專(zhuān)利名稱(chēng)：采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的器械及采集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的器械及采集方法，屬于動(dòng)物胚胎工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬早期胚胎的采集和移植最早于1951年由Kvashickii報(bào)道。到20世紀(jì)60年代， 已經(jīng)基本建立了外科手術(shù)方法采集和移植胚胎的技術(shù)。到70年代以后，北美和歐洲開(kāi)始將 采集和移植胚胎的技術(shù)應(yīng)用于向閉鎖豬群引進(jìn)外血和國(guó)際間的引種。80年代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技 術(shù)的出現(xiàn)，使這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用得到擴(kuò)展。1985年Hammer等人，首先用手術(shù)的方法采集豬的 受精卵，然后將人生長(zhǎng)激素基因應(yīng)用顯微注射技術(shù)注入豬的受精卵原核，再將其移入母豬 的輸卵管，得到轉(zhuǎn)基因豬。這之后，向受精卵內(nèi)注射外源基因，便成為制備轉(zhuǎn)基因豬的主要 方法之一。此外，用病毒感染法制備轉(zhuǎn)基因豬，也需要首先采集豬的早期胚胎，然后將連接 有外源基因的病毒載體注入早期胚胎，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬。豬卵母細(xì)胞的采集主要應(yīng)用于通過(guò)體外受精技術(shù)制備“試管豬”，通過(guò)核移植技術(shù) 制備“克隆豬”，通過(guò)核移植技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合制備“轉(zhuǎn)基因克隆豬”和其它遺傳修飾 的豬。應(yīng)用體外受精技術(shù)生產(chǎn)出“試管豬”最早由Cheng和Polge于1983年報(bào)道，由此 建立的豬胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)被世界上其它研究和生產(chǎn)機(jī)構(gòu)所應(yīng)用，并得以發(fā)展。實(shí)施豬體 外受精，首先要獲得豬的卵母細(xì)胞。其卵母細(xì)胞的來(lái)源有二 一是體外成熟的卵母細(xì)胞，從 卵巢上采集未成熟的卵母細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)成熟后，用于體外受精；二是體內(nèi)成熟的卵母細(xì) 胞。本發(fā)明用于豬體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的采集。成熟的卵母細(xì)胞在體外的適宜環(huán)境下與獲 能的豬精子結(jié)合，即為體外受精卵；再于體外的適宜環(huán)境下培養(yǎng)成早期胚胎，移植給受體母 豬，懷孕后產(chǎn)仔，即為“試管豬”。應(yīng)用胚胎細(xì)胞作為核供體獲得“克隆豬”最早由Polejaeva和Onishi于1989年報(bào) 道，應(yīng)用體細(xì)胞作為核供體獲得“克隆豬”則最早由Prather和Onishi于2000年報(bào)道?！翱?隆豬”的制備，首先對(duì)成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核，然后將分離的胚胎細(xì)胞或體細(xì)胞移入去核 的卵母細(xì)胞，經(jīng)電融合(或其它方法的融合)處理，體外培養(yǎng)，再移入母豬的生殖道內(nèi)，生產(chǎn) 出來(lái)的仔豬即為“克隆豬”。轉(zhuǎn)基因克隆豬的制備，需首先對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，然后用轉(zhuǎn) 基因的細(xì)胞做為核供體，獲得轉(zhuǎn)基因克隆豬。Park等人(2001，2002)用轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白 基因的成纖維細(xì)胞和耳上皮細(xì)胞做核供體，分別得到轉(zhuǎn)基因克隆豬。克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因克 隆技術(shù)是豬遺傳改良最具前景的手段。制備“克隆豬”和“轉(zhuǎn)基因克隆豬”，其卵母細(xì)胞的來(lái) 源與體外受精一樣，有體內(nèi)成熟和體外成熟兩種。實(shí)驗(yàn)表明，用體內(nèi)成熟的豬卵母細(xì)胞做核 受體，比體外成熟的卵母細(xì)胞有較高的成功率。我國(guó)最早建立豬早期胚胎和卵母細(xì)胞采集技術(shù)的是湖北省農(nóng)科院魏慶信等人， 1989年他們將采集的豬早期胚胎移入受體母豬的輸卵管內(nèi)，得到胚胎移植的后代；這之 后，將十余種外源基因?qū)胴i的受精卵，得到了相應(yīng)整合并表達(dá)的轉(zhuǎn)基因豬；趙浩斌等人1997年將早期胚胎的卵裂球移入去核卵母細(xì)胞，得到核移植后代。中國(guó)農(nóng)科院畜牧研究所 馮書(shū)堂等人，于1990年建立了豬早期胚胎的采集和移植技術(shù)，并得到胚胎移植的仔豬。進(jìn) 入21世紀(jì)以來(lái)，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、上海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所等單位，應(yīng)用核 移植和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得克隆豬或轉(zhuǎn)基因克隆豬。 國(guó)內(nèi)外采集豬早期胚胎和體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞已有技術(shù)的特征是從輸卵管沖卵 時(shí)，注射器與針頭直接相連(中間沒(méi)有軟管連接)，針頭從宮管結(jié)合部的輸卵管端插入輸卵 管；集卵管一般是直的、沒(méi)有彎曲。該技術(shù)的缺陷主要有三點(diǎn)1、在沖卵過(guò)程中，推動(dòng)注射器時(shí)，由于注射器與針頭是硬性連接，操作者稍有抖動(dòng) 或豬稍有騷動(dòng)，針頭容易劃破、劃穿或脫出輸卵管，從而造成輸卵管出血或沖卵失敗。2、由于針頭從宮管結(jié)合部的輸卵管端插入輸卵管，一是容易出血；二是容易刺穿 輸卵管；三是如果第一次沖卵失敗，不能再?gòu)南嗤奈恢玫诙尾迦脶橆^，需重新選擇一個(gè) 部位插針，從而增加輸卵管的傷口，也不容易找到合適的部位。3、由于集卵管是直的，集卵皿擺放的位置受到術(shù)部狹小的局限，接卵時(shí)稍有不慎， 或豬稍有騷動(dòng)，沖卵液容易流到集卵皿之外，或集卵皿內(nèi)的沖卵液潑灑，造成沖卵率降低或 沖卵失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的器械及采集方法， 能有效地克服已有技術(shù)的缺陷，大大提高采集的成功率，獲卵率可達(dá)95%以上，且操作方 便、安全。本發(fā)明的技術(shù)方案是采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的器械，其特征在于包括沖 卵器和集卵管；沖卵器是長(zhǎng)200-300mm、外徑1.0-1. 1mm、管壁0. 08-0. Imm的膠質(zhì)軟管，軟管 的一端為9-12號(hào)針頭，軟管的另一端為與普通注射器連接的接口 ；集卵管是長(zhǎng)130-140_、壁厚0. 8-1. 1_、內(nèi)徑3-4mm的管，中間彎成120° -140° 角(軟管可以不用彎曲)，兩端燒制、研磨平滑。如上所述的采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的器械，其特征在于集卵管是玻璃管或 其它質(zhì)地的管(如塑料管、膠管等)，兩端燒制、研磨平滑。采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的方法，母豬麻醉保定后手術(shù)切口，將輸卵管和卵巢 引出切口之外；其特征在于首先將集卵管的一端從輸卵管傘口插入輸卵管10-15mm，另一 端接集卵皿；然后將吸有15_20ml沖卵液、5-10ml空氣的注射器與沖卵器連接，沖卵器的針 頭從宮管結(jié)合部子宮角端插入輸卵管5-8mm ；再實(shí)施沖卵。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明有效地克服了已有采集豬早期胚胎及體內(nèi)成熟卵母 細(xì)胞技術(shù)的缺陷(1)由于沖卵器為膠質(zhì)軟管，向輸卵管插入針頭時(shí)，克服了與注射器直接連接的局 限，操作自如，能將針頭確實(shí)插入輸卵管的內(nèi)腔；在沖卵過(guò)程中，即使操作者稍有抖動(dòng)或豬 稍有騷動(dòng)，由于軟管的緩沖作用，也不會(huì)出現(xiàn)針頭劃破、劃穿或脫出輸卵管的現(xiàn)象，從而大 大提高沖卵的成功率。(2)由于沖卵器的針頭從宮管結(jié)合部子宮角端插入輸卵管，可有效地避開(kāi)血管，不 引起輸卵管出血；也不會(huì)刺穿輸卵管；如果第一次沖卵失敗，由于子宮角端面積較大，很容易重新選擇插針的部位，不造成輸卵管的創(chuàng)口。(3)由于集卵管有彎曲，集卵皿可擺放的位置增大，局限性小，即使有時(shí)接卵不慎或豬稍有騷動(dòng)，集卵皿可隨之移動(dòng)，不會(huì)造成沖卵液流到集卵皿之外，或集卵皿內(nèi)的沖卵液 潑灑的現(xiàn)象。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例沖卵器示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例集卵管示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。圖1中標(biāo)記的說(shuō)明1-針頭，2-軟管，3-接口。如圖1和圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例用于采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的器械，包括沖卵器和集卵管；沖卵器是長(zhǎng)200-300mm、外徑1. 0-1. 1mm、管壁0. 08-0. Imm的膠質(zhì)軟管2，軟 管2的一端為9-12號(hào)針頭1，軟管2的另一端為與普通注射器連接的接口 3。集卵管是長(zhǎng) 130-140mm、壁厚0. 8-1. 1mm、內(nèi)徑3_4mm的玻璃管(或其它質(zhì)地的管，如塑料管，膠管等)中 間彎成120° -140°角，兩端燒制、研磨平滑。沖卵器沖洗干凈后自然干燥，用前在紫外燈 下滅菌。集卵管沖洗干凈后在高壓滅菌鍋內(nèi)消毒。本發(fā)明實(shí)施例用于采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞時(shí)，首先將本發(fā)明實(shí)施例的集卵管的一端從輸卵管傘口插入輸卵管10-15mm，另一端接集卵皿；然后將吸有15_20ml沖卵液、 5-10ml空氣的注射器與本發(fā)明實(shí)施例的沖卵器連接，沖卵器的針頭1從宮管結(jié)合部子宮角 端插入輸卵管5-8mm ；再實(shí)施沖卵。具體步驟如下(1)采集豬早期胚胎的方法母豬配種后的24-48小時(shí)之內(nèi)，麻醉保定后手術(shù)切口，將輸卵管和卵巢引出切口之外；先將集卵管的一端從輸卵管傘口插入輸卵管10-15mm， 另一端接集卵皿；然后將吸有15_20ml沖卵液、5-10ml空氣的注射器與沖卵器連接，沖卵器 的針頭1從宮管結(jié)合部子宮角端插入輸卵管5-8mm ；推動(dòng)注射器，輸卵管內(nèi)的胚胎與沖卵液 一起流經(jīng)輸卵管，從集卵管流入集卵皿。沖卵完畢，小心將沖卵器和集卵管退出，復(fù)原輸卵 管傘，按常規(guī)縫合創(chuàng)口。(2)采集豬卵母細(xì)胞的方法母豬發(fā)情后不配種，待發(fā)情結(jié)束的12小時(shí)之內(nèi)，麻醉保定后手術(shù)切口，將輸卵管和卵巢引出切口之外；先將集卵管的一端從輸卵管傘口插入輸 卵管10-15mm，另一端接集卵皿；然后將吸有15_20ml沖卵液、5_10ml空氣的注射器與沖卵 器連接，沖卵器的針頭1從宮管結(jié)合部子宮角端插入輸卵管5-8mm ；推動(dòng)注射器，輸卵管內(nèi) 的卵母細(xì)胞與沖卵液一起流經(jīng)輸卵管，從集卵管流入集卵皿。沖卵完畢，小心將沖卵器和集 卵管退出，復(fù)原輸卵管傘，按常規(guī)縫合創(chuàng)口。實(shí)施例1優(yōu)良種豬的胚胎采集和移植以?xún)?yōu)良純種母豬做供體，以不能做種用的雜交母豬做受體，將供體母豬的胚胎移植給雜交母豬受體，目的在于用雜交母豬生產(chǎn)優(yōu)良純種豬。其操作步驟如下1、供體母豬的超數(shù)排卵和配種
在供體母豬發(fā)情周期的第15-18天，肌肉注射孕馬血清促性腺激素PMSG1000IU， 72小時(shí)后注射絨毛膜促性腺激素HCG 800IU，做超數(shù)排卵處理。發(fā)情后用本品種公豬配種。2、受體母豬的同期發(fā)情在受體母豬發(fā)情周期的第15-18天，在供體母豬超數(shù)排卵處理的同時(shí)，肌肉注射PMSG 800IU，72 小時(shí)后注射 HCG 600IU。或者在大群內(nèi)選擇與供體母豬同一天發(fā)情的母豬做受體。3、供體母豬胚胎的采集在供體母豬配種后的24-48小時(shí)之內(nèi)，采集胚胎。(1)供體豬的麻醉和保定供體豬上腭牽拉，限制活動(dòng)，按20-30mg/kg (每公斤體重毫克)戊巴比妥鈉 (2.5%)耳靜脈注射，進(jìn)行全身麻醉。麻醉到位后仰放在手術(shù)保定架上，四肢固定。為防止 手術(shù)過(guò)程中，豬的掙扎、彈動(dòng)，要用繩索將四肢和頭部捆綁牢靠。為使腹腔內(nèi)臟向前傾斜，方 便手術(shù)，手術(shù)臺(tái)要前低(頭低)后高(尾高)。手術(shù)過(guò)程根據(jù)需要肌肉或靜脈滴注適量的鹽 酸氯胺酮。(2)手術(shù)部位及其消毒用肥皂水和毛刷洗刷腹部和大腿內(nèi)側(cè)部，水洗后用毛巾揩干凈。手術(shù)部位一般選 擇在倒數(shù)第2、3個(gè)乳頭之間，先用電剪或毛剪在術(shù)部剪毛，應(yīng)剪凈毛茬，用清水洗凈術(shù)部， 然后涂以2-4%的碘酒，待干后再用70% -75%的酒精棉脫碘，消毒程序是碘酊棉球一酒 精棉球，由內(nèi)向外；蓋創(chuàng)巾于術(shù)部，使預(yù)定的切口暴露在創(chuàng)巾開(kāi)口的中部。(3)手術(shù)方法沿腹中線(xiàn)，盡量避開(kāi)血管，切開(kāi)皮膚5_8cm左右，沿著切口左右鈍性分離脂肪和肌 肉層，使腹膜露出后，用鈍頭剪刀剪開(kāi)腹膜。切開(kāi)腹膜應(yīng)避免損傷腹內(nèi)臟器，先用鑷子提起 腹膜，在提起部位作一切口，然后用另一只手的食指深入腹膜引導(dǎo)手術(shù)刀(向外切口)或用 外科剪把腹膜切開(kāi)或剪開(kāi)。術(shù)者將食指及中指由切口伸人腹腔，在與骨盆腔交界的前后位 置觸摸子宮角，摸到后用二指夾持，將輸卵管和卵巢引出切口之外。(4)采集胚胎先將集卵管的一端從輸卵管傘口插入輸卵管15mm，另一端接集卵皿；然后將吸有 15ml沖卵液、5ml空氣的注射器與沖卵器連接，沖卵器的針頭1從宮管結(jié)合部子宮角端插 入輸卵管5mm ；推動(dòng)注射器，輸卵管內(nèi)的胚胎與沖卵液一起流經(jīng)輸卵管，從集卵管流入集卵 皿。沖卵完畢，小心將沖卵器和集卵管退出，復(fù)原輸卵管傘，送回腹腔。再將另一側(cè)輸卵管 和卵巢引出切口之外，用同樣的方法沖取胚胎。臟器整理復(fù)位，清理切口，按常規(guī)縫合創(chuàng)口。沖卵器長(zhǎng)250mm、外徑1. 0mm、管壁0. Imm ；集卵管是長(zhǎng)135mm、壁厚1mm、內(nèi)徑3mm的 玻璃管，中間彎成135°角，兩端燒制、研磨平滑。4、胚胎的收集及質(zhì)量檢查將集卵皿置于實(shí)體顯微鏡下，用低倍鏡的大視野在沖卵液中找到胚胎。豬胚胎直 徑為150 μ m左右，肉眼觀察只有針尖大小，為一球形體，在鏡下呈圓形，其外層是透明帶， 它在沖卵液內(nèi)的折光性比其他不規(guī)則組織碎片折光性強(qiáng)，色調(diào)為灰色。揀卵管先吸入少許 磷酸緩沖液PBS再吸入卵，在集卵皿的不同位置沖洗卵3-5次。依次在第二個(gè)集卵皿內(nèi)重復(fù) 沖洗，然后把全部卵集中到一個(gè)集卵皿，一只供體的卵放在一個(gè)皿內(nèi)。操作室溫為20-25°C。
將體視鏡的放大倍數(shù)調(diào)至80-100倍，觀察胚胎的形態(tài)、卵裂球大小與均勻度、色 澤、細(xì)胞密度、與透明帶間隙以及細(xì)胞變性等情況。正常發(fā)育的胚胎，其卵裂球一般外形整 齊清晰，大小一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚胎日齡相一致。對(duì)發(fā)育正常的胚胎供移 植，淘汰未受精卵及發(fā)育異常的胚胎。5、胚胎移植按照與供體母豬同樣的方法，對(duì)同步發(fā)情的受體母豬 進(jìn)行麻醉、保定、實(shí)施手術(shù)， 并將輸卵管和卵巢引出創(chuàng)口之外。先將用于輸卵管移植的外套管斜面端，從輸卵管傘部插 入輸卵管的壺腹部；然后將吸有胚胎的移卵管插入外套管，直至用手能感覺(jué)到移卵管已穿 過(guò)外套管1公分；最后將移卵管內(nèi)的胚胎和培養(yǎng)液移入輸卵管內(nèi)。移植完畢，小心將移卵管 和外套管退出，復(fù)原輸卵管和卵巢，送入腹腔，按常規(guī)縫合創(chuàng)口。6、受體母豬的管理移植后的受體母豬，最初幾天，要注意每天兩次注射抗菌素，防止創(chuàng)口感染。同時(shí)， 要單欄飼養(yǎng)，以防止豬只之間打架，弄破傷口或流產(chǎn)。受體母豬的營(yíng)養(yǎng)水平，按育種場(chǎng)懷孕 母豬的日糧配合即可。懷孕中后期，注意補(bǔ)充青飼料，做好觀察，待產(chǎn)。實(shí)施例2轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因豬的制備1、人血清白蛋白基因的準(zhǔn)備將構(gòu)建好的人血清白蛋白基因質(zhì)粒酶切成線(xiàn)性，用TE稀釋液稀釋為5 μ g/ml的基 因溶液備用。2、胚胎的采集用實(shí)施例1同樣的方法，對(duì)母豬進(jìn)行超數(shù)排卵處理，發(fā)情后配種；在最后一次配種 之后的24小時(shí)，進(jìn)行手術(shù)，麻醉、保定、腹部開(kāi)口，其過(guò)程同實(shí)施例1。術(shù)者將食指及中指由 切口伸人腹腔，在與骨盆腔交界的前后位置觸摸子宮或子宮角，摸到后用二指夾持，牽引至 創(chuàng)口的表面，循一側(cè)子宮角導(dǎo)出輸卵管，在輸卵管末端轉(zhuǎn)彎處找到該側(cè)卵巢。先將集卵管的 一端從輸卵管傘口插入輸卵管12mm，另一端接集卵皿；然后將吸有18ml沖卵液、6ml空氣 的注射器與沖卵器連接，沖卵器的針頭1從宮管結(jié)合部子宮角端插入輸卵管6mm ；推動(dòng)注射 器，輸卵管內(nèi)的胚胎與沖卵液一起流經(jīng)輸卵管，從集卵管流入集卵皿。沖卵完畢，小心將沖 卵器和集卵管退出，復(fù)原輸卵管傘，送回腹腔。再將另一側(cè)子宮角引出切口之外，用同樣的 方法沖取胚胎。沖卵器長(zhǎng)200mm、外徑1. 0mm、管壁0. 08mm ；集卵管是長(zhǎng)130mm、壁厚0. 8mm、內(nèi)徑
3. 5mm的玻璃管，中間彎成130°角，兩端燒制、研磨平滑。3、胚胎的收集及質(zhì)量檢查方法同實(shí)施例1。收集1細(xì)胞期的原核胚。4、基因的顯微注射原核胚以10000-15000r/min離心3-5min，能清楚地辨認(rèn)原核。離心后的原核胚 和準(zhǔn)備好的人血清白蛋白基因溶液置于顯微操作儀下，將吸有基因的注射針快速刺入原核 中，注射2pl基因溶液，迅速退出注射針。每次注射15-20枚卵，培養(yǎng)，待移植。5、注射基因胚胎的移植采用自體移植的方式。該頭母豬采集胚胎之后，仍置于手術(shù)臺(tái)上，耳靜脈點(diǎn)滴戊巴 比妥鈉(2.5%)或鹽酸氯氨酮維持其麻醉狀態(tài)。移植時(shí)，將輸卵管和卵巢引出切口之外。先將用于輸卵管移植的外套管斜面端，從輸卵管傘部插入輸卵管的壺腹部；然后將吸有胚胎 的移卵管插入外套管，直至用手能感覺(jué)到移卵管已穿過(guò)外套管1公分；最后將移卵管內(nèi)的 胚胎和培養(yǎng)液移入輸卵管內(nèi)。移植完畢，小心將移卵管和外套管退出，復(fù)原輸卵管和卵巢， 送入腹腔，按常規(guī)縫合創(chuàng)口。6、移植后母豬的管理移植后的母豬，最初幾天，要注意每天兩次注射抗菌素，防止創(chuàng)口感染。同時(shí)，要單 欄飼養(yǎng)，以防止豬只之間打架，弄破傷口或流產(chǎn)。受體母豬的營(yíng)養(yǎng)水平，按育種場(chǎng)懷孕母豬 的日糧配合即可。懷孕中后期，注意補(bǔ)充青飼料，做好觀察，待產(chǎn)。7、轉(zhuǎn)基因豬的整合檢測(cè)新生仔豬剪耳號(hào)取樣，用酚氯仿法提取DNA，PCR檢測(cè)，三次有與陽(yáng)性對(duì)照一致大 小的帶者，初步確定為轉(zhuǎn)基因仔豬。進(jìn)一步用Southern雜交確認(rèn)。實(shí)施例3轉(zhuǎn)EGFP基因克隆豬的構(gòu)建1、供細(xì)胞的準(zhǔn)備將轉(zhuǎn)EGFP基因豬胎兒成纖維細(xì)胞凍存管從液氮中取出，放入37°C水浴中小心震 蕩，使其迅速解凍；離心去除凍存液，用移液器加入2mL培養(yǎng)液，輕輕懸浮細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密 度到IO6個(gè)/mL左右，在含0. 5%胎牛血清的DMEM中進(jìn)行48-72 h的血清饑餓培養(yǎng)。之后 用胰蛋白酶消化并收集，在用于核供體之前放人改良的NCSU-23磷酸鹽培養(yǎng)液中38. 5°C懸 浮C存 20-120min。2、卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備母豬發(fā)情后不配種，待發(fā)情結(jié)束的12小時(shí)之內(nèi)，麻醉保定后手術(shù)切口，將輸卵管 和卵巢引出切口之外；先將集卵管的一端從輸卵管傘口插入輸卵管10mm，另一端接集卵 皿；然后將吸有20ml沖卵液、8ml空氣的注射器與沖卵器連接，沖卵器的針頭1從宮管結(jié)合 部子宮角端插入輸卵管6mm;推動(dòng)注射器，輸卵管內(nèi)的卵母細(xì)胞與沖卵液一起流經(jīng)輸卵管， 從集卵管流入集卵皿。沖卵完畢，小心將沖卵器和集卵管退出，復(fù)原輸卵管傘，按常規(guī)縫合 創(chuàng)口。將集卵皿置于實(shí)體顯微鏡下，用低倍鏡的大視野在沖卵液中找到卵母細(xì)胞。揀卵管 先吸入少許磷酸緩沖液PBS再吸人卵，在集卵皿的不同位置沖洗卵3-5次。依次在第二個(gè) 集卵皿內(nèi)重復(fù)沖洗，然后把全部卵集中到一個(gè)集卵皿，一只供體的卵放在一個(gè)皿內(nèi)。操作室 溫為 20-25 °C。沖卵器長(zhǎng)300mm、外徑1. 0mm、管壁0. 09mm ；集卵管是長(zhǎng)140mm、壁厚1. 1mm、內(nèi)徑
4mm的玻璃管，中間彎成140°角，兩端燒制、研磨平滑。3、卵母細(xì)胞的去核、移核和激活收集到的卵母細(xì)胞用含有4g/L BSA的PBS(38°C )洗幾遍，然后移人38°C不含鈣 的NCSU-23磷酸緩沖液中培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下，在1點(diǎn)半或4點(diǎn)半位置，用激光破膜儀打 孔，吸取核連同極體在內(nèi)的三分之一胞質(zhì)(盲吸去核)。轉(zhuǎn)EGFP基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞，分離之后，在顯微操作儀下，移入去核的卵母細(xì)胞。將移核細(xì)胞置于細(xì)胞融合儀內(nèi)，用1.5KV/cm脈沖強(qiáng)度進(jìn)行2次脈沖，置于NCSU-23 磷酸緩沖液中，再放入39°C、5% C02、100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到發(fā)育的重構(gòu)胚胎。4、重構(gòu)胚的移植將重構(gòu)胚移入同步發(fā)情的受體母豬輸卵管內(nèi)。移植方法及移植后母豬的管理同實(shí)施例1。
5、仔豬的檢測(cè)母豬產(chǎn)仔后，仔豬的耳、尾等部位在紫外燈下發(fā)出綠色熒光者，即為轉(zhuǎn)EGFP基因 克隆豬。進(jìn)一步用PCR或Southern雜交確認(rèn)。
權(quán)利要求
采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的器械，其特征在于包括沖卵器和集卵管；沖卵器是長(zhǎng)200-300mm、外徑1.0-1.1mm、管壁0.08-0.1mm的膠質(zhì)軟管，軟管的一端為9-12號(hào)針頭，軟管的另一端為與普通注射器連接的接口；集卵管是長(zhǎng)130-140mm、壁厚0.8-1.1mm、內(nèi)徑3-4mm的管，中間彎成120°-140°角。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的器械，其特征在于集卵管是 玻璃管、塑料管或膠管，兩端燒制、研磨平滑。
3.采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的方法，母豬麻醉保定后手術(shù)切口，將輸卵管和卵巢引 出切口之外；其特征在于首先將集卵管的一端從輸卵管傘口插入輸卵管10-15mm，另一端 接集卵皿；然后將吸有15-20ml沖卵液、5-10ml空氣的注射器與沖卵器連接，沖卵器的針頭 從宮管結(jié)合部子宮角端插入輸卵管5-8mm ；再實(shí)施沖卵。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞的器械及采集方法，器械包括沖卵器和集卵管。沖卵器是長(zhǎng)200-300mm、外徑1.0-1.1mm、管壁0.08-0.1mm的膠質(zhì)軟管，軟管的一端為9-12號(hào)針頭，另一端與注射器連接。集卵管長(zhǎng)130-140mm、壁厚0.8-1.1mm、內(nèi)徑3-4mm，中間彎成120°-140°角。進(jìn)行采集豬早期胚胎或卵母細(xì)胞時(shí)，首先將集卵管的一端從輸卵管傘口插入輸卵管10-15mm，另一端接集卵皿；然后將吸有15-20ml沖卵液、5-10ml空氣的注射器與沖卵器連接，沖卵器的針頭從宮管結(jié)合部子宮角端插入輸卵管5-8mm，再實(shí)施沖卵。本發(fā)明顯著提高了采集的成功率和效率。
文檔編號(hào)A61D19/00GK101797189SQ201010112198
公開(kāi)日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者喬憲鳳, 劉西梅, 華再東, 華文君, 李莉, 熊忠良, 程妮, 肖紅衛(wèi), 魏慶信 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所