專利名稱：一種蔥蘭快速繁殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的組織培養(yǎng)方法，具體是蔥蘭的頂芽離體培養(yǎng)快速
繁殖方法。
背景技術(shù)：
蔥蘭(Z印hyranthes Candida herb.)，石蒜科蔥蘭屬植物，別名蔥蓮、玉簾、白花 菖蒲蓮；原產(chǎn)南美。為多年生鱗莖草本植物，鱗莖圓錐形，具細(xì)長頸部；株高15 20cm。葉 基生，線形，稍肉質(zhì)，叢生，暗綠色?；ㄝ阒锌?，自葉叢中抽出，花單生，白色，花被六片；蕊 嫩黃或金黃色，橢圓狀披針形，無筒部。花徑3 4cm。花期6月下旬至11月上旬。蔥蘭 的植株叢低矮整齊，易成活，花朵繁多，花期長，花素潔高雅，清香馥郁，恬淡宜人，花型優(yōu) 美，近年來被廣泛用于城市園林綠化中用作花壇、花鏡及路邊的鑲邊材料，或用于林下、坡 地等處作為地被植物，亦可做切花材料，是優(yōu)良的園林花卉觀賞植物之一。目前，園林環(huán)境 美化對蔥蘭種苗的市場需求越來越大，但蔥蘭的供應(yīng)卻極度的不足。造成這種市場缺口主 要有兩方面的原因其一是蔥蘭的繁殖方法，目前蔥蘭的主要繁殖方式是種子繁殖(實(shí)生 繁殖)和分株繁殖(韓梅珍，盧鈺，蔥蘭的繁殖與園林應(yīng)用，山東林業(yè)科技，2004年第4期 39頁)。石蒜屬大多數(shù)植物的種子難以正常成熟，自然結(jié)實(shí)率很低，種子收集亦受季節(jié)限 制，從收集種子到播種成苗一般要經(jīng)歷幾個月甚至一年時間，且實(shí)生苗發(fā)育到開花大多需 要4 5年或更長時間；分株繁殖也有季節(jié)要求，一般要在春季進(jìn)行，而且多為2 3年分 株一次，產(chǎn)苗量小。因此，繁殖系數(shù)低、繁殖周期長自然就成了限制蔥蘭大量繁殖的一個主 要原因；其二是病害，近年來發(fā)現(xiàn)幾種較為常見的主要危害蔥蘭葉部的病害，如黑線剌盤孢 菌Colletotrichum dematium(Pers. ex F r.)(俞文君，林建新.蔥蘭葉枯病病原的研究， 江蘇林業(yè)科技，1998年25巻第1期，64 65頁)、蔥蘭炭疽病、赤斑病和黃化病(吳大椿， 鄒亞飛，蔥蘭赤斑病病原及防治初步研究，湖北植保，1998年第5期6 7頁；陳集雙，李德 葆，蔥蘭黃化病病原類菌原體的研究，微生物學(xué)報，1994年第34巻第3期，245 247頁；李 騰，蔥蘭炭疽病發(fā)生及其防治初報，廣東園林，2006年第28巻第4期，49 50頁)等病害， 這些病害可引起蔥蘭的葉部病害，即使發(fā)病較輕，也影響蔥蘭開花，發(fā)病較重時若防治不及 時，可造成蔥蘭成片死亡。這些葉部病害不僅影響了蔥蘭的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值，且有逐年 加重的趨勢，更為嚴(yán)重的是葉部病害使得蔥蘭的分株繁殖極大受限。上述兩方面的因素造 成了蔥蘭的產(chǎn)量與園林環(huán)境綠化對蔥蘭大量健康種苗的需求極不相符。因此，利用蔥蘭離 體器官培養(yǎng)，進(jìn)行工廠化育苗，快速獲得蔥蘭大量健康種苗，成為蔥蘭育種的必然趨勢。
目前，鱗莖類植物的組織培養(yǎng)及快速繁殖方法，研究較多的是百合科和石蒜科。百 合科組培研究較多，外植體包含鱗片、鱗莖、葉片和花器官。其中研究較成功的是百合鱗片 誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖，在MS+BA 1.0mg/L+NAA 0. lmg/L+糖3 % +瓊脂0. 35 %培養(yǎng)基中，以中 部鱗片切割為6塊產(chǎn)生的小鱗莖增殖系數(shù)最高，可達(dá)11. 5(王愛琴，何龍飛，溫慶蘭，林鑒 釗，百合組培中鱗片處理及其顏色變化與鱗莖形成的關(guān)系，園藝學(xué)報，2004年31巻第1期 117 119頁)；大百合的鱗片100%可誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，增殖系數(shù)為4 7 ;70%的葉片可
3誘導(dǎo)分化產(chǎn)生叢生芽，50%的鱗莖誘導(dǎo)分化產(chǎn)生不定芽(虞泓，陸永武，程治英，大百合的 離體快繁和鱗莖的誘導(dǎo)，植物生理學(xué)通訊，2005年41巻第2期192頁)；對于蘭州百合，鱗 片誘導(dǎo)鱗莖的最適培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0. 5mg/L，鱗莖的增殖系數(shù)為3. 1 (王麗艷，梁國魯， 郭啟高，蘭州百合組培苗試管結(jié)鱗莖研究，北方園藝，2004年第3期73頁)；百合屬的花器 官也可作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，以花絲的鱗莖誘導(dǎo)率最高(為89. 01% )，其次是花柱，子 房的誘導(dǎo)率最低，但子房誘導(dǎo)出鱗莖的增殖系數(shù)卻最高(為2. 9)(周俊輝，周厚高，林麗嬋， 盧俊圖，火百合花器的鱗莖誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)研究，廣西植物，2008年28巻第6期，811 815 頁)；另外百合科的湖北貝母、湘貝母、巻丹、郁金香等的組織培養(yǎng)也有研究，不同的培養(yǎng)基 類型及激素組合，具有不同的誘導(dǎo)效果。其中郁金香的鱗片及鱗莖在5種培養(yǎng)基上很難誘 導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或者小鱗莖；而花托的誘導(dǎo)率最高，在MS+2，4-D 0. 5mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率 為56.7% (楊永剛，代漢萍，胡新穎，雷家軍，郁金香器官離體培養(yǎng)再生小鱗莖的研究，園藝 學(xué)報2006年33巻第5期1133 1136頁)。對于石蒜科植物的組織培養(yǎng)，以石蒜屬、朱頂 紅屬、君子蘭屬和水仙屬的研究居多，其中以鱗莖作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)直接產(chǎn)生小鱗 莖或不定芽最為成功。同樣，不同部位的外植體，不同的培養(yǎng)基類型及激素組合也具有不 同的誘導(dǎo)效果(趙天榮，施永泰，蔡建崗，倪建剛，石蒜屬植物的研究進(jìn)展，北方園藝，2008 年第4期65 69頁)。如林田，劉灶長，李天菲等(不同激素配比對紅花石蒜小鱗莖及莖 尖的分化培養(yǎng)的影響，上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006年22巻第4期45-47頁)以紅花石蒜鱗莖為外 植體，在最適培養(yǎng)基上(MS+BA3. Omg/L+NAA 1. 5mg/L)，小鱗莖的誘導(dǎo)率為53% ;而劉志高 等(乳白石蒜組織培養(yǎng)，浙江林學(xué)院學(xué)報，2006年23巻第3期347 350頁)以乳白石蒜 的鱗莖作為外植體，最高誘導(dǎo)率達(dá)到100% ;通過切割誘導(dǎo)得到的小鱗莖，在MS+BA5. Omg/ L+NAA2.0mg/L培養(yǎng)基上得到了最好的增殖效果，最高增殖倍數(shù)達(dá)到15。這些結(jié)果表明，對 于鱗莖類植物，通過離體培養(yǎng)可以獲得再生植株，同時也說明不同植物所含的特有物質(zhì)及 遺傳特性不同，離體培養(yǎng)適用的組織器官部位、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件等往往具 有很大的種間及屬間特異性，甚至同種植物不同部位的組織也有很大的差異。
對于具有較大鱗莖的植物，也可采用鱗莖盤的切割法，如十六等分法、八等分法、 六等分法、四等分法等切割鱗莖進(jìn)行快速繁殖，如忽地笑以八分割基盤所獲取的子球最多， 平均為14個子球，但子球至開花需2 4年；利用雙鱗片繁殖法，可使得一個母球的繁殖倍 數(shù)達(dá)到40 70倍，但子球至開花需4 5年；以4鱗片及其相連的部分基盤為繁殖體，所 形成的子球較大，一母球的繁殖倍數(shù)為38倍，子球至開花需3 4年。雖然底盤切割法是 石蒜屬植物無性繁殖較為有效的方法，但也存在從小鱗莖至開花周期長的缺點(diǎn)(趙天榮， 施永泰，蔡建崗，倪建剛，石蒜屬植物的研究進(jìn)展，北方園藝，2008年第4期65 69頁)。
對于蔥蘭的離體培養(yǎng)及快速繁殖，目前的報道較少。陳揚(yáng)春("蔥蘭和韭蘭鱗片 離體培養(yǎng)研究"，亞熱帶植物通訊，1992年第21巻第2期42 46頁)以帶鱗莖盤和不帶 鱗莖盤的鱗片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)帶鱗莖盤的鱗片可誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖，但在最適 培養(yǎng)基MS+BA 0. lmg/L+NAA 1. Omg/L上，小鱗莖增殖系數(shù)最高為1. 5，而未帶鱗莖盤的鱗莖 則全未形成小鱗莖。何龍飛，周嫦("玉簾的組織和原生體培養(yǎng)"，武漢大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué) 版)，1995年第41巻第2期213 217頁)以玉簾的不同組織為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)的 胚性愈傷能產(chǎn)生再生植株，胚性愈傷的誘導(dǎo)率最高僅為20. 5%。這些研究結(jié)果均達(dá)不到快 速繁殖的目的。同時由于蔥蘭的鱗莖盤相對較小，不能采用鱗莖盤的切割方法進(jìn)行培養(yǎng)，加上前面所述的蔥蘭病害的原因，使得蔥蘭快速繁殖的選材和方法更為苛刻和不易，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不 能滿足大量的市場需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服蔥蘭現(xiàn)有繁殖技術(shù)的不足，提供一種蔥蘭離體培養(yǎng)及快速 繁殖的方法。 本發(fā)明選用蔥蘭鱗莖的頂芽為外植體，快速誘導(dǎo)產(chǎn)生大量不定芽，通過不定芽的 產(chǎn)生及生根得到再生植株，再生植株成活率達(dá)到100% 。具有繁殖速度快、可不受季節(jié)限制， 隨時取頂芽離體器官進(jìn)行組織培養(yǎng)、再生植株變異小、遺傳穩(wěn)定性高、再生植株健康和縮短 育苗周期的優(yōu)點(diǎn)。 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)施 取蔥蘭鱗莖，消毒滅菌后取頂芽，以MS基本培養(yǎng)基加激素組合TDZ和NAA為培養(yǎng) 基進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽繼代培養(yǎng)，然后以1/2MS，添加IBA為 培養(yǎng)基，進(jìn)行不定芽生根培養(yǎng)形成再生植株。
具體的步驟如下 第一步，取栽培蔥蘭整株，切去根系、鱗莖盤基和葉片，剝掉外面的鱗葉和腋芽進(jìn) 行滅菌；滅菌后繼續(xù)剝離殘留鱗葉，留下頂芽進(jìn)行誘導(dǎo)；誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng) 基加激素組合TDZ和NAA， TDZ和NAA濃度分別為0. 1 0. 5mg/L和0. 05 0. 2mg/L ;培養(yǎng) 條件為溫度24±4"，光照時間為10 14小時/天，光照強(qiáng)度為2000 2500Lux，不定 芽的誘導(dǎo)時間為16 20天，每芽可長出1 2片綠色葉片，葉片長約0. 5 2cm ;不定芽 的誘導(dǎo)率為100% ;不定芽的增殖系數(shù)為7 9 ; 第二步，將分化的不定芽分成單芽，切去頂部葉片，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基與分 化培養(yǎng)基相同，培養(yǎng)條件為溫度24士4t:，光照時間為10 14小時/天，光照強(qiáng)度為
2000 2500Lux，培養(yǎng)時間為15 20天，增殖系數(shù)為7 9。 第三步，將第二步的不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS，添加0. 1 0. 5mg/L的IBA，培養(yǎng)條件為溫度24士4。C，光照時間為10 14小時/天，光照強(qiáng)度為 2000 2500Lux，生根培養(yǎng)時間為35 40天，生根率100%，根長約10 12cm，形成蔥蘭
再生植株。 第一步中所述滅菌方法具體為取栽培的蔥蘭植株，用自來水沖洗泥土，切去根系 和葉片，將余下的鱗莖在用自來水下沖洗3 4小時；剝?nèi)[莖外面2/3的鱗葉和腋芽，然 后用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡2 3min，用無菌水沖洗3 5次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。的升 汞溶液浸泡10 15min，再用無菌水沖洗5次，然后用無菌濾紙將鱗莖的水分吸干，切去鱗 莖盤基，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。 與現(xiàn)有的蔥蘭離體組培方法相比，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)有幾個方面 其一，取材于蔥蘭鱗莖中的頂芽，一般來說，植物病毒的含量隨與莖尖相隔距離加
大而增加，莖尖部分病毒含量極低或不含病毒，利用蔥蘭鱗莖最內(nèi)層的頂芽進(jìn)行培養(yǎng)避免
了帶病菌的外植體，可以獲得健康植株。 其二，利用頂芽進(jìn)行離體培養(yǎng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量不定芽，在MS+TDZ+NAA培養(yǎng)基中， 誘導(dǎo)率為100%，增殖系數(shù)可達(dá)7 9。而利用葉片和根不能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和不定芽；利
5用鱗片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，只有加MS+6-BA+2，4-D的培養(yǎng)基中鱗片有少許膨大，但 也不能產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，在MS+TDZ+NAA和MS+6-BA+NAA的培養(yǎng)基中沒有任何誘導(dǎo)， 最終60 90天時逐漸褐化死亡。本發(fā)明的結(jié)果表明，蔥蘭的離體組培頂芽是最佳外植體， 根系、葉片和鱗片無法誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或不定芽。 其三，本發(fā)明表明，利用蔥蘭頂芽誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽，可在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼 代培養(yǎng)，培養(yǎng)步驟簡單，繼代周期較短，僅需15 20天。 其四，利用頂芽離體培養(yǎng)直接形成大量不定芽進(jìn)行快速繁殖，沒有經(jīng)過脫分化、愈 傷組織誘導(dǎo)及其分化過程，使產(chǎn)生的再生植株變異率低，遺傳穩(wěn)定性高。
因此，利用蔥蘭頂芽的離體培養(yǎng)進(jìn)行無性繁殖，取材方便，步驟簡單，增殖系數(shù)高， 獲得的再生植株變異率低，遺傳穩(wěn)定性高，達(dá)到了快速繁殖的目的。


附圖1為蔥蘭頂芽在MS+TDZ+NAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生出不定芽；
附圖2為蔥蘭不定芽形成根系后的生根苗。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 第一步，取栽培的蔥蘭植株，用自來水沖洗泥土，剪去根系和葉片，將余下的鱗莖 在用自來水下沖洗4小時；剝?nèi)[莖外面2/3的鱗葉和腋芽，然后用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒 精浸泡2min，用無菌水沖洗5次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。的升汞溶液浸泡12min，再用無菌水沖 洗5次，將消毒后的鱗莖盤基切去，將剩余直徑約為0. 6cm的頂芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，添加劑為0. 5mg/L的TDZ和0. lmg/L的NAA，加入蔗糖30g/L，瓊脂 8g/L，培養(yǎng)基ra值5.9，培養(yǎng)條件為溫度25士2t:，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度為 2500Lux，不定芽的誘導(dǎo)時間為18天的效果見圖1 ; 第二步，將分化的不定芽切割為單芽，切去葉片進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基與分化培養(yǎng) 基相同，培養(yǎng)條件為溫度25士2t:，光照時間為12小時/天，光照強(qiáng)度為2500Lux，培養(yǎng)
時間為18天； 第三步，將步驟二得到的不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25士2t:，光照 時間為12小時/天，光照強(qiáng)度為2500Lux，生根培養(yǎng)時間為38天，得到蔥蘭再生植株，詳 見圖2。 將第三步中經(jīng)生根培養(yǎng)后得到的再生苗進(jìn)行練苗，待再生苗長到10cm高時，將其 與空氣接觸，25士2t:下生長5天；然后用流水洗去再生苗根部的培養(yǎng)基，將其移栽到消毒
的栽培基質(zhì)(泥炭土 蛭石=2 : i)中培養(yǎng)，得到蔥蘭再生植株，成活率達(dá)ioo%。
權(quán)利要求
一種蔥蘭快速繁殖的方法，其特征在于取蔥蘭鱗莖頂芽，以MS加激素組合TDZ和NAA為培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽繼代培養(yǎng)，然后以1/2MS，添加IBA為生根培養(yǎng)基，進(jìn)行不定芽生根培養(yǎng)形成再生植株。
2. 權(quán)利要求1所述的蔥蘭快速繁殖的方法，所述培養(yǎng)基中MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，激素TDZ濃度為0. 1 0. 5mg/L、 NAA濃度為0. 05 0. 2mg/L。
3. 權(quán)利要求1所述的蔥蘭快速繁殖的方法，所述的生根培養(yǎng)基中的IBA濃度為0. 1 0. 5mg/L。
全文摘要
本發(fā)明選用蔥蘭鱗莖的頂芽為外植體，快速誘導(dǎo)產(chǎn)生大量不定芽，通過不定芽的產(chǎn)生及生根得到再生植株，再生植株成活率達(dá)到100％；具有繁殖速度快、不受季節(jié)限制，隨時取頂芽離體器官進(jìn)行組織培養(yǎng)、再生植株變異小、遺傳穩(wěn)定性高、再生植株健康和縮短育苗周期的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A01H4/00GK101766123SQ20101011241
公開日2010年7月7日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者季洪強(qiáng), 袁秀云, 謝惠玲 申請人:鄭州師范高等?？茖W(xué)校生物工程研究所