專利名稱：模擬老年癡呆病變的非人靈長類動物模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種老年癡呆病變動物模型的建立方法
背景技術(shù)：
老年癡呆(AD)模型的最突出的病理變化是基底前腦膽堿能細(xì)胞的大量喪失和膽 堿能神經(jīng)功能下降。膽堿能系統(tǒng)損傷模型研究主要著眼于模擬AD的認(rèn)知缺損和前腦膽 堿能系統(tǒng)廣泛的功能損害。1976年P(guān)eter Davies發(fā)現(xiàn)癡呆病人的臨床癥狀和腦內(nèi)的特 殊膽堿能的缺失存在某種關(guān)聯(lián)，他開啟了現(xiàn)代神經(jīng)化學(xué)之門，因此是具有里程碑的意義的 (Davies and Maloney， 1976)。人們早就觀察到，老年癡呆患者腦組織中乙酰膽堿(Ach)數(shù) 量減少，皮層膽堿乙?；?CHAT)和乙酰膽堿酯酶(AchE)活性都降低。目前普遍認(rèn)為膽 堿能神經(jīng)元損傷和功能不全在老年性癡呆形成過程中有非常重要的作用。目前嚙齒類模型 主要有以下幾種 慢病毒致模。造模方法選用老年倉鼠(hamster)，應(yīng)用慢病毒以微量稀釋混懸液 經(jīng)立體定位儀接種于腦特定部位，如黑質(zhì)、紋狀體等，破壞膽堿能細(xì)胞。缺點可恢復(fù)，不是 永久的損傷。 —側(cè)海馬傘切斷致老年癡呆動物模型。造模機制海馬傘切斷造成膽堿能神經(jīng)能 通路的受損，產(chǎn)生類似于造成老年癡呆的膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的大量喪失、記憶障礙，膽堿能神 經(jīng)功能下降的效果。缺點本實驗?zāi)Ｐ碗m然很常用，也有效模擬了其病理特點，但是和自然 狀態(tài)下的特征還是有區(qū)別的，對動物造成了一定的物理損傷，而且切斷的部位很難把握，有 可能造成其它部位的神經(jīng)細(xì)胞也造成傷害，對實驗者的技術(shù)有相當(dāng)高的要求，目前已基本 不采用。 除了以上幾種模型外，還有興奮性氨基酸引起的老年癡呆模型、利用特定免疫毒 素選擇性地破壞基底前腦的膽堿能細(xì)胞，如192-IgG-S即orin。 1989年Kudo等通過注射基 底前腦與NGF相結(jié)合的白喉毒素來制造AD模型，通過NGF介導(dǎo)白喉毒素被帶入膽堿能細(xì) 胞，從而達(dá)到破壞膽堿能細(xì)胞的作用。 以tau蛋白的過度磷酸化為特征的AD動物模型。有關(guān)神經(jīng)元細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生 過磷酸化的機制十分復(fù)雜，目前催化蛋白磷酸化反應(yīng)的蛋白激酶(GSK23，CDK5和MAPK等) 與催化去磷酸化反應(yīng)的磷酸酯酶(PP1，PP2A，PP2B等)的相對活性失衡，被認(rèn)為是造成骨架 蛋白磷酸化的主要原因(Chun Lai Nieet al. ， 2007)。因此，蛋白激酶激動劑和抑制劑都可 以誘導(dǎo)tau蛋白異常、過度磷酸化，從而形成神經(jīng)纖維糾結(jié)，進(jìn)而誘發(fā)老年癡呆的形成。
岡田酸(0kadaic acid， 0A)損傷模型。0A選擇性地抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷 酸酯酶1A和2A的活性，并提高蛋白激酶PKC的活性，引起tau蛋白異常磷酸化，從而形成 神經(jīng)纖維糾結(jié)和老年斑的形成。優(yōu)點該模型能夠復(fù)制出AD的兩大病理改變tau過度磷 酸化引起的神經(jīng)纖維糾結(jié)，和老年斑，因此具有明顯的優(yōu)勢。 除了上述模型以外，還有腹腔注射AlCl3，引起AI3的聚集和tau蛋白的折疊。除 了鋁與AD的發(fā)生有關(guān)外，最新研究發(fā)現(xiàn)鋅、銅、鐵也可能與AD相關(guān)，并認(rèn)為A13的沉積和氧
3化還原反應(yīng)還受到銅、鐵、鋅的調(diào)節(jié)(Price et al. ， 1991)。缺點本模型采用的方式多是腹 腔注射鋁溶液，費時比較長，小鼠要用六個月的時間，制作麻煩，不能反應(yīng)年齡依賴性的A13 沉積的老年斑形成，膽堿能系統(tǒng)也是正常的。 與AP有關(guān)的AD動物模型。灌注模型(P-淀粉樣肽損傷模型)1991 年Kowall等發(fā)現(xiàn)成年大鼠皮層的AP沉積可以引起神經(jīng)元及其軸突相應(yīng)的病理改變， Richard也證實了 A13 1_40對鼠胚胎海馬神經(jīng)元具有毒性作用，因此A P灌注理論可以作為 制備AD模型的理論基礎(chǔ)，據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，老年動物對AI3反應(yīng)更敏感。這種模型也有 許多缺點(l)該模型需要注射AI3 ，注射本身會對腦組織形成穿透性損傷，注射次數(shù)越多 損傷越大；(2)要使大量的AP彌散性地分布到腦內(nèi)集仍有許多問題，用適當(dāng)?shù)妮d體有助于 的擴散(Mckee AC et al. ， 1998)。而且造模效果受多種因素的影響，如淀粉樣肽的純 度、組成，載體的類型和成份，注射位點的選擇，動物的個體差異等。 衰老認(rèn)知障礙動物模型?；谒ダ?，人們提出各種學(xué)說，比如氧化自由基增多和線粒 體破壞，從而引起細(xì)胞的大量凋亡，包括神經(jīng)細(xì)胞。衰老認(rèn)知障礙動物模型就是通過各種人工 或者自然的衰老方式制成老年癡呆模型。目前用老鼠做成的模型有乳糖損害模型。長期注射 D-半乳糖后所引起的多系統(tǒng)功能衰退等均與老齡動物相似，但是該法需時間較長且沒有老年 斑的形成。此外還有快速老化鼠，最先由竹田俊男通過對AKR/j自然變異小鼠進(jìn)行近交延代培 養(yǎng)得到一種自然快速老化小鼠(聶偉等，2000)。它具備和AD相似的病理表現(xiàn):AI3沉積，相關(guān) 的遞質(zhì)和酶活性改變，神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達(dá)明顯下降，腦內(nèi)與氧化應(yīng)激相關(guān)的酶活性改變， 線粒體功能改變，腦內(nèi)葡萄糖代謝障礙，免疫功能異常等(Shang YZ et al. ，2001)。
轉(zhuǎn)基因技術(shù)制作的AD模型。目前轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)取得卓有成效的進(jìn)展，與AD相 關(guān)的基因APP基因、早老素PSl及PS2基因、ApoE基因相關(guān)的基因突變、基因缺陷、轉(zhuǎn)基因的 AD鼠均已建成。根據(jù)成本、繁殖力等原因目前選用較多的實驗動物是小鼠。常用的轉(zhuǎn)基因 動物模型的制作程序如下引物的設(shè)計和靶基因的制備；質(zhì)粒的構(gòu)建；超排卵和取卵與重 組基因注入受精卵；植入假孕受體；模型的檢測與評價。目前制成的轉(zhuǎn)基因AD模型有與 PS1基因有關(guān)的AD模型。a. hPSl (L286V，H163R)表達(dá)人類PS1基因伴有L286V或者H163R 突變的，細(xì)胞內(nèi)有AI3 42沉淀，隨著年齡的增長會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能退化(Chui et al.， 1999)。 b.hPSl(I123T)表達(dá)特定位點插入的PSl基因，伴有I213T突變，有A P 42的積累。 (Nakano et al. ， 1999)等。除此之外，與ApoE及tau蛋白基因相關(guān)的AD小鼠模型都已建 成。三轉(zhuǎn)基因鼠3XTg-AD同時表達(dá)PSl(M146V)，APPsw和tau(P301L)，在tau蛋白異常磷 酸化或者裝配前就有AP樣沉淀形成，突觸功能消失，完全致病前認(rèn)知功能降低。(Oddo et al. ，2003)轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)點是轉(zhuǎn)基因動物模型可以在活體上研究某一特定致病基因的 作用，是研究AD的獨特而重要的模型。缺點是絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因動物模型能夠復(fù)制出類似 AD病人腦內(nèi)的部分病理變化，其中只有少數(shù)模型觀察到了學(xué)習(xí)記憶功能障礙，但距離AD尚 有一定差距，結(jié)果還不能令人滿意。但也有人報道，在轉(zhuǎn)基因鼠中觀察到了全部或部分的AD 的組織學(xué)的特征，如老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元退化等，取得了令人鼓舞的結(jié)果。目 前的轉(zhuǎn)基因模型大部分是移植了一個APP、PSl、PS2或tau蛋白等基因，與真正的由一組基 因控制的動物模型還有較大差距。目前的轉(zhuǎn)基因動物AD模型僅是部分取得成功，由于外源 基因的植入有可能影響一些基因的表達(dá)和調(diào)控，擾亂機體的內(nèi)環(huán)境，出現(xiàn)一系列抗病能力 差，繁殖力差等的特征。又因其價格昂貴，難以批量生產(chǎn)等原因，短期內(nèi)仍難以推廣使用。
非人靈長類動物在親緣關(guān)系上和人最接近，在組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理和代謝等方面與人類高度近似，是極其珍貴的實驗動物，其應(yīng)用價值遠(yuǎn)超過其他種屬的實驗動物。無論是
自發(fā)模型還是誘發(fā)模型，非人靈長類動物模型較嚙齒類能更好地模擬其病理變化，神經(jīng)生物學(xué)特性與人類非常相似，而且最重要的是，根據(jù)設(shè)計，非人靈長類經(jīng)過訓(xùn)練，可用于完成特定的與記憶有關(guān)的任務(wù)，用于評價認(rèn)知能力、情緒行為等的變化，這也是嚙齒類動物無法替代的，因而是研究該病的最理想的動物模型。非人靈長類動物對篩選治療老年癡呆的藥物也起著至關(guān)重要的作用。 因為甲醛是內(nèi)源性的，而我們?nèi)粘Ｉ钪幸步?jīng)常接觸到甲醛，因此有人提出老年癡呆可能與甲醛有關(guān)，最近赫榮橋等的研究顯示老年癡呆病人體內(nèi)的甲醛水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常老年人的甲醛水平。甲醛是甲醇的代謝產(chǎn)物之一，許多研究已經(jīng)表明甲醛通過加速神經(jīng)元凋亡在神經(jīng)元細(xì)胞中誘導(dǎo)了類似淀粉樣蛋白的微管束相關(guān)蛋白tau蛋白的聚集和折疊。tau蛋白是神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分。神經(jīng)纖維纏結(jié)是老年性癡呆癥的主要病理現(xiàn)象。低濃度的甲醛會引起tau的聚集，加拿大的試驗小組也證明低濃度甲醛會促進(jìn)AI3聚集，隨著對AD病因和發(fā)病機制研究的深入和相關(guān)知識的積累，靈長類AD動物模型將來會得到廣泛應(yīng)用，對能夠篩選得到具有良好開發(fā)前景的AD治療藥物及探索出治療AD更加有效的方法做出重要貢獻(xiàn)。 現(xiàn)有的關(guān)于甲醛與老年性癡呆癥相關(guān)聯(lián)的研究都是在機理方面，還沒有建立相關(guān)的老年性癡呆動物模型的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種模擬老年癡呆病變的非人靈長類動物模型的建立方法，該模型采用活體動物和甲醇來制作。 由于直接口服甲醛造成的傷害太大，容易造成實驗動物的死亡，所以選擇甲醇代替甲醛，甲醇在體內(nèi)經(jīng)過乙醇脫氫酶的作用下可以生成甲醛。
本發(fā)明方法按以下步驟進(jìn)行 讓沒有表現(xiàn)出老年癡呆病變癥狀的非人靈長類動物禁水，將體積百分比濃度為0. 5% 3%的甲醇水溶液、或該甲醇水溶液還溶有能讓動物產(chǎn)生喜好感的調(diào)味劑，讓動物連續(xù)自然飲用14天 365天，控制每天動物的甲醇攝入量為0. 5mg/kg 2mg/kg，得到老年癡呆病變的非人靈長類動物模型。 所說非人靈長類動物優(yōu)選恒河猴，最好是雄性恒河猴。讓動物產(chǎn)生喜好感的調(diào)味劑最好是糖。 本發(fā)明的積極效果按發(fā)明方法建立了活體非人靈長類動物模型。本發(fā)明提供的動物模型對研究該病和篩選治療老年癡呆的藥物可起重要作用。


附圖為實施例1中給藥前和給藥后恒河猴空間延遲任務(wù)成績的差異對比。
具體實施方式
實施例l。
材料選取4-8歲青年雄性恒河猴7只，體重3kg-llkg。其中4只健康猴用來做 行為實驗；3只殘疾猴用來試藥以確定甲醇的最大攝入量，避免健康猴超劑量死亡，降低實 驗成本。甲醇為天津富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)。 方法首先給動物禁水，每日將純的甲醇溶于水讓動物自己口服，如果猴子不喝可 適當(dāng)放少許白砂糖。據(jù)李來玉等關(guān)于甲醇在恒河猴體內(nèi)的代謝極其與毒性的關(guān)系一文報 道，恒河猴72小時內(nèi)三次給藥總劑量為9ml/kg致死率為100% (李來玉等，1991)，因此 每天按照0. 5-2ml/kg的劑量按照從高到低稀釋到清水中依次試藥，每個劑量一個月，觀察 其行為變化，用時半年(2ml/kg已喂三個月)，結(jié)果表明每天O. 5ml/kg， lml/kg， 1. 5ml/kg， 2ml/kg動物飲食均正常，且均未出現(xiàn)動物死亡。隨后給4只健康猴做行為測試，測定空間延 遲成績，給藥前和給藥后做對照，給藥劑量按照每天lml/kg上升到1. 5ml/kg，最后上升到 2ml/kg。 實驗結(jié)果實驗室給特定劑量的甲醇制作恒河猴老年癡呆模型，其給藥前、后空間 延遲任務(wù)成績已出現(xiàn)明顯的差異。 附圖給出了給藥前和給藥后(1. 5ml/kg)恒河猴空間延遲任務(wù)成績的差異情況。 柱狀圖代表兩只恒河猴的平均正確次數(shù)(每次試驗分30個trial,)，喂藥前的成績?yōu)榘?色的柱狀圖，口服給藥后的成績?yōu)楹谏闹鶢顖D。甲醇處理過的恒河猴因為空間學(xué)習(xí)和記 憶受到了損傷，正確率與給藥前相比有極顯著差異。數(shù)據(jù)以總的平均值±方差表示，**P < 0. 01表示恒河猴在給藥前后空間記憶能力與給藥前相比有極顯著差異。
實施例2。取沒有表現(xiàn)出老年癡呆病變癥狀的4 15歲的食蟹猴共10只，體重 3kg 15kg。甲醇為天津富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)。 讓給藥動物禁水，使其能連續(xù)自然飲用體積百分比濃度為2%的甲醇水溶液30 天，控制每天動物的甲醇攝入量為1. 5mg/kg。對給藥前和給藥后的同一只猴做行為測試，測 定空間延遲成績做對照。 結(jié)果給藥猴老年癡呆模型與給藥前相比，空間延遲任務(wù)成績出現(xiàn)明顯的差異。
實施3。取沒有表現(xiàn)出老年癡呆病變癥狀的4 15歲的短尾猴共10只，體重3kg 7kg。甲醇為天津富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)。 讓給藥動物禁水，使其能連續(xù)自然飲用體積百分比濃度為3%的甲醇水溶液20 天，控制每天動物的甲醇攝入量為2mg/kg。對給藥前和給藥后的同一只猴做行為測試，測定 空間延遲成績做對照。 結(jié)果給藥猴老年癡呆模型與給藥前相比，空間延遲任務(wù)成績出現(xiàn)明顯的差異。
權(quán)利要求
模擬老年癡呆病變的非人靈長類動物模型的建立方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行讓沒有表現(xiàn)出老年癡呆病變癥狀的非人靈長類動物禁水，將體積百分比濃度為0.5％～3％的甲醇水溶液、或該甲醇水溶液還溶有能讓動物產(chǎn)生喜好感的調(diào)味劑，讓動物連續(xù)自然飲用14天～365天，控制每天動物的甲醇攝入量為0.5mg/kg～2mg/kg，得到老年癡呆病變的非人靈長類動物模型。
2. 如權(quán)利要求1所說的方法，其特征在于非人靈長類動物為恒河猴。
3. 如權(quán)利要求2所說的方法，其特征在于恒河猴為雄性。
4. 如權(quán)利要求1所說的方法，其特征在于讓動物產(chǎn)生喜好感的調(diào)味劑為糖。
全文摘要
模擬老年癡呆病變的非人靈長類動物模型的建立方法屬生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域?，F(xiàn)有的關(guān)于甲醛與老年性癡呆癥相關(guān)聯(lián)的研究都是在機理方面，還沒有建立相關(guān)的老年性癡呆動物模型的方法。本方法按以下步驟進(jìn)行讓沒有表現(xiàn)出老年癡呆病變癥狀的非人靈長類動物禁水，將體積百分比濃度為0.5％～3％的甲醇水溶液、或該甲醇水溶液還溶有能讓動物產(chǎn)生喜好感的調(diào)味劑，讓動物連續(xù)自然飲用14天～365天，控制每天動物的甲醇攝入量為0.5mg/kg～2mg/kg，得到老年癡呆病變的非人靈長類動物模型。本發(fā)明提供的動物模型對研究該病和篩選治療老年癡呆的藥物可起重要作用。
文檔編號A01K67/027GK101755709SQ20101003918
公開日2010年6月30日 申請日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者李燕皎, 楊美鳳, 胡新天, 馬原野 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所;昆明亞靈生物科技有限公司