 司所公開的資料)，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否在RNA水平上得到了表達(dá)。One Step RT-PCR 的方法在RNase-free 0. 2ml PCR 管中加入(50 μ 1 體系)
0111]IOXOne Step RT-PCR buffer5μ 1
0112]MgCl2 (25mM)10 μ 1
0113]dNTP Mixture(IOmM)5μ 1
0114]RNase Inhibitor(40U/μ 1)1 μ 1
0115]AMV Rtase XL (5U/μ 1)1 μ 1
0116]AMV-Optimized Taq(5U/yl)1 μ 1 011 7]上游特異引物QO μ Μ)1 μ 1
0118]下游特異引物QO μ Μ)1 μ 1
0119]Total RNA (彡 1 μ g)1 μ 1
0120]RNase Free ddH2024 μ 1
0121]Total50 μ 1/SampIeRT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)?. 50°C30min2. 94°C3min3. 94°C 40s4. 58°C 30s5. 72°C 40s6. 3 5步驟循環(huán)40次7. 72 °C5min8. 4°C保存電泳檢測(cè)結(jié)果見圖3，在陰性對(duì)照植株中沒有擴(kuò)增出特異條帶，而在待檢測(cè)植株中 擴(kuò)增出與目的片段大小一致條帶，證明在顯示條帶的植株中，轉(zhuǎn)入的TTl基因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄， 在RNA水平上得到了表達(dá)。三、過表達(dá)TTl基因的水稻農(nóng)藝性狀分析
將檢測(cè)確定的轉(zhuǎn)基因植株及未檢測(cè)出的陰性對(duì)照移至溫室大棚中，使其自交結(jié) 實(shí)，以備單株收種。水稻成熟后，兩種材料各選取10株進(jìn)行室內(nèi)考種，考察得到結(jié)果見表1，直觀比較 見圖4。表ITTl轉(zhuǎn)基因水稻與陰性對(duì)照的產(chǎn)量性狀比較
權(quán)利要求
1.TTl基因在提高植物產(chǎn)量中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
3.TTl基因編碼的多肽在提高植物產(chǎn)量中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的用途，其特征在于所述的植物為禾本科植物或十字花科 植物。
6.一種培育高產(chǎn)量植物的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成所述TTl基因的重組載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)量植株及其后代，所述后 代包括植物種子及植物組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TT1基因在提高植物產(chǎn)量中的用途。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高植物產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了TT1基因在提高植物產(chǎn)量中的用途，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)入了TT1基因并過表達(dá)的植物的產(chǎn)量有了明顯的提高。本發(fā)明培育出高產(chǎn)量植物的方法也簡(jiǎn)便而有效，為本領(lǐng)域提供了新的有效選擇。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102115750SQ20091031271
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者楊毅 申請(qǐng)人:四川貝安迪生物基因工程有限公司