專利名稱：兜蘭DEFICIENS(DEF)-like MADS-box基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中的基因領(lǐng)域，具體涉及兜蘭i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列。
背景技術(shù)：
在真雙子葉植物中，花器官四輪的排列依次為最外輪為花萼，第二輪為花瓣，第三輪為雄蕊，第四輪為心皮(Theissen，2001)。隨著各種不同的雙子葉植物花發(fā)育的研究， 經(jīng)典花發(fā)育的ABC模型用來解釋這些發(fā)育機(jī)理(Sctiwarz-Sommer et al.，1990 ；Bowman et al. ,1991 ；Coen和MeyerOWitz，1991)，該模型包括的主要內(nèi)容為四輪花器官的發(fā)育是A、B 和C三類功能基因不同組合表達(dá)的結(jié)果，A類基因單獨(dú)控制萼片的發(fā)育，AB類基因聯(lián)合控制花瓣的發(fā)育，BC類基因聯(lián)合控制雄蕊的發(fā)育，C類基因單獨(dú)控制心皮的發(fā)育；其中A和C類基因相互拮抗(Coen 和 Meyerowitz 1991 ；Theissen 和 Saedler 2001 ；Theissen，2001 )。隨著ABC模型的發(fā)展，擴(kuò)展到D類基因控制胚珠的發(fā)育(Colombo et al.，1995)，以及E類基因參與決定花瓣、雄蕊、心皮和胚珠的發(fā)育，即最終的AB⑶E模型(Pelaz et al. ,2000 ；Honma 和 Goto，2001 ;Theissen，2001)。在擬南芥中，APETALA1 (API)和 APETALA2 (AP2)屬于 A 類基因，APETALA3 (AP3)和PISTILLATA (PI)屬于B類基因，AGAM0US (AG)屬于C類基因 (Mandel et al. ,1992 Jofuku et al. ,1994 ； Drews et al. ,1991 ；Weigel禾口Meyerowitz 1994 ；Rounsley et al.，1995)。APl，AP3, PI 和 AG 是在花發(fā)育中起重要作用的 MADS-box 基因，它們編碼的MADS-box蛋白，都在N端包含1個保守的DNA結(jié)合域(MADS-box結(jié)構(gòu)域) (Theifien禾口Saedler,1995 ；Purugganan et al. ,1995 ；Rounsley et al. , 1995 ；TheiBen et al.，2000)。在蘭科(Orchidaceae)植物中，MADS-box基因的研究目前主要集中在蝴蝶蘭屬 {Phalaenopsis) (Chen et al. , 2007 ；Guo et al. , 2007 ；Song et al. ,2006 ；Tsai et al.，2004，2005)、石斛蘭屬 Ofez7iZroAiws) (Skipper et al.，2005，2006 ;Yu 和 Goh，2000a， 2000b)、文心蘭屬(itocii/i腫)(Thiruvengadam 和 Yang，2009)和玉鳳花屬 0 力) (Kim et al.，2007)等(Lu et al.，1993 ;Mondrag0n_Palomino 和 Theifien，2008)，然而兜 ^MiPaphiopedilim Pfitz.)植物的MADS-box基因的研究報道則鮮見。,J^APaphiopedilum spp.)，又叫拖鞋蘭，屬于蘭科兜蘭屬植物，其花形奇特，花大色艷，具有很高的盆栽觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值。目前，兜蘭是重要的商業(yè)洋蘭之一，在洋蘭花卉市場中占有舉足輕重的地位。因此，研究兜蘭花發(fā)育的分子機(jī)理也具有十分重要的意義。而分離和克隆兜蘭花發(fā)育控制相關(guān)的MADS-box基因，進(jìn)一步鑒定MADS-box蛋白的功能，可為闡明兜蘭花發(fā)育的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種兜蘭i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因，該基因是一個與兜蘭花發(fā)育相關(guān)的MADS-box基因。
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種兜蘭/^F-Wfc勸Λ -box基因編碼的多肽。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種獲取兜蘭/^F-Wfc勸Λ -box基因克隆的方法。為了解決上述技術(shù)問題，一方面，本發(fā)明提供了一種分離出的兜蘭i^F-like MADS-box基因，具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。所述的兜蘭i^F-like MADS-box基因編碼框的位置位于73bp_747bp，在73bp處有起始密碼子ATG，在745bp處有終止密碼子TGA，在1010 bp處有polyA附加信號，該序列無內(nèi)含子，具有675 bp完整的開放讀碼框，編碼2M個氨基酸的多肽。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兜蘭i^F-like MADS-box基因在NCBI網(wǎng)站上用Blast 軟件進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明，該cDNA序列與爪唇蘭^ahate)、芳香綬草 (.Spiranthes odorata )>ixBf ^^115 ^ iPhragmipedium longifolium)禾口香子蘭(Kafli/^/a
)的全長i^F-like MADS-box基因的cDNA序列同源性分別高達(dá)85%，84%, 82%和 78%。ORF Finder分析表明，該基因cDNA全長1039bp，在73bp處有起始密碼子ATG，在745bp 處有終止密碼子TGA，在IOlObp處有polyA附加信號，具有675bp完整的開放讀碼框，編碼 224個氨基酸。該cDNA序列編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明該氨基酸序列具有典型的MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域(見圖3)，與長葉美洲兜蘭、芳香綬草、爪唇蘭和香子蘭的i^F-like MADS-box基因編碼的蛋白序列的同源性分別為91%、擬％、80%和 78%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該兜蘭MADS-box基因?qū)儆诨ㄆ鞴侔l(fā)育B類基因的i^F亞家族 (見圖4)。另一方面，本發(fā)明還提供了一種由兜蘭i^F-like MADS-box基因編碼的多肽，該多肽具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明還提供了一種兜蘭i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因在其花器官中表達(dá)模式的分析方法，包括如下步驟
分別提取兜蘭花的子房、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱，以及苞葉的總RNA，再將不同樣品的總 RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈；
根據(jù)核苷酸序列SEQ ID N0. 1，設(shè)計(jì)如下引物作為Real-time PCR的引物來擴(kuò)增目的片段長為222bp的特異區(qū)段
DEF F2 (5，— 3’) AGCCCGATTTAGGGATACAA<SEQ ID NO. 10>， DEF R2 (5，— 3’) ATACTCTTGGCGTCGGTGGA<SEQ ID Ν0· 11>， 以蘭花Tubu 1 in為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異引物 Tubulin- & — 3' ) GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG<SEQ ID NO. 12>， Tubul— 3’) GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG<SEQ ID NO. 13>， 擴(kuò)增長為130 bp目的片段；
根據(jù)Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)兜蘭i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因在各花器官中的表達(dá)量進(jìn)行表達(dá)模式的分析。另外，本發(fā)明還提供了一種獲取兜蘭i^F-like MADS-box基因克隆的方法。具體而言，本發(fā)明是以蘭科兜蘭屬植物中的同色兜蘭[A concolor (Lindl.) Pfitz.]為實(shí)驗(yàn)材料，通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)1、總RNA的提取
取同色兜蘭的花，使用如下的提取步驟
將樣品于液氮中研成粉末，按適當(dāng)樣品的量迅速加入Solution D 500 μ 1，水飽和酚 500 “1，3 11醋酸鈉(？!1 5.2)200 μ 1,4 M β-巰基乙醇50 μ 1，充分振蕩混勻，室溫放置 1 min;加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩1 min ；4 °C，12 000 g離心10 min，小心吸取上清液至另一無RNase的離心管中；加入二氧化硅懸浮液100 μ 1，無水乙醇200 4 1，3 11醋酸鈉(？!1 5.2)200 μ 1，用微量移液器緩慢混勻，室溫，12 000 g離心1 min，棄上清；加入70%乙醇1 ml，用移液器吸打混勻，室溫，12 000 g離心1 min，棄上清，重復(fù)2次；室溫干燥8-10 min, 加入20-50 μ 1滅菌雙蒸水，室溫孵育5-10 min,室溫，12 000 g離心5-10 min ；將RNA上清液吸取至另一無RNase的離心管中。測定RNA的濃度和電泳檢測RNA的質(zhì)量(見圖1A)。 將RNA置于-80 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?. cDNA第一鏈的合成和LD-PCR法擴(kuò)增全長雙鏈cDNA
取同色兜蘭花的總 RNA1. 0μ g，按照 SMART PCR cDNA Synthesis Kit (CLONTECH, U. S. Α.)的操作步驟，先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后用LD-PCR法擴(kuò)增全長雙鏈cDNA。3.設(shè)計(jì)引物和合成引物
從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載近源物種(如長葉美洲兜蘭、芳香綬草、爪唇蘭、春蘭等) DEF-Iike MADS-box基因編碼的氨基酸序列，用CLUSTAL X (1.8)軟件進(jìn)行多序列比對，確定氨基酸序列保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)兼并引物，擴(kuò)增片段大小約為380bp。引物設(shè)計(jì)后由上海英俊生物技術(shù)公司合成。兼并引物序列為
DEF Fl (5’ — 3’) ATGGGGAGGGGGAAGATAGAG<SEQ ID NO. 3> ； DEF Rl (5，— 3’):CTCAAGACCGCGCAGTTCCTT<SEQ ID Ν0· 4>。4.兜蘭i^F-1 ike MADS-box基因cDNA全長序列的克隆
以上述2合成的cDNA第一鏈為模板，用上述3設(shè)計(jì)的兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1. 0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，然后從凝膠中割膠純化回收目的DNA條帶 (見圖2A)。再將純化的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T easy載體中，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆過夜培養(yǎng)。經(jīng)菌液PCR電泳檢測后，結(jié)果為陽性的菌液送至上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序。根據(jù)測序獲得的cDNA中間片段，用ft~imer5. 0軟件設(shè)計(jì)特異基因引物，再利用 cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對目的基因的3，端和5’端進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在3’RACE中，以上述2合成的全長雙鏈cDNA為第一次PCR反應(yīng)的模板，再將第一次PCR產(chǎn)物作為第二次PCR反應(yīng)的模板。由接頭引物和3’ RACE基因特異引物分別進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，然后從凝膠中割膠純化回收目的DNA條帶(見圖2B)。3，RACE 接頭引物(5，— 3，)AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(3(i) N^1N(N=A, C, G, 或 T ； Nh=A, G,或 C) <SEQ ID NO. 5> ；
3，RACE 基因特異引物(5，— 3，) :GAGGGAGATAAGCCAAAGGA<SEQ ID Ν0· 6>。在5’ RACE中，以上述2合成的全長雙鏈cDNA為第一次PCR反應(yīng)的模板，再將第一次PCR產(chǎn)物作為第二次PCR反應(yīng)的模板。利用接頭外側(cè)引物和基因特異引物進(jìn)行第一次 PCR擴(kuò)增，然后用接頭內(nèi)側(cè)引物和基因特異引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，最后從凝膠中割膠純化回收目的DNA條帶(見圖2C)。5，RACE 接頭外側(cè)引物(5，一 3，) CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<SEQ ID NO. 7> ；
5，RACE 接頭內(nèi)側(cè)引物(5，一 3，):AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<SEQ ID NO. 8> ； 5，RACE 基因特異引物(5，— 3，) :TCCCTCCTCAGATTGTGGTT<SEQ ID NO. 9>。所得到的PCR產(chǎn)物用1. 0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，將PCR產(chǎn)物純化后，連接到pGEM-T easy載體中，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆過夜培養(yǎng)。經(jīng)菌液PCR電泳檢測后，結(jié)果為陽性的菌液送至上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序。測序所得的序列再與保守區(qū)序列設(shè)計(jì)兼并引物擴(kuò)增得到的cDNA中間片段的序列利用CLUSTAL X (1. 8)軟件進(jìn)行拼接。5.兜蘭i^F-like MADS-box基因序列的生物信息學(xué)分析
將拼接的測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用Blast軟件進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明，該 cDNA序列與爪唇蘭(Gongora galea ia )、芳香綬草(Spiran thes odora ia )、長葉美洲兜 ^XPhragmipedium longifolium)禾口香子蘭(Kafli/^/a planifolia)白勺全長 DEF-like MADS-box基因的cDNA序列同源性分別高達(dá)85%，84%, 82%和78%。ORF Finder分析表明， 該基因cDNA全長1039bp，在73bp處有起始密碼子ATG，在745bp處有終止密碼子TGA，在 IOlObp處有polyA附加信號，具有675bp完整的開放讀碼框，編碼2M個氨基酸。該cDNA 序列編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明該氨基酸序列具有典型的 MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域(見圖3)，與長葉美洲兜蘭、芳香綬草、爪唇蘭和香子蘭的i^F-like MADS-box基因編碼的蛋白序列的同源性分別為91%、擬％、80%和78%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該兜蘭MADS-box基因?qū)儆诨ㄆ鞴侔l(fā)育B類基因的i^F亞家族(見圖4 )。6.兜蘭i^F-1 ike MADS-box基因在其花器官中的表達(dá)模式分析
分別提取兜蘭花的子房、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱，以及苞葉的總RNA (見圖1B)，再將不同樣品的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，根據(jù)前述的核苷酸序列SEQ ID N0. 1， 設(shè)計(jì)半定量 RT-PCR 弓丨物..DEF F2 (5，一 3，) AGCCCGATTTAGGGATACAA, DEF R2 (5，一 3，) ATACTCTTGGCGTCGGTGGA,目的片段長為 222bp。以蘭花 Tubulin 為內(nèi)參基因， 引物序列為 Tubulin-Y 飭’ —3，) GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG, Tubul— 3，)
GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG,目的片段長約為 130bp。半定量 RT-PCR 結(jié)果表明，Tl/to/i/ 在同色兜蘭花的各個器官中表達(dá)量變化不大，但i^F基因在花瓣(PE)和唇瓣(L)中的表達(dá)量最高，在萼片(SE)中的表達(dá)量次之，在蕊柱(CO)中的表達(dá)量又較苞葉(B)中的高，在子房 (0)中的表達(dá)量最低，幾乎檢測不到(見圖5)。從上述結(jié)果分析表明，本發(fā)明的兜蘭i^F-1 ike MADS-box基因是一個新的與兜蘭花發(fā)育相關(guān)的基因，該基因既參與兜蘭的營養(yǎng)生長，又參與兜蘭的生殖生長。因此，本發(fā)明提供的兜蘭i^F基因，不僅有利于揭示兜蘭花器官發(fā)育的分子機(jī)制，還可為基因工程改良植物的生命進(jìn)程，尤其是植物的花發(fā)育提供了一定的依據(jù)。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施方式，任何在本發(fā)明基本精神上的改進(jìn)或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的范圍。


圖1總RNA電泳圖。圖1A，泳道F，同色兜蘭花的總RNA ；圖1B，泳道0、B、SE、PE、 L和CO分別為同色兜蘭的子房、苞葉、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱的總RNA。圖 2 兜蘭 i^F-like MADS-box 基因 cDNA 全長的克隆。M，為 DL2000 DNA Marker ； 圖2A，泳道1，兼并引物擴(kuò)增的PCR結(jié)果；圖2B，泳道2，3，Race PCR產(chǎn)物結(jié)果；圖2C，泳道 3，5，Race PCR產(chǎn)物結(jié)果。圖3兜蘭i^F-like MADS-box基因編碼的蛋白通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果。圖4兜蘭i^F-like MADS-box基因的氨基酸序列與其它物種B類主要MADS-box 基因的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。圖5兜蘭i^F-like MADS-box基因在其不同器官中的表達(dá)分析。M，為DL2000 DNA Marker ；0、B、SE、ΡΕ、L和CO分別代表同色兜蘭的子房、苞葉、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。實(shí)施例1 總RNA的提取
以同色兜蘭的花為實(shí)驗(yàn)材料，使用以下步驟提取總RNA
①將研缽和研棒用液氮預(yù)冷，迅速將樣品放入研缽中研成粉末后轉(zhuǎn)入液氮預(yù)冷的無 RNase的1. 5 ml的離心管中，按10 ml/g樣品的量迅速加入Solution D 500 μ 1，水飽和酚500 μ1，3Μ醋酸鈉(ρΗ 5.2) 200 μ 1,4 M β-巰基乙醇50 μ ，充分振蕩混勻，室溫放置1 min。②加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩1 min。③4 "C, 12 000 g離心10 min，小心吸取上清液至另一無RNase的1.5 ml的離心管中。④加入6 g/ml 二氧化硅100 μ 1，無水乙醇200 μ 1,3 M醋酸鈉(ρΗ 5.2)200
μ 1，用微量移液器緩慢混勻。室溫，12 000 g離心1 min，棄上清。⑤加入70%乙醇1 ml，用移液器吸打混勻，室溫，12 000 g離心1 min，棄上清。重
復(fù)2次。⑥室溫干燥8-10 min,加入20-50 μ 1滅菌雙蒸水，室溫孵育5_10 min。室溫，12
000g 離心 5-10 min。⑦小心將上清吸取至另一無RNase的1. 5 ml離心管中。⑧測0D260確定RNA的濃度，1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。⑨將溶解的RNA置于-80 ！冰箱保存?zhèn)溆谩?shí)施例2 cDNA第一鏈的合成和LD-PCR法擴(kuò)增全長雙鏈cDNA
cDNA 第一鏈的合成按照 SMART PCR cDNA Synthesis Kit (CL0NTECH, U. S. Α.)的操作步驟，取同色兜蘭花的總RNA l.Oyg，與反轉(zhuǎn)錄引物3，SMART⑶S Primer II A (12 μ Μ) 1 μ 1混合均勻，PCR儀上72°C，3min，接著42°C，2min，快速取出，放于室溫，然后加入 5 X First Strand Buffer 2μ 1, DTT (100 mM) 0. 25 μ 1, dNTP Mix (10 mM of each dNTP)
1μ 1, SMART II A Oligonucleotide (12 μ M) 1 μ 1, Rnase inhibitor 0. 25μ 1, PowerScript Reverse Transcriptase(IOOU) 1 μ 1，10 μ 1。β@禾呈j^》42。C 60min, 72°C 7 min，最后-20°C保存?zhèn)溆?。LD-PCR法擴(kuò)增全長雙鏈cDNA:將PCR儀預(yù)熱到95 °C，取2 μ 1稀釋后的 ss cDNA 作為反應(yīng)模板，Deionized H2O 82 μ 1, IOXAdvantage 2 PCR Buffer 10 μ 1, 50XdNTPdOmM of each dNTP) 2. 0μ 1, 5，PCR Primer II A(12 μ Μ) 2. 0μ 1, 50 X Advantage 2 Polymerase Mix 2. 0 μ 1，反應(yīng)體系為 100 μ 1。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95 "C Imin ；95 "C 15 s，65 "C 30 s，68 °C，6 min, 19 cycles。PCR 擴(kuò)增完后，保存于-20 °C備用。實(shí)施例3 設(shè)計(jì)引物和合成引物
從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載近源物種(如長葉美洲兜蘭、芳香綬草、爪唇蘭、春蘭等) DEF-Iike MADS-box基因編碼的氨基酸序列，用CLUSTAL X (1. 8)軟件進(jìn)行多序列比對， 確定氨基酸序列保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列MGRGKIE設(shè)計(jì)兼并引物i^F F 1 (5’一3’) ATGGGGAGGGGGAAGATAGAG,根據(jù)保守區(qū)序列 KELRGLE 設(shè)計(jì)兼并引物 i^F Rl (5，一 3，) CTCAAGACCGCGCAGTTCCTT ；PCR擴(kuò)增片段大小約為380bp。引物設(shè)計(jì)后由上海英俊生物技術(shù)公司合成。實(shí)施例4 兜蘭i^F-1 ike MADS-box基因cDNA全長序列的克隆
取上述合成的第一鏈cDNA 1.0μ 1為模板，用上述設(shè)計(jì)的兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10XLA Buffer (Mg2+ plus) 2. 5 μ l,dNTP Mix (2. 5mM of each dNTP) 4. 0 μ 1,LA taq (5υ/μ 1) 0. 2 μ 1, Deionized H2O 15. 3 μ 1，10 μ M 引物i^F Fl 和i^F Rl 各 1· 0 μ 1， 反應(yīng)體系為 25 μ 1。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C 4 min ；94°C 30 s，59°C 30 s，72°C，l min, 32 cycles ;72°C, 7 min。所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1. 0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，然后從凝膠中割膠純化回收目的大小的DNA條帶。再將純化的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T easy載體中， 轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆過夜培養(yǎng)。經(jīng)菌液PCR電泳檢測后，結(jié)果為陽性的菌液送至上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序。根據(jù)測序獲得的cDNA中間片段，用ft~imer5. 0軟件設(shè)計(jì)特異基因引物，再利用 RACE技術(shù)對目的基因的3’端和5’端進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在3’RACE中，以上述合成的全長雙鏈cDNA稀釋后作為第一次PCR反應(yīng)的模板，再將第一次PCR產(chǎn)物稀釋后作為第二次PCR反應(yīng)的模板。由接頭引物和3’ RACE基因特異引物分別進(jìn)行兩次 PCR 反應(yīng)。3，RACE 接頭引物(5，一 3，)AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(3。) N^1N(N=A, C, G,或 T; NfA，G,或 C) ；3，RACE 基因特異引物(5，一 3，) GAGGGAGATAAGCCAAAGGA。反應(yīng)體系為10XLA Buffer (Mg2+ plus) 2. 5 μ 1，dNTP Mix (2. 5mM of each dNTP) 4. 0 μ 1，LA taq (5U/ μ 1) 0. 2 μ 1, Deionized H2O 15. 3 μ 1，10 μ M 3’ RACE接頭引物和3’ RACE基因特異引物各1.0 μ 1，反應(yīng)體系為25 μ 1。PCR反應(yīng)程序?yàn)?940C 4 min ；94°C 30 s，56°C 30 s，72°C，l min, 33 cycles ；72°C,7 min。在5’RACE中，以上述合成的全長雙鏈cDNA稀釋后作為第一次PCR反應(yīng)的模板，再將第一次PCR產(chǎn)物稀釋后作為第二次PCR反應(yīng)的模板。利用接頭外側(cè)引物和基因特異引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，然后用接頭內(nèi)側(cè)引物和基因特異引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。5’ RACE 接頭外側(cè)引物(5’一 3’)
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT ;5’ RACE 接頭內(nèi) ^ 引物(5，一 3，):AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT ；5，RACE 基因特異引物(5，一 3，) TCCCTCCTCAGATTGTGGTT。反應(yīng)體系為10XLA Buffer (Mg2+ plus) 2. 5 μ 1, dNTP Mix (2. 5mM of each dNTP) 4. 0 μ 1，LAtaq (5U/ μ 1) 0. 2 μ 1, Deionized H2O 15. 3 μ 1，10 μ M 5’ RACE接頭外側(cè)引物(5’ RACE接頭內(nèi)側(cè)引物，第二次PCR)和5’ RACE基因特異引物各 1. 0μ 1,反應(yīng)體系為 25μ 1。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C 4 min ;94°C 30 s，58°C 30 s，72°C，l min,33 cycles ；72°C,7 min。所得到的PCR產(chǎn)物用1. 0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，將PCR產(chǎn)物純化后，連接到pGEM-T easy載體中，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆過夜培養(yǎng)。經(jīng)菌液PCR電泳檢測后，結(jié)果為陽性的菌液送至上海英俊生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序。測序所得的序列再與保守區(qū)序列設(shè)計(jì)兼并引物擴(kuò)增得到的cDNA中間片段的序列利用CLUSTAL X (1. 8)軟件進(jìn)行拼接。實(shí)施例5 兜蘭i^F-like MADS-box基因序列的生物信息學(xué)分析
將拼接的測序結(jié)果在NCBI用Blast軟件進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明，該基因的cDNA序列與爪唇蘭(G ^ahaia)、芳香綬草仏oi/oraia)、長葉美洲兜蘭0°. longifoliun^M^ 子蘭(K plani folia )的全長i^F-like MADS-box基因的cDNA序列同源性分別高達(dá)85%， 84%, 82%和78%。ORF Finder分析表明，該基因cDNA全長1039bp，在73bp處有起始密碼子 ATG,在745bp處有終止密碼子TGA，在IOlObp處有polyA附加信號，具有675bp完整的開放讀碼框，編碼2M個氨基酸。該基因cDNA序列編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast 分析，結(jié)果表明該氨基酸序列具有典型的MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域，與長葉美洲兜蘭仏 Iongifolium)、芳香綬草(5 odorata )、爪唇蘭(β. galeata )和香子蘭(K planifolia )的 DEF-Iike MADS-box基因編碼的蛋白序列的同源性分別為91%、擬％、80%和78%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該兜蘭MADS-box基因?qū)儆诨ㄆ鞴侔l(fā)育B類基因的i^F亞家族。實(shí)施例6 兜蘭i^F-1 ike MADS-box基因在其不同器官中的表達(dá)模式分析分別提取同色兜蘭花的子房、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱，以及苞葉的總RNA，再將不同樣
品的總 RNA (1 μ g)分別反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 第一鏈(PrimeScript Reverse Transcriptase kit, Takara)。根據(jù)前述的核苷酸序列SEQ ID NO. 1，設(shè)計(jì)半定量RT-PCR引物F2 (5，— 3，) AGCCCGATTTAGGGATACAA, DEF R2 (5，— 3，) ATACTCTTGGCGTCGGTGGA,目的片段長為222bp。以蘭花T^Wi/ 為內(nèi)參基因，引物序列為Tubulin-Y (5，一 3，) GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG, Tubulin-R (5，— 3，) GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG，目的片段長約為130bp。以第一鏈cDNA稀釋后作為半定量RT-PCR的反應(yīng)模板。反應(yīng)體系為 25 μ 1，包含 IOXBuffer (Mg2+ plus) 2. 5μ 1, dNTP Mix (10 mM of each dNTP) 1. 0μ 1, r taq (5U/μ 1) 0. 2μ 1, Deionized H2O 17. 3 μ 1，10 μ M 正反向基因特異引物各 1. 0 μ 1， 稀釋的 cDNA 第一鏈 2. 0μ 1。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C 4 min ；94°C 30 s，58°C 30 s，72°C，45 s,30 cycles ；72°C,7 min。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種分離出的兜蘭i^F/CTBW (DEF)-\i\Q MADS-box基因，其特征在于，具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的兜蘭i^F/CTBW(DEF)-Iike MADS-box基因，其特征在于，編碼框的位置位于73bp-747bp，在73bp處有起始密碼子ATG，在745bp處有終止密碼子TGA，在 1010 bp處有polyA附加信號，該序列無內(nèi)含子，具有675 bp完整的開放讀碼框，編碼224 個氨基酸的多肽。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述兜蘭i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因編碼的多肽，其特征在于，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
4.一種兜蘭i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因在其花器官中表達(dá)模式的分析方法，其特征在于包括如下步驟分別提取兜蘭花的子房、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱，以及苞葉的總RNA，再將不同樣品的總 RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈；根據(jù)核苷酸序列SEQ ID N0. 1，設(shè)計(jì)如下引物作為Real-time PCR的引物來擴(kuò)增目的片段長為222bp的特異區(qū)段DEF F2 (5，— 3’) AGCCCGATTTAGGGATACAA<SEQ ID NO. 10>， DEF R2 (5，— 3’) ATACTCTTGGCGTCGGTGGA<SEQ ID Ν0· 11>， 以蘭花Tubu 1 in為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異引物 Tubulin- & — 3' ) GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG<SEQ ID NO. 12>， Tubul— 3’) GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG<SEQ ID NO. 13>， 擴(kuò)增長為130 bp目的片段；根據(jù)Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)兜蘭i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因在各花器官中的表達(dá)量進(jìn)行表達(dá)模式的分析。
全文摘要
本發(fā)明提供一種兜蘭DEFICIENS(DEF)-likeMADS-box基因序列及由該基因序列編碼的多肽。另外，本發(fā)明還公開了獲取兜蘭DEF-likeMADS-box基因克隆的方法，該方法是以近源物種DEF-likeMADS-box基因的氨基酸保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物，從兜蘭花中提取總RNA，用LD-PCR法擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到兜蘭的DEF-likeMADS-box基因的全長cDNA序列。本發(fā)明的兜蘭DEF-likeMADS-box基因是一個新的與兜蘭花發(fā)育相關(guān)的基因，該基因既參與兜蘭的營養(yǎng)生長，又參與兜蘭的生殖生長。因此，本發(fā)明提供的兜蘭DEF基因，不僅有利于揭示兜蘭花器官發(fā)育的分子機(jī)制，還可為基因工程改良植物的生命進(jìn)程，尤其是植物的花發(fā)育提供了一定的依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102260681SQ20111015897
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者呂復(fù)兵, 操君喜, 朱根發(fā), 李冬梅 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所