一種提高基因工程菌異戊二烯及其衍生物產(chǎn)量的方法及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高基因工程菌異戊二烯及其衍生物產(chǎn)量的方法及應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明所提供的方法是在含有異戊二烯MVA生物合成途徑的基因工程菌中過(guò)表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸酶基因fbp。其中，基因工程菌可共表達(dá)乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因、甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因，以及異戊二烯合成酶或異戊二烯衍生物合成酶。利用本發(fā)明所提供的方法可大幅提高基因工程菌異戊二烯及其衍生物的產(chǎn)量，其中異戊二烯產(chǎn)量的提高了80.7％，異戊二烯衍生物香葉醇、檜烯和蒎烯產(chǎn)量分別提高了1.5倍、9倍和1.2倍。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種提高基因工程菌異戊二烯及其衍生物產(chǎn)量的方法及應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高基因工程菌異戊二烯及其衍生物產(chǎn)量的方法及應(yīng)用，屬于基 因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 異戊二烯是一種重要的化工平臺(tái)化合物，其95%用于合成橡膠；也是丁基橡膠的 第二單體。此外，還可廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、香料及粘結(jié)劑等領(lǐng)域。目前，異戊二烯的來(lái) 源主要是通過(guò)石油基原料異戊烷、異戊烯脫氫法、化學(xué)合成法（包括異丁烯-甲醛法、乙 炔-丙酮法、丙烯二聚法）和裂解C5餾分萃取蒸餾法。然而，隨著化石資源的日益枯竭，原 料來(lái)源是利用石油基原料制備異戊二烯的重要瓶頸問(wèn)題。以可再生的生物質(zhì)為原料，利用 生物轉(zhuǎn)化技術(shù)合成異戊二烯，因具有可持續(xù)性、環(huán)境友好、品質(zhì)優(yōu)異等優(yōu)勢(shì)，已成為國(guó)際上 的研究熱點(diǎn)。
[0003] 目前，生物基異戊二烯的生物合成路線主要是以葡萄糖為原料，利用甲羥戊酸 (MVA)或甲基赤蘚糖-5-磷酸（MEP)途徑合成異戊二烯。其中，MVA途徑因效率較高，是目 前異戊二烯生物合成的主要途徑。然而，與MEP途徑相比，MVA的產(chǎn)率較低。
[0004] 其主要原因是1分子葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解途徑生成2分子乙酰輔酶A，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生 2分子二氧化碳。I. W.，Bogorad等人（2013)提出細(xì)胞除了在有氧的條件存在糖酵解途徑 (MEP途徑）以外，在厭氧條件下還存在一條非氧化的糖酵解途徑（N0G途徑），該途徑可將1 分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為3分子乙酰磷酸，進(jìn)而合成3分子乙酰輔酶A。該研究在體外構(gòu)建了 NOG 途徑，并證明以葡萄糖6磷酸為底物，利用NOG途徑可提高乙酸（乙酰磷酸的下游產(chǎn)物）的 產(chǎn)量，同時(shí)，在細(xì)胞體內(nèi)，以木糖為原料，通過(guò)過(guò)表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因（fxpk)和果糖1，6二 磷酸酶基因（fbp)并敲除乳酸脫氫酶（IdhA)、:1^(11^、3(11^4；1^113和;1^(11^后，可以使乙酸的 摩爾產(chǎn)率達(dá)到2. 2接近利用NOG途徑的乙酸理論摩爾產(chǎn)率2. 5。雖然該研究證明了 NOG途 徑的可行性，然而，該研究并沒(méi)有以葡萄糖為底物，在體內(nèi)利用NOG途徑合成異戊二烯及其 衍生物的研究。葡萄糖降解所需的磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS)涉及到復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制， NOG途徑是否適合以葡萄糖為原料的體內(nèi)代謝無(wú)法得知。此外，該研究?jī)H報(bào)道了乙酸的變 化，乙酰磷酸合成乙酸僅為一步反應(yīng)，而從乙酰磷酸合成乙酰輔酶A，再由乙酰輔酶A為底 物合成異戊二烯及其衍生物卻需要經(jīng)過(guò)7步酶反應(yīng)，過(guò)表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因（fxpk)和果糖 1，6二磷酸酶基因（fbp)是否適用于如此復(fù)雜的代謝途
[0005] 本發(fā)明為了解決異戊二烯及其衍生物生物合成過(guò)程中存在碳損失、產(chǎn)率低的瓶 頸問(wèn)題，提供了一種提高基因工程菌異戊二烯及其衍生物產(chǎn)量的方法，采取的技術(shù)方案如 下：
[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種提高基因工程菌異戊二烯及其衍生物產(chǎn)量的方 法，該方法是在含有異戊二烯MVA生物合成途徑的基因工程菌中過(guò)表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因 fxpk和果糖1，6-二磷酸酶基因 fbp。
[0007] 所述含有異戊二烯MVA生物合成途徑的基因工程菌，是共表達(dá)乙酰輔酶A?；D(zhuǎn) 移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因、甲羥戊酸激 酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu) 酶基因，以及以下任意一種基因的基因工程菌：
[0008] 1)異戊二烯合成酶基因；
[0009] 2)異戊二烯衍生物合成酶基因。
[0010] 所述異戊二烯衍生物合成酶基因，是香葉醇合成酶基因、檜烯合成酶基因、菔烯合 成酶基因、甲羥戊酸合成酶基因或橙花醇合成酶基因。
[0011] 所述基因工程菌，優(yōu)選敲除了乙酸激酶基因 ackA、D-乳酸脫氫酶基因 ldhA、乙醛 乙醇脫氫酶基因 adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB和延胡索酸鹽還原酶鐵硫蛋白和膜蛋 白基因 frdBC的大腸桿菌的大腸桿菌。
[0012] 所述磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因 fxpk，優(yōu)選來(lái)自青春雙歧桿菌，GeneBank登錄號(hào)為 AY518212.1，或者來(lái)自凝結(jié)芽孢桿菌Gene ID為11174923;或者來(lái)自蒙氏腸球菌Gene ID為 17696722 ；
[0013] 所述果糖1，6-二磷酸酶基因 fbp，優(yōu)選來(lái)自大腸桿菌，GeneBank登錄號(hào)為ACT 45889. 1 ;或者來(lái)自釀酒酵母，GeneBank登錄號(hào)為AAA34603. 1 ;或者來(lái)自枯草芽孢桿菌， NCBI參考序列號(hào)為WP_003243329. 1 ;或來(lái)自擬南芥，GeneBank登錄號(hào)為AEE79180. 1。
[0014] 所述方法的步驟如下：
[0015] 1)構(gòu)建含有乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、 3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因、甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲 羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因，以及異戊二烯合成酶基因或異 戊二烯衍生物合成酶基因的MVA途徑上下游重組質(zhì)粒；
[0016] 2)構(gòu)建含有磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因 fxpk和果糖1，6-二磷酸酶基因 fbp的重組質(zhì)粒；
[0017] 3)將步驟1)和步驟2)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主菌中，過(guò)表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因 fxpk和果糖1,6-二磷酸酶基因 fbp。
[0018] 步驟1)所述乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因和 3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因來(lái)自于糞腸球菌；所述甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊 酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因來(lái)自于釀 酒酵母。
[0019] 所述方法的具體步驟如下：
[0020] 1)將乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊 二酰輔酶A合酶基因和異戊二烯合成酶基因克隆到質(zhì)粒pACY⑶uet-Ι上，獲得MVA途徑上 游質(zhì)粒 pACY-mvaE-mvaS_isps4 ;
[0021] 所述乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因和3-羥-3-甲基 戊二酰輔酶A合酶基因來(lái)自于糞腸球菌Enterococcus faecalis ;
[0022] 2)將甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶 基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因克隆到pTrcHis2B，獲得MVA途徑下游質(zhì)粒pTrc_low ;
[0023] 所述甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶 基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因來(lái)源于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae ;
[0024] 3)將磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因 fxpk和果糖1，6-二磷酸酶基因 fbp克隆到質(zhì)粒 pCOLADUet-Ι 上，獲得重組質(zhì)粒 pCOLA-fbp-fxpk ;
[0025] 4)將步驟1)、步驟2)和步驟3)所得的質(zhì)粒導(dǎo)入到敲除了乙酸激酶基因 ackA、 D-乳酸脫氫酶基因 ldhA、乙醛乙醇脫氫酶基因 adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB和延胡索 酸鹽還原酶鐵硫蛋白和膜蛋白基因 frdBC的大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)。
[0026] 所述方法用于生產(chǎn)異戊二烯及其衍生物。
[0027] 本發(fā)明的另一目的是提供了一種利用所述方法生產(chǎn)異戊二烯及其衍生物的方法， 該方法的步驟如下：
[0028] 1)將乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊 二酰輔酶A合酶基因以及異戊二烯合成酶基因或異戊二烯衍生物合成酶基因克隆到質(zhì)粒 上，構(gòu)建MVA途徑上游質(zhì)粒；
[0029] 2)將甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶 基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因克隆到質(zhì)粒上，構(gòu)建MVA途徑下游質(zhì)粒；
[0030] 3)將磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因 fxpk和果糖1，6-二磷酸酶基因 fbp克隆到質(zhì)粒 pCOLADUet-Ι 上，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pCOLA-fbp-fxpk ;
[0031] 4)將步驟1)、步驟2)和步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到敲除了乙酸激酶基因 ackA、D-乳酸脫氫酶基因 ldhA、乙醛乙醇脫氫酶基因 adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB和 延胡索酸鹽還原酶鐵硫蛋白和膜蛋白基因 frdBC的大腸桿菌中，獲得重組菌；
[0032] 5)發(fā)酵步驟4)所得重組菌，分離提取發(fā)酵產(chǎn)物中的異戊二烯或異戊二烯衍生物。
[0033] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0034] 本發(fā)明針對(duì)異戊二烯及其衍生物生物合成過(guò)程中存在碳損失、產(chǎn)率低的瓶頸問(wèn) 題，在含有異戊二烯MVA生物合成途徑的基因工程菌中過(guò)表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因 fxpk和果糖 1，6-二磷酸酶基因 fbp，構(gòu)建了一條新的異戊二烯合成途徑，大幅提高了基因工程菌的異 戊二烯及其衍生物的產(chǎn)量。其中異戊二烯產(chǎn)量的提高了 80. 7%，異戊二烯衍生物香葉醇、檜 烯和菔烯的產(chǎn)量分別提高了 1. 5倍、9倍和1. 2倍。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為本發(fā)明所用的質(zhì)粒pCOLA-fbp-Fxpk的遺傳圖譜。
[0036] 圖2為實(shí)施例2所得異戊二烯的氣質(zhì)檢測(cè)圖。
[0037] 圖3為實(shí)施例4所得香葉醇的氣質(zhì)檢測(cè)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0039] 以下實(shí)施例中涉及的材料、試劑、儀器、方法，未經(jīng)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)材 料、試劑、儀器和方法，可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得。
[0040] 實(shí)施例1 :質(zhì)粒pCOLA-fbp-fxpk的構(gòu)建
[0041] (1)果糖1 '6-二磷酸酶基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建
[0042] 以大腸桿菌為模板，擴(kuò)增基因片段，同時(shí)連入酶切位點(diǎn)Aat II和Xhol。以
[0043] fbp-F-Aat II :5' -ATCGGACGTCATGAAAACGTTAGGTGAATTTATTG-3'
[0044] fbp-R-XhoI: 5' -CCGCTCGAGTTACGCGTCCGGGAACTC-3' 為引物，以大腸桿菌的 DNA 為 模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后，利用內(nèi)切酶Aat II和XhoI進(jìn)行雙酶切，再連接到同樣進(jìn)行 雙酶切的pCOLADUet-Ι載體上，形成了質(zhì)粒pColA-fbp
[0045] 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，然后涂布加有50 μ g .mL-1卡那霉素的LB固體平板， PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。
[0046] (2)磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建
[0047] 以 Fxpk-F-EcoR I :5' -CCGGAATTCC ATGACGAGTCCTGTTATTGG-3'
[0048] Fxpk-R-Hind III : 5，-CCCAAGCTT TTATCGCCAGCGGTTGC-3，為引物
[0049] 以青春雙歧桿菌（CGMCC NO. I. 2190)DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后，利用 內(nèi)切酶EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切，并連接在同樣雙酶切后的質(zhì)粒pCOLA-fbp上，構(gòu)建出 pCOLA-fbp-Fxpk (圖 1)。
[0050] 實(shí)施例2 :搖瓶發(fā)酵合成異戊二烯
[0051] (I)E. coli重組菌株的構(gòu)建
[0052] 將 MVA 上游質(zhì)粒（pACY-MvaE_MVAS_isps4)和下游途徑質(zhì)粒（pTrc-low)及 pC0LA-fbp_fxpk(共同熱擊轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉素、卡那 霉素和氨芐霉素抗生素的LB固體平板，通過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，由此獲得工程大腸桿 菌 LWN0G1。
[0053] 將MVA上游（pACY-MvaE-MVAS-isps4)和下游途徑（pTrc-low)(共同熱擊轉(zhuǎn)化 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉素和氨芐霉素抗生素的LB固體平板，由此 獲得工程大腸桿菌LWIPl作為對(duì)照菌。
[0054] MVA 上游（pACY-MvaE_MVAS_isps4)的構(gòu)建方法同文獻(xiàn)（Jianming Yang， Enhancing Production of Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and Isoprene Synthase in E. coli. PLoS 0NE，2012,7(4) :e33509)中質(zhì)粒 pYJM20 的構(gòu)建；下游途徑 pTrc-low 的構(gòu)建方法同文獻(xiàn)（Jianming Yang, Enhancing Production of Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and Isoprene Synthase in E.coli. PLoS ONE,2012,7(4)： e33509)中質(zhì)粒pYJM14的構(gòu)建。
[0055] (2)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)異戊二烯
[0056] 挑取步驟⑴獲得的LWN0G1的白色單克隆（12h內(nèi)長(zhǎng)出的）在3ml LB(Cm+Amp+Kan，l%。）中，于37°C搖床培養(yǎng)活化。菌液濃度為1.0左右轉(zhuǎn)接至30ml LB (Amp+Cm+Kan)中進(jìn)行擴(kuò)培，作為種子。
[0057] 取擴(kuò)培后的菌液按1 %接種量接入IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基（K2HPO4 · 3H20 0. 98g ;-水 合檸檬酸〇· 21g ;檸檬酸鐵銨0· 03g ;MD牛肉粉0· 9g ;葡萄糖0· 2g ;MgS04(lM) 200ul ;微量 元素 100 μ I ((NH4)6M〇7024 · 4H20 7. 4g/L，ZnSO4 · 7H20 5. 8g/L，Η3Β0449 · 4g/L，CuSO4 · 5H20 5g/L，MnCl2 · 4H20 31. 6g/L);氨芐青霉素 50 μ g/mL ;氯霉素 34 μ g/mL)，37°C搖菌，菌濃長(zhǎng) 至I. 0左右加入終濃度為0. 5mM的IPTG，通入過(guò)濾后的氮?dú)?，加瓶塞，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。30°C， 180rpm 搖菌。
[0058] 對(duì)照菌LWIPl培養(yǎng)同上，僅抗生素為（Amp+Cm)。
[0059] (3)產(chǎn)物檢測(cè)
[0060] 發(fā)酵24-48h后，抽上層氣體進(jìn)行GC-MS檢測(cè)異戊二烯。結(jié)果表明菌株LWPYCl可合 成4. 5g/L，產(chǎn)率達(dá)22. 5%，明顯高于對(duì)照菌LWIPl (異戊二烯產(chǎn)量2. 49g/L，產(chǎn)率12. 5% )。 檢測(cè)圖譜將圖2。
[0061] 實(shí)施例3 :5L發(fā)酵罐合成異戊二烯
[0062] M9 種子培養(yǎng)基（/L) :20g葡萄糖，6g Na2HPO4, 3g KH2PO4, Ig NH4Cl，0· 5gNaCl，0. 24g MgSO4,121°C高壓蒸汽滅菌15min。
[0063] 發(fā)酵培養(yǎng)基（/2L) :19. 6g K2HPO4 ·3Η20,4· 2g citric acid ·Η20,0· 6g檸檬酸鐵銨， 0· 8ml 濃硫酸，40g 葡萄糖，0· 123mg(NH4)6M〇702 ·4Η20,0· 097mg ZnSO4 ·7Η20,0· 823mg H3BO4, 0· 083mg CuSO4 · 5Η20,0· 527mg MnCl2 · 4H20,4ml IM MgSO4,1900ml 蒸餾水。
[0064] 挑取菌株LWNOGl單克隆到50ml M9種子培養(yǎng)基中，37 °C、180rpm活化過(guò)夜 (18-24h)。將種子按10%的接種量接種至含有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L小型發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn) 速400rpm，37°C培養(yǎng)至OD 6tltl約為12時(shí)，添加終濃度為0. I-ImM的IPTG，關(guān)閉通氣，并于 25°C -37°C培養(yǎng)，以氨水調(diào)pH，控制pH在7. 0,每隔8h補(bǔ)加一次IPTG。得到的異戊二烯產(chǎn) 物通過(guò)GC-MS對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)發(fā)酵液中殘余葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)，并 通過(guò)變速流加濃度為800g/L的糖液，維持殘?zhí)菨舛仍?. 5g/L以下。每4h取發(fā)酵液5ml，測(cè) 定細(xì)胞0D600、葡萄糖濃度；每15min取尾氣lml，利用氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物異戊二烯和二氧 化碳濃度。直到OD不再變化，產(chǎn)物不再產(chǎn)生為止。對(duì)照菌為L(zhǎng)WIP1。
[0065] 結(jié)果表明菌株LWPYCl可合成24. 7g/L，產(chǎn)率達(dá)26%，明顯高于對(duì)照菌LWIPl (異戊 二烯產(chǎn)量18g/L，產(chǎn)率15% )。
[0066] 實(shí)施例4 :發(fā)酵產(chǎn)香葉醇
[0067] (I)E. coli重組菌株的構(gòu)建
[0068] 根據(jù)基因序列GenBank:AY362553. 1合成香葉醇合成酶基因（GES)，并連入pGH載 體上形成pGH-GES載體。以pGH-GES為模版，GES-rbs-Bgl II和GES-xhol I為引物，PCR 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：98°C預(yù)變性30s ;98°C變性5s，57°C退火5s，72°C延伸lmin30s，以上 變性、退火、延伸三步重復(fù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin。利用膠回收試劑盒（購(gòu)自 Fermentas，Cat. No. K〇692)回收目的基因片段。
[0069] 將回收的基因片段與PYJM26載體分別用BglII和XhoI進(jìn)行雙酶切，載體與外源 片段按摩爾比1:5的比例，4°C連接過(guò)夜或16°C連接4?6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5a， 然后涂布加有34μ g · mL-1氯霉素的LB固體平板，PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取 重組質(zhì)粒pLWGl (PACY-mVaE-mvaS-GPPS2-GES)后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。
[0070] 將 pLWGl、pYJM14(該質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn)文獻(xiàn)：Jianming Yang, Enhancing Production of Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and Isoprene Synthase in E. coli. PLoS ONE，2012, 7 (4) :e33509)和 pCOLA-fbp-Fxpk 重組質(zhì)粒共同熱擊轉(zhuǎn)化 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉素、卡那霉素和氨芐霉素抗生素的LB固體平板，通 過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，由此獲得工程大腸桿菌LWN0G2。以只含質(zhì)粒pLWGl和pYJM14的 菌株LWGl作為對(duì)照菌。
[0071] (2)發(fā)酵產(chǎn)香葉醇
[0072] M9 種子培養(yǎng)基（/L) :20g葡萄糖，6g Na2HPO4, 3g KH2PO4, Ig NH4Cl，0· 5gNaCl，0. 24g MgSO4,121°C高壓蒸汽滅菌15min。
[0073] 發(fā)酵培養(yǎng)基（/2L) :19. 6g K2HPO4 ·3Η20,4· 2g citric acid ·Η20,0· 6g檸檬酸鐵銨， 0· 8ml 濃硫酸，40g 葡萄糖，0· 123mg(NH4)6Μ〇702 ·4Η20,0· 097mg ZnSO4 ·7Η20,0· 823mg H3BO4, 0· 083mg CuSO4 · 5Η20,0· 527mg MnCl2 · 4H20,4ml IM MgSO4,1900ml 蒸餾水。
[0074] 挑取單克隆到50ml M9種子培養(yǎng)基中，37°C、180rpm活化過(guò)夜（18-24h)。將種子 按1〇%的接種量接種至含有21^發(fā)酵培養(yǎng)基的51^小型發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)速400印111，371：培養(yǎng)至 OD6tltl約為12時(shí)，添加終濃度為0. I-ImM的IPTG，25°C -37°C誘導(dǎo)表達(dá)，并按1:10的比例加 入肉豆蘧異丙酯，以氨水調(diào)PH，控制pH在7. 0,同時(shí)停止通氣。培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)發(fā)酵液中殘余 葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)變速流加濃度為800g/L的糖液，維持殘?zhí)菨舛仍?. 5g/L以下。每 4h取發(fā)酵液5ml，測(cè)定細(xì)胞0D600、葡萄糖濃度。當(dāng)工程菌株誘導(dǎo)48h后，離心取有機(jī)層，按 I : 10加入乙酸乙酯稀釋?zhuān)肎C-MS定性檢測(cè)。最終菌株獲得了 3g/L香葉醇，產(chǎn)率達(dá)6%， 對(duì)照菌LWGl獲得了 I. 2g/L的香葉醇，產(chǎn)率為1. 2%。檢測(cè)圖譜如圖3所示。
[0075] 實(shí)施例5 :發(fā)酵產(chǎn)檜烯
[0076] (I)E. coli重組菌株的構(gòu)建
[0077] 將 pHB7 (Zhang et al. Microbial Cell Factories 2014, 13:20)、pYJM14 (Yang et al.，PLoS 0NE，2012,7(4) :e33509)和 pCOLA-fbp-Fxpk 重組質(zhì)粒共同熱擊轉(zhuǎn)化 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉素、卡那霉素和氨芐霉素抗生素的LB固體平板，通 過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，由此獲得工程大腸桿菌LWN0G3。以只含質(zhì)粒pLWGl和pYJM14的 菌株LWGl作為對(duì)照菌。
[0078] (2)發(fā)酵產(chǎn)檜烯
[0079] 培養(yǎng)基：40%葡萄糖5mL、lmol/LMgS04 200uL、微量元素 IOOuU抗生素 IOOuU菌 液lmL，置于37°C、180rpm搖床中震蕩培養(yǎng)。1000X微量元素400mL中含有以下無(wú)機(jī)鹽：四 水鑰酸銨I. 48g ;七水硫酸鋅I. 16g ;硼酸9. 88g ;五水硫酸銅Ig ;四水氯化錳6. 32g。加時(shí)按 1 %。的量加。菌液0D600至0. 5左右時(shí)，補(bǔ)加20%的IPTG誘導(dǎo)，至終濃度為0. 05?0. 25mM。 同時(shí)加瓶塞，形成厭氧環(huán)境。將搖瓶轉(zhuǎn)入28?37°C、100?160rpm搖瓶中培養(yǎng)12?24h， 利用氣相-質(zhì)譜測(cè)定檜稀。
[0080] 經(jīng)檢測(cè)，菌株LWN0G3產(chǎn)率為1 % ;對(duì)照菌合成檜烯產(chǎn)率為0. 1 %。
[0081] 實(shí)施例6:發(fā)酵產(chǎn)菔烯
[0082] (I)E. coli重組菌株的構(gòu)建
[0083] 將 pYJM27 (Yang et al. Biotechnology for Biofuels 2013, 6:60)和 pYJM14(Jianming Yang, Enhancing Production of Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and Isoprene Synthase in E.coli. PLoS ONE,2012,7(4) :e33509)和 pCOLA-fbp-Fxpk重組質(zhì)粒共同熱擊轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉 素、卡那霉素和氨芐霉素抗生素的LB固體平板，通過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，由此獲得工程 大腸桿菌LWN0G4。以只含質(zhì)粒pLWGl和pYJM14的菌株LWGl作為對(duì)照菌。
[0084] (2)發(fā)酵產(chǎn)菔烯
[0085] 培養(yǎng)基：40%葡萄糖5mL、lmol/LMgS04 200uL、微量元素 IOOuU抗生素 IOOuU菌 液lmL，置于37°C、180rpm搖床中震蕩培養(yǎng)。1000X微量元素400mL中含有以下無(wú)機(jī)鹽：四 水鑰酸銨I. 48g ;七水硫酸鋅I. 16g ;硼酸9. 88g ;五水硫酸銅Ig ;四水氯化錳6. 32g。加時(shí)按 1 %。的量加。菌液0D600至0. 5左右時(shí)，補(bǔ)加20%的IPTG誘導(dǎo)，至終濃度為0. 05?0. 25mM。 同時(shí)加瓶塞，形成厭氧環(huán)境。將搖瓶轉(zhuǎn)入28?37°C、100?160rpm搖瓶中培養(yǎng)12?24h， 利用氣相-質(zhì)譜測(cè)定菔烯。
[0086] 經(jīng)檢測(cè)，菌株LWN0G4的產(chǎn)率為5. 8% ;對(duì)照菌合成檜烯產(chǎn)率為2. 6%。
[0087] 雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動(dòng)和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù) 范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種提高基因工程菌異戊二烯及其衍生物產(chǎn)量的方法，其特征在于，在含有異戊二 烯MVA生物合成途徑的基因工程菌中過(guò)表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因fxpk和果糖1，6-二磷酸酶基 因 fbp。
2. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述含有異戊二烯MVA生物合成途徑的基因工程 菌，是共表達(dá)乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二 酰輔酶A合酶基因、甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸 脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因，以及以下任意一種基因的基因工程菌： 1) 異戊二烯合成酶基因； 2) 異戊二烯衍生物合成酶基因。
3. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述異戊二烯衍生物合成酶基因，是香葉醇合成 酶基因、檜烯合成酶基因、菔烯合成酶基因、甲羥戊酸合成酶基因或橙花醇合成酶基因。
4. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述基因工程菌，是敲除了乙酸激酶基因ackA、 D_乳酸脫氫酶基因ldhA、乙醛乙醇脫氫酶基因adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和延胡索 酸鹽還原酶鐵硫蛋白和膜蛋白基因frdBC的大腸桿菌。
5. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因fxpk，來(lái)自青春雙歧桿菌， GeneBank登錄號(hào)為AY518212. 1，或者來(lái)自凝結(jié)芽孢桿菌Gene ID為11174923 ;或者來(lái)自蒙 氏腸球菌Gene ID為17696722 ; 所述果糖1，6-二磷酸酶基因fbp，來(lái)自大腸桿菌，GeneBank登錄號(hào)為ACT 45889. 1 ;或 者來(lái)自釀酒酵母，GeneBank登錄號(hào)為AAA34603. 1 ;或者來(lái)自枯草芽孢桿菌，NCBI參考序列 號(hào)為WP_003243329. 1 ;或來(lái)自擬南芥，GeneBank登錄號(hào)為AEE79180. 1。
6. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下： 1) 構(gòu)建含有乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基 戊二酰輔酶A合酶基因、甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二 磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因，以及異戊二烯合成酶基因或異戊二烯衍生物 合成酶基因的MVA途徑上下游重組質(zhì)粒； 2) 構(gòu)建含有磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因fxpk和果糖1,6-二磷酸酶基因fbp的重組質(zhì)粒； 3) 將步驟1)和步驟2)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主菌中，過(guò)表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因fxpk 和果糖1，6-二磷酸酶基因fbp。
7. 權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，步驟1)所述乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊 二酰輔酶A還原酶基因和3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因來(lái)自于糞腸球菌；所述甲羥 戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因、異戊烯焦磷 酸異構(gòu)酶基因來(lái)自于釀酒酵母。
8. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 將乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰 輔酶A合酶基因和異戊二烯合成酶基因克隆到質(zhì)粒pACY⑶uet-1上，獲得MVA途徑上游質(zhì) 粒 pACY-mvaE-mvaS_isps4 ; 所述乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因和3-羥-3-甲基戊二 醜輔酶A合酶基因來(lái)自于奠腸球菌Enterococcus faecalis ; 2) 將甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基 因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因克隆到質(zhì)粒pTrcHis2B，獲得MVA途徑下游質(zhì)粒pTrc_low ;所 述甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因、異戊 烯焦磷酸異構(gòu)酶基因來(lái)源于釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae ; 3) 將磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因fxpk和果糖1，6-二磷酸酶基因fbp克隆到質(zhì)粒pCOLADUet-1 上，獲得重組質(zhì)粒pCOLA-fbp-fxpk ; 4) 將步驟1)、步驟2)和步驟3)所得的質(zhì)粒導(dǎo)入到敲除了乙酸激酶基因ackA、D-乳酸 脫氫酶基因ldhA、延胡索酸鹽還原酶鐵硫蛋白和膜蛋白基因frdBC、乙醛乙醇脫氫酶基因 adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB的大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)。
9. 權(quán)利要求1-8所述方法，其特征在于，用于生產(chǎn)異戊二烯及其衍生物。
10. 權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，步驟如下： 1) 將乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、3-羥-3-甲基戊二酰 輔酶A合酶基因以及異戊二烯合成酶基因或異戊二烯衍生物合成酶基因克隆到質(zhì)粒上，構(gòu) 建MVA途徑上游質(zhì)粒； 2) 將甲羥戊酸激酶基因、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基 因、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因克隆到質(zhì)粒上，構(gòu)建MVA途徑下游質(zhì)粒； 3) 將磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因fxpk和果糖1，6-二磷酸酶基因fbp克隆到質(zhì)粒pCOLADUet-1 上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCOLA-fbp-fxpk ; 4) 將步驟1)、步驟2)和步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到敲除了乙酸激酶基因ackA、 D_乳酸脫氫酶基因ldhA、延胡索酸鹽還原酶鐵硫蛋白和膜蛋白基因frdBC、乙醛乙醇脫氫 酶基因adhE、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB的大腸桿菌中，獲得重組菌； 5) 發(fā)酵步驟4)所得重組菌，分離提取發(fā)酵產(chǎn)物中的異戊二烯或異戊二烯衍生物。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104372017SQ201410617873
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】咸漠, 劉煒, 田寧, 程濤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所