專利名稱：：密毛兜蘭的無(wú)菌種子萌發(fā)和幼苗增殖方法密毛兜蘭的無(wú)菌種子萌發(fā)和幼苗增殖方法所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及密毛兜蘭的無(wú)菌種子萌發(fā)和幼苗增殖方法。
背景技術(shù)：
：兜蘭又名拖鞋蘭，《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》將所有兜蘭列入附錄I。兜蘭種子由于胚發(fā)育不完全，自然狀態(tài)下極難萌發(fā)，其無(wú)菌播種技術(shù)雖早有研究，但普遍存在萌發(fā)率低，成苗率低的困難，其無(wú)性繁殖更是待解決的世界難題，難以進(jìn)行大規(guī)模的商品化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提供密毛兜蘭無(wú)菌種子萌發(fā)和幼苗增殖方法，利用無(wú)菌播種的方法獲得大量試管苗，并利用試管苗進(jìn)行增殖，通過(guò)生根培養(yǎng)能形成完整植株。具有萌發(fā)率高，出苗快，苗壯，種苗品質(zhì)好生長(zhǎng)快速等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下述的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的密毛兜蘭的無(wú)菌種子萌發(fā)和幼苗增殖方法，選取密毛兜蘭開(kāi)花母株進(jìn)行人工授粉，取授粉后200天的果實(shí)，刮去果皮上的細(xì)毛，浸泡在75%的酒精30秒后置于0.1%的升汞溶液中消毒15分種，無(wú)菌水沖洗4-5次后切開(kāi)果實(shí)，將白色胚接種到KC培養(yǎng)基添加20%葡萄糖和10%椰子汁的培養(yǎng)基里，40天種子萌發(fā)后再轉(zhuǎn)接到VW培養(yǎng)基添加20%葡萄糖和10X土豆泥的培養(yǎng)基里，待形成整株后繼代培養(yǎng)在1/4MS培養(yǎng)基添加20%葡萄糖以及6-芐基嘌呤5毫克/升和萘乙酸0.5毫克/升中，或者1/4MS培養(yǎng)基添加6-芐基嘌呤6毫克/升和萘乙酸0.1毫克/升中，當(dāng)試管苗長(zhǎng)至3-4厘米時(shí)，轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗10天，取出后洗凈根部培養(yǎng)基，將幼苗轉(zhuǎn)移至裝有滅菌的泥炭蘚的培養(yǎng)袋內(nèi)，放置于濕度為70%-75%的溫室i個(gè)月，最后移入2:2:i的火山石蕨根水苔的混合基質(zhì)中，放置在濕度不低于70%的有遮陰網(wǎng)的溫室里。KC是K皿dsonC，VW是Vacinandwent。圖1重復(fù))；圖2圖3甘露醇)圖4圖5圖6圖7密毛兜蘭種子成熟度(200DAP授粉后天數(shù))對(duì)萌發(fā)率的影響(實(shí)驗(yàn)為5水不同培養(yǎng)基對(duì)密毛兜蘭萌發(fā)率的影響(從左至右1/4MS，1/2MS，KC，VW)不同的碳源對(duì)密毛兜蘭植株生長(zhǎng)的影響(從左至右麥芽糖，葡萄糖，蔗糖，激素誘導(dǎo)兜蘭植物的芽增殖；不同培養(yǎng)基化合物成分對(duì)密毛兜蘭萌發(fā)率的影響；不同的碳源對(duì)密毛兜蘭萌發(fā)和植株生長(zhǎng)的影響；不同的有機(jī)添加物對(duì)密毛兜蘭萌芽和植株生長(zhǎng)的影響。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但任何對(duì)本發(fā)明做出的非顯而易見(jiàn)的非創(chuàng)造性改變，將視為落入本發(fā)明的技術(shù)方案之內(nèi)。實(shí)施例1:選取密毛兜蘭(Paphiopedilumvillosumvar.densissimum)開(kāi)花母株進(jìn)行人工授粉，取授粉后200天的果實(shí)，刮去果皮上的細(xì)毛，浸泡在75%的酒精30秒后置于0.1%的升汞溶液中消毒15分種，無(wú)菌水沖洗4-5次后切開(kāi)果實(shí)，將白色胚接種到KC培養(yǎng)基添加20%葡萄糖和10%椰子汁的培養(yǎng)基里，40天種子萌發(fā)后再轉(zhuǎn)接到VW培養(yǎng)基添加20%葡萄糖和10X土豆泥的培養(yǎng)基里，待形成整株后繼代培養(yǎng)在1/4MS培養(yǎng)基添加20%葡萄糖以及6-芐基嘌呤5毫克/升和萘乙酸0.5毫克/升中，或者1/4MS培養(yǎng)基添加6-芐基嘌呤6毫克/升和萘乙酸0.1毫克/升中，當(dāng)試管苗長(zhǎng)至3-4厘米時(shí)，當(dāng)試管苗長(zhǎng)至3-4厘米時(shí)，轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗10天，取出后洗凈根部培養(yǎng)基，將幼苗轉(zhuǎn)移至裝有滅菌的泥炭蘚，直徑10cm培養(yǎng)袋內(nèi)，放置于濕度為70%-75%溫室內(nèi)l個(gè)月，最后移入火山石、蕨根和水苔的混合基質(zhì)(2:2:1)中。放置在濕度高于70%的有遮陰網(wǎng)的溫室里。種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)材料與方法材料本試驗(yàn)所用兜蘭材料來(lái)自中國(guó)云南省的文山密毛兜蘭(Paphiopedilumvillosumvar.densissimum)。方法開(kāi)花時(shí)在同種異株間進(jìn)行人工授粉。種子成熟度(從人工授粉到接種的時(shí)間)根據(jù)下面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求而不同。蒴果采收后，先以70X乙醇進(jìn)行表面滅菌30-60sec，再用氯化汞(0.1%)進(jìn)行表面滅菌15-20min，無(wú)菌水清洗5遍，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將蒴果剖開(kāi)后，用鑷子將種子均勻地刮入培養(yǎng)基內(nèi)。基本培養(yǎng)基采用1/4MS(Murashige&Skoog，1962)，瓊脂粉6g"，用1N的K0H，HC1調(diào)節(jié)pH值至5.8±0.1。其它實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基如下文以及結(jié)果見(jiàn)圖5，6，7:分別接入KC，VW，1/4MS和1/2MS四種不同培養(yǎng)基；分別添加四種碳源蔗糖20gl—、葡萄糖20gl—、麥芽糖20gl—、甘露醇20g1—1以及分別添加五種有機(jī)添加物馬鈴薯泥100g"，佛手瓜泥100g1—1與蘋果泥100g"和LH水解乳蛋白4gl—、椰子汁100m11—1。于自動(dòng)高壓滅菌鍋12rC滅菌、20分鐘。每瓶培養(yǎng)基接種200-300粒種子。每種處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。容器為200ml、高8cmX寬7cm的玻璃罐頭瓶、1個(gè)培養(yǎng)瓶為1個(gè)實(shí)驗(yàn)單位。除了種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)將置于暗光培養(yǎng)1個(gè)月，所有實(shí)驗(yàn)的種子或外植體暗光培養(yǎng)2個(gè)星期，再置于光照強(qiáng)度為2000lx36W的熒光燈下培養(yǎng)3個(gè)月，照明每天16h，培養(yǎng)環(huán)境為22±2°C。激素誘導(dǎo)芽繁殖實(shí)驗(yàn)將這個(gè)種的原球莖(來(lái)自種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn))，轉(zhuǎn)移至新鮮基本培養(yǎng)基(與上述方法中的基本培養(yǎng)基相同)。繼代后直至一年以后長(zhǎng)成3-5cm的幼苗，這些幼苗將用來(lái)做為芽繁殖的實(shí)驗(yàn)材料。每瓶3株幼苗。實(shí)驗(yàn)材料的幼苗葉子剪掉一半后接種，減少營(yíng)養(yǎng)的吸收，以及以示區(qū)別長(zhǎng)出來(lái)的新芽。然后接入添加了各種細(xì)胞分裂素和細(xì)胞生長(zhǎng)素，共36種組合(見(jiàn)表2)。3個(gè)月以后統(tǒng)計(jì)芽數(shù)和芽長(zhǎng)，見(jiàn)結(jié)果(表2)。移栽芽繁殖實(shí)驗(yàn)2個(gè)月以后，在濕度70%條件下，打開(kāi)瓶蓋，煉苗10天后，在自來(lái)水下輕輕洗凈瓊脂。然后將幼苗轉(zhuǎn)移至裝有滅菌的泥炭蘚，直徑10cm培養(yǎng)袋內(nèi)，放置于溫室內(nèi)，保持高濕條件，一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)存活率。栽培管理對(duì)于活植物的保存，將根據(jù)生態(tài)相似性原則，在室內(nèi)模擬兜蘭的自然生境，特別注意對(duì)光照、濕度的控制，選用適合兜蘭栽培的基質(zhì)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0軟件LSD測(cè)試進(jìn)行方差分析，P《0.05。數(shù)據(jù)分析前進(jìn)行正態(tài)性分布檢測(cè)。凡不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，修正后再進(jìn)行分析。繪圖采用Sigm即lot9.0軟件。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)密毛兜蘭種子成熟度試驗(yàn)?zāi)康牟煌N子成熟度是否影響密毛種子萌發(fā)。采密毛兜蘭授粉后120、130、140、150、160、170、180、190、200d和300d的蒴果，平均每處理取2個(gè)蒴果，交叉試驗(yàn)，以降低蒴果間差異性所造成的影響。于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將蒴果剖開(kāi)后，用鑷子將種子均勻地刮入培養(yǎng)基內(nèi)。培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基加蔗糖20g1—1，AClgl—、椰子汁100m11—1。種子分別在培養(yǎng)20、40、60d和80d后隨機(jī)采取100粒種子置于解剖顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)胚的萌發(fā)率。萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為胚吸水膨大，并形成白色原球體(protocorm)。大約100d后原球莖轉(zhuǎn)綠，重新測(cè)量原球莖大小，用來(lái)做下一步幼苗生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。200d后，測(cè)量幼苗的葉片。密毛兜蘭培養(yǎng)基化合物成分實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃姆N培養(yǎng)基里的不同化合物成分對(duì)密毛種子和原球莖生長(zhǎng)萌發(fā)的影響。300d種子置于KC，VW，1/4MS和1/2MS四種不同培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基添加蔗糖20gl—、AClg1—1，椰子汁IOOml1—1。種子萌發(fā)率和原球莖生長(zhǎng)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)如上。密毛兜蘭碳源實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌奶菍?duì)密毛種子萌發(fā)和原球莖生長(zhǎng)的影響。以授粉后300d之蒴果進(jìn)行，基本培養(yǎng)基+椰子汁100ml"，再各添加四種碳源蔗糖20gl—、葡萄糖20gl—、麥芽糖20g"，甘露醇20g1—1。種子萌發(fā)率和原球莖生長(zhǎng)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)如上。密毛兜蘭有機(jī)添加物實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌挠袡C(jī)添加物對(duì)密毛種子萌發(fā)和原球莖生長(zhǎng)的影響。以授粉后300d之蒴果進(jìn)行，基本培養(yǎng)基+蔗糖20g"，再分別添加馬鈴薯泥IOOgl—M弗手瓜泥100g"與蘋果泥100g"和LH水解乳蛋白4gl—、椰子汁100ml1—1。數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0軟件LSD測(cè)試進(jìn)行方差分析，P《0.05。數(shù)據(jù)分析前進(jìn)行正態(tài)性分布檢測(cè)。凡不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，進(jìn)行修正后再分析。繪圖采用Sigm即lot9.0軟件。結(jié)果密毛兜蘭種子成熟度試驗(yàn)結(jié)果密毛兜蘭授粉后120d，130d，140d在接種40d后種子仍未萌發(fā)。200d的種子在接種40d后萌發(fā)率為13X，80d已達(dá)到31.33%。300d種子，在40d時(shí)萌發(fā)率為0%，在80d萌發(fā)率僅13.33X。從授粉到接種，密毛兜蘭種子成熟度最少需達(dá)到150d才能接種進(jìn)行萌發(fā)(見(jiàn)表1、圖1)。表1密毛兜蘭種子成熟度對(duì)萌發(fā)率的影響(A，B，C)不同字母表示處理間存在著極其顯著差異，P《0.01<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>培養(yǎng)基化合物成分試驗(yàn)結(jié)果a密毛兜蘭的種子在較低氮、較低鹽濃度下萌發(fā)，以KC培養(yǎng)基為佳，培養(yǎng)80d達(dá)到56X，與其他三種培養(yǎng)基相比，效果極其顯著，其次是VW，1/4MS。1/2MS培養(yǎng)基而相對(duì)較差，這三種培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)效果不顯著。b密毛兜蘭的原球莖在100d后觀察到VW的原球莖大2.6mm2，特別是根粗長(zhǎng)，已見(jiàn)密布根毛。接入180d的植株在VW培養(yǎng)基葉長(zhǎng)已達(dá)到O.7cm。VW的原球莖明顯大于1/2MS的，但是與1/4MS、KC培養(yǎng)基原球莖的差別不大(圖2、圖5)。圖5不同培養(yǎng)基化合物成分對(duì)密毛兜蘭萌發(fā)率的影響。a方差分析前先將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換，以符合正態(tài)分布，方差分析后再轉(zhuǎn)為原始數(shù)據(jù)作為圖例說(shuō)明。b(a，b，c)不同字母表示處理間存在著顯著差異，P《0.05，(A，B，C)不同字母表示處理間存在著極其顯著差異，P《0.01?？潭绕骄怠罉?biāo)準(zhǔn)偏差。密毛兜蘭碳源實(shí)驗(yàn)結(jié)果a接100d后，密毛兜蘭種子萌發(fā)率在葡萄糖培養(yǎng)基中達(dá)到最高(16%)，效果明顯比其他三種好，萌發(fā)率幾乎是蔗糖萌發(fā)率2倍。而甘露醇效果最差(0.08%)。b在葉片生長(zhǎng)方面，葡萄糖比甘露醇效果要顯著；而葡萄糖、蔗糖、麥芽糖三者無(wú)顯著區(qū)別(見(jiàn)圖3，圖6)。圖6不同的碳源對(duì)密毛兜蘭萌發(fā)和植株生長(zhǎng)的影響。a方差分析前先將萌發(fā)率原始數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換，葉長(zhǎng)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根倒數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行開(kāi)方，以符合正態(tài)分布，方差分析后再轉(zhuǎn)為原始數(shù)據(jù)作為圖例說(shuō)明。b(a，b，c)不同字母表示處理間存在著顯著差異，P《0.05，(A，B，C)不同字母表示處理間存在著極其顯著差異，P《0.01。刻度平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。有機(jī)添加物試驗(yàn)結(jié)果a密毛兜蘭的種子在椰子汁培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高。蘋果泥和土豆泥的萌發(fā)率少于3%，佛手瓜汁和LH為0X。b密毛兜蘭的原球莖生長(zhǎng)過(guò)程中，LH培養(yǎng)基里長(zhǎng)的最慢，蘋果泥和土豆泥效果比LH好，但是這四種之間的葉長(zhǎng)寬并沒(méi)有區(qū)別。佛手瓜泥與水解乳蛋白培養(yǎng)基效果均不理想(見(jiàn)圖7)。圖7不同的有機(jī)添加物對(duì)密毛兜蘭萌發(fā)和植株生長(zhǎng)的影響，(a，b，c)不同字母表示處理間存在著顯著差異，P《0.05?？潭绕骄怠罉?biāo)準(zhǔn)偏差。2.2.8結(jié)果2.2.8.2激素誘導(dǎo)芽增值實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分裂素和細(xì)胞生長(zhǎng)素的配比影響兜蘭芽增值的芽數(shù)和芽大小。3個(gè)月內(nèi)統(tǒng)計(jì)芽數(shù)量翻倍的激素水平如下(每瓶3個(gè)小植株)密毛兜蘭——BA3.0mg"+NAA1.0mg"，BA5.0mgl—'+NAA0.5mgl—、BA6.0mgl—'+NAA0.1mgl—1(見(jiàn)表2，圖4激素誘導(dǎo)兜蘭植物的芽增殖)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了密毛兜蘭種子成熟度、培養(yǎng)基、碳源、天然添加劑對(duì)密毛兜蘭種子萌發(fā)、原球莖和植株生長(zhǎng)有明顯影響120d、130d、140d種子不能萌發(fā)；隨著種子每推遲10d成熟，種子萌發(fā)率隨之提高；200d的種子達(dá)到萌發(fā)最高點(diǎn)；在KC培養(yǎng)基接種40d達(dá)到最高萌發(fā)率，而VW培養(yǎng)基的原球莖直徑最長(zhǎng)；葡萄糖有利于種子萌發(fā)和葉的生長(zhǎng)，其次是蔗糖、麥芽糖和甘露醇；10%椰子汁是最好的種子萌發(fā)天然添加劑，而土豆泥、蘋果泥有利于葉的生長(zhǎng)，相對(duì)差的是佛手瓜泥和LH。證明了激素濃度對(duì)密毛兜蘭的芽繁殖率有顯著影響密毛兜蘭在BA5.Omg"+NAA0.5mgl—1水平能達(dá)到增殖率100%。接入培養(yǎng)基后3個(gè)月進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)a方差分析前先原始數(shù)據(jù)進(jìn)行自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，以符合正態(tài)分布，方差分析后再轉(zhuǎn)為原始數(shù)據(jù)作為圖例說(shuō)明。b(a，b，c)不同字母表示處理間存在著顯著差異，P《0.05?？潭绕骄怠罉?biāo)準(zhǔn)偏差。表2不同的激素組合誘導(dǎo)芽增值實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求密毛兜蘭的無(wú)菌種子萌發(fā)和幼苗增殖方法，選取密毛兜蘭開(kāi)花母株進(jìn)行人工授粉，取授粉后200天的果實(shí)，刮去果皮上的細(xì)毛，浸泡在75％的酒精30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒15分種，無(wú)菌水沖洗4-5次后切開(kāi)果實(shí)，將白色胚接種到KC培養(yǎng)基添加20％葡萄糖和10％椰子汁的培養(yǎng)基里，40天種子萌發(fā)后再轉(zhuǎn)接到VW培養(yǎng)基添加20％葡萄糖和10％土豆泥的培養(yǎng)基里，待形成整株后繼代培養(yǎng)在1/4MS培養(yǎng)基添加20％葡萄糖以及6-芐基嘌呤5毫克/升和萘乙酸0.5毫克/升中，或者1/4MS培養(yǎng)基添加6-芐基嘌呤6毫克/升和萘乙酸0.1毫克/升中，當(dāng)試管苗長(zhǎng)至3-4厘米時(shí)，轉(zhuǎn)移到室內(nèi)自然光下煉苗10天，取出后洗凈根部培養(yǎng)基，將幼苗轉(zhuǎn)移至裝有滅菌的泥炭蘚培養(yǎng)袋內(nèi)，放置于濕度為70％-75％的溫室1個(gè)月，最后移入2∶2∶1的火山石∶蕨根∶水苔的混合基質(zhì)中，放置在濕度高于70％的有遮陰網(wǎng)的溫室里。全文摘要密毛兜蘭的無(wú)菌種子萌發(fā)和幼苗增殖方法，利用無(wú)菌播種的方法獲得大量試管苗，并利用試管苗進(jìn)行增殖，通過(guò)生根培養(yǎng)能形成完整植株。具有萌發(fā)率高，出苗快，苗壯，種苗品質(zhì)好，生長(zhǎng)快速等優(yōu)勢(shì)?？朔F(xiàn)有技術(shù)兜蘭無(wú)菌播種技術(shù)萌發(fā)率低，成苗率低，其無(wú)性繁殖難，難以進(jìn)行大規(guī)模的商品化生產(chǎn)的技術(shù)難題。文檔編號(hào)A01G31/00GK101720672SQ201010039120公開(kāi)日2010年6月9日申請(qǐng)日期2010年1月5日優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日發(fā)明者程治英,龍春林,龍波申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所