專利名稱：橡膠樹子葉胚胚性愈傷高效遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體涉及一種以橡膠樹體
細(xì)胞子葉胚切片胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體材料的橡膠樹高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis Muell. Arg)是四大工業(yè)原料之一的天然橡膠 的主要來源，同時(shí)又是能源植物，天然橡膠的化學(xué)成分橡膠烴經(jīng)過生物改良，可作為化石能 源的替代品。橡膠樹是多年生、異花授粉植物，常規(guī)育種周期長，一般30a，同時(shí)橡膠樹種內(nèi) 基因狹窄，雜交育種難以有大的突破。因此基因工程育種成為橡膠樹生物技術(shù)研究、品種改 良的核心內(nèi)容，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可定向改良性狀，彌補(bǔ)常規(guī)育種中的不足，大大縮短育種周 期，節(jié)省人力、物力。橡膠樹的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要的意義一是改良天然橡膠樹性能，提高其 膠乳的產(chǎn)量、抗風(fēng)性、抗寒性、抗病性等多種性狀，并通過轉(zhuǎn)基因途徑可使育種周期大大縮 短。二是橡膠樹具有特殊的乳管系統(tǒng)，通過割膠可獲得大量的膠乳，橡膠樹可作為一種天然 生物反應(yīng)器，使其表達(dá)具有高價(jià)值的外源蛋白質(zhì)。 1991年Arokiaraj等首次通過農(nóng)桿菌接種橡膠皮下組織并得到含有由農(nóng)桿菌誘 導(dǎo)形成的章魚堿，腫瘤的形成包含了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，并表明質(zhì)粒攜帶的控制某些代謝物(如 冠癭堿、植物激素合成)的基因在腫瘤細(xì)胞中得到表達(dá)，這是最早關(guān)于橡膠樹基因工程的 報(bào)道。之后，1994-1998年Arokiaraj等應(yīng)用基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，都成功地將P _葡 糖苷酸酶(GUS)和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)轉(zhuǎn)入橡膠中(GL 1 clone)，在增殖培養(yǎng) 的第3代無性系中仍正常表達(dá)，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性，而這正是轉(zhuǎn)基因植物所需具備的一 個(gè)重要特征，初步建立了橡膠樹的遺傳轉(zhuǎn)化體系，從此利用脫分化愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，以 及利用NPT II為篩選基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化成了巴西橡膠樹轉(zhuǎn)化的基本方法，但是轉(zhuǎn)化效率極低。 2000年法國國際農(nóng)業(yè)研究與發(fā)展中心的Montoro等利用繼代的易碎內(nèi)珠被愈傷組織和NPT II篩選基因，研究了鈣在橡膠樹(PB 260 clone)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中的作用，但并沒有得到轉(zhuǎn)基 因植株。2000年李維國以花藥脫分化愈傷為受體，NPT II為篩選基因，將木薯SOD基因?qū)?入橡膠，并得到轉(zhuǎn)基因胚狀體(海墾2clone)。 2003年印度橡膠研究所的Jayashree等以 花藥脫分化愈傷組織為受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GUS基因、SOD基因、NPT II篩選基因成 功轉(zhuǎn)入橡膠樹中(RRII 105clone)，并在轉(zhuǎn)基因后代中穩(wěn)定表達(dá)。2006年Montoro等通過 橡膠樹內(nèi)珠被易碎愈傷組織，并進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GUS基因和NPT II 篩選基因轉(zhuǎn)入橡膠樹(PB260clone)，得到轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)化過程中有大量玻璃化苗產(chǎn)生， 相關(guān)組培技術(shù)還不完善。2006年陳雄庭等用基因槍轟擊橡膠花藥脫分化愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn) 化實(shí)驗(yàn)，將GUS基因、NPT 1I基因、GAI矮化基因?qū)氚臀飨鹉z樹(海墾2clone)，對基因槍 轉(zhuǎn)化橡膠樹愈傷組織的方法進(jìn)行了探索，并初步確定GAI基因已經(jīng)整合到橡膠基因組中， 但橡膠愈傷組織經(jīng)過基因槍轟擊后，褐化程度比較嚴(yán)重，胚狀體再生率和出苗率都比較低。 2007年趙輝等通過橡膠花藥培養(yǎng)得到大量易碎的胚性愈傷組織，并進(jìn)行長期繼代增殖和植 株再生體系研究，并將該再生體系應(yīng)用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將新疆小擬南芥
3抗凍調(diào)節(jié)基因CBF及其下游功能基因C0R15a，以及NPT II基因轉(zhuǎn)入橡膠組織中，得到大量 轉(zhuǎn)基因胚狀體(熱研7-33-97clone)。 大量橡膠基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)化受體及相應(yīng)的再生體系是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵因 素。在橡膠樹的轉(zhuǎn)化再生體系中，花藥和內(nèi)珠被培養(yǎng)是巴西橡膠樹組織培養(yǎng)中研究較早和 較多的方向，其基本過程是1)撥取橡膠處于單核晚期的雄花花藥或切取幼嫩橡膠樹種子 的內(nèi)珠被進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，約30 60天；2)將形成的脫分化愈傷轉(zhuǎn)入橡膠胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基， 進(jìn)行胚誘導(dǎo)培養(yǎng)過程，約3 4個(gè)月；3)經(jīng)胚誘導(dǎo)過程后，會(huì)從部分脫分化愈傷上形成胚性 愈傷，胚性愈傷經(jīng)進(jìn)一步發(fā)育會(huì)逐步形成棒狀、心形、魚雷形胚(以上為成熟胚)等，這些都 是胚性組織；4)將成熟胚依次轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)和根誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行芽和根的培養(yǎng)，當(dāng)長到適 宜高度后再轉(zhuǎn)入自然環(huán)境鍛煉和定植。迄今，我國花藥和內(nèi)珠被植株的大田栽培面積已有 近千畝，與傳統(tǒng)的芽接苗相比，花藥和內(nèi)珠被植株植株具有生長速度快、干膠產(chǎn)量高、抗逆 性強(qiáng)的特點(diǎn)，未來可能成為主要的種植材料。目前，花藥和內(nèi)珠被植株培養(yǎng)中存在的主要問 題是外植體取材受橡膠開花和結(jié)果時(shí)間的限制，脫分化愈傷成胚率低且難以長期繼代保 存，因而植株再生頻率低，生產(chǎn)成本高，后期靠體胚植株莖段微繁技術(shù)也很難滿足生產(chǎn)中對 組培苗的大量需求和建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系等生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)的需要。 2007年趙輝等發(fā)明了一種橡膠樹易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)及繼代增殖方法，并應(yīng)用 于橡膠樹基因轉(zhuǎn)化技術(shù)研究，彌補(bǔ)了橡膠花藥和內(nèi)珠被組培外植體取材受季節(jié)等自然條件 限制的缺點(diǎn)，為橡膠轉(zhuǎn)化技術(shù)提供了新的技術(shù)路線，也為建立橡膠花藥懸浮培養(yǎng)和橡膠原 生質(zhì)體培養(yǎng)提供了大量的好材料。 2008年趙輝等發(fā)明了橡膠樹體細(xì)胞子葉胚高效胚性愈傷誘導(dǎo)及再生方法，并利用 該再生體系進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)化技術(shù)研究，實(shí)驗(yàn)表明該再生體系是適宜基因轉(zhuǎn)化的高效轉(zhuǎn)化再 生體系。胚性愈傷組織具有卵細(xì)胞特性，接受外源基因的能力強(qiáng)，其誘導(dǎo)的胚狀體是單細(xì)胞 起源不會(huì)出現(xiàn)嵌合體，是理想的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種橡膠樹子葉胚胚性愈傷高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其是利用橡 膠樹花藥或內(nèi)珠被組織培養(yǎng)，橡膠樹子葉胚高效胚性愈傷誘導(dǎo)及再生方法，并成功結(jié)合基 因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，大大提高橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案 —種橡膠樹子葉胚胚性愈傷高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括胚性組織的選取與處理過 程、體細(xì)胞胚高效胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與選擇過程、遺傳轉(zhuǎn)化過程、轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷誘導(dǎo) 成胚過程、成熟胚的選取與誘導(dǎo)成苗過程。 1、胚性組織的選取與處理過程在橡膠樹花藥或內(nèi)珠被組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，選擇 花藥或內(nèi)珠被脫分化愈傷經(jīng)胚誘導(dǎo)過程產(chǎn)生的新鮮、健康，長lcm以上的子葉胚為外植體， 進(jìn)行切片處理。所述子葉胚的切片處理是切成寬2 3mm、長3 5mm的米粒狀切片。切片 的質(zhì)量影響愈傷誘導(dǎo)效率，切片過小，難以誘導(dǎo)出愈傷，切片太大浪費(fèi)材料的同時(shí)也難誘導(dǎo) 出理想的愈傷。 2、體細(xì)胞胚高效胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與選擇過程將米粒狀子葉胚切片接種到胚 性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上于26 2『C進(jìn)行暗培養(yǎng)20 30天。其中20 30天的愈傷出胚效率最高，應(yīng)選擇為轉(zhuǎn)化的受體材料，體胚愈傷在胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)45天后觀察，出胚愈 傷率可達(dá)40 60%，出胚率可達(dá)200 300% ， 20天以前的愈傷量很少，40天以后的愈傷 出胚效率明顯降低，都不宜選擇為轉(zhuǎn)化受體材料。所述胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加0. 5 2ppm2，4-D、0. 5 2卯m KT、0 l卯m BA、0 2卯m NAA、0 2卯m ZT、蔗糖70 90g/L、椰子水50ml/L、0. 1 2g/L天門冬酰胺和0. 1 0. 2g/L肌醇。
3、遺傳轉(zhuǎn)化過程利用基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以暗培養(yǎng)20 30天的子葉胚胚性 愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。 4、轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷誘導(dǎo)成胚過程將轉(zhuǎn)化后的子葉胚胚性愈傷接到胚誘導(dǎo)培養(yǎng) 基上于24 26t:進(jìn)行暗培養(yǎng)至生成子葉胚。經(jīng)抑菌或篩選過程20 30天可觀察到體胚 的發(fā)育，40 60天時(shí)能大量形成子葉胚，60 90能得到許多成熟胚。這些子葉胚長到lcm 以上時(shí)便可進(jìn)一步切片誘導(dǎo)高效胚性愈傷進(jìn)行體胚的循環(huán)增殖，或者接入成苗培養(yǎng)基內(nèi)誘 導(dǎo)形成自根苗。所述胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素減少10 50%，微量元素增加0. 5 2倍，并添加0. 5 3卯m BA、0. 5 3卯m KT、0 0. 5卯mNAA、 0. 2 l卯m GA、0 5卯m ABA、水解酪氨酸50 300mg/l、加0. 1 0. 2g/L肌醇、麥芽糖 0 20g/L、蔗糖50 70g/L和椰子水50ml/L。 5、成熟胚的選取與誘導(dǎo)成苗過程選取經(jīng)篩選過程產(chǎn)生的健康、完整、高1. 5cm以 上的子葉胚接到自根苗培養(yǎng)基上于28 3(TC進(jìn)行光培養(yǎng)至抽出健狀莖段。約10天子葉 胚可抽出健狀的主根，約20天子葉胚可抽出10cm的健狀莖段。所述自根苗培養(yǎng)基是以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素減少10 30%，并添加0 2ppm BA、0. 5 2ppm KT、 0. 2 lppm NAA、0. 5 1. 5ppmGA、糖30 50g/L和椰子水50ml/L。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn) 1、以體細(xì)胞子葉胚高效胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體克服了脫分化愈傷組織在轉(zhuǎn)化 中的嚴(yán)重不足，子葉胚胚性愈傷組織耐受轉(zhuǎn)化因子作用強(qiáng)，并且成胚率極高，解決了轉(zhuǎn)化過 程中胚誘導(dǎo)率低的問題。 2、胚性愈傷組織具有卵細(xì)胞特性，接受外源基因的能力強(qiáng)，其誘導(dǎo)的胚狀體是單 細(xì)胞起源不會(huì)出現(xiàn)嵌合體，是理想的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。 一般從花藥或內(nèi)珠被誘導(dǎo)出脫分 化愈傷組織需要50 60天，再從脫分化愈傷組織再誘導(dǎo)出易碎胚性愈傷組織需要3 4 個(gè)月時(shí)間；而從體細(xì)胞子葉胚切片能直接誘導(dǎo)出高效的胚性愈傷組織，并且只需要20 30 天，這大大縮短了胚性愈傷組織的誘導(dǎo)時(shí)間，能很快為基因轉(zhuǎn)化提供高效胚性受體材料，因 此能大大提高轉(zhuǎn)化工作效率。 3、子葉胚胚性愈傷組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化后，直接進(jìn)入胚狀體誘導(dǎo)階段進(jìn)行抑菌或篩 選過程，除受抑菌劑或篩選劑的影響外，繼代過程不影響體胚的形成，能最大限度的保持橡 膠樹子葉胚高效再生體系的高效成胚率。 4、經(jīng)常剝?nèi)』ㄋ幓騼?nèi)珠被誘導(dǎo)脫分化愈傷組織費(fèi)工、費(fèi)錢，還受花期、果期及氣候 等自然條件的極大限制，利用體細(xì)胞子葉胚高效再生體系可以長期繼代增殖子葉胚，反復(fù) 切取子葉胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，這可以彌補(bǔ)以上不足，提高實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)效率。
5、取轉(zhuǎn)化后的抗性胚狀體用于分子檢測，實(shí)驗(yàn)表明有大量抗性胚狀體為轉(zhuǎn)基因胚 狀體，說明了橡膠樹子葉胚胚性愈傷高效遺傳轉(zhuǎn)化方法不但有高效的成胚率，還有高的轉(zhuǎn) 化效率。
本發(fā)明工藝流程簡單，成本低，轉(zhuǎn)化后成胚率和轉(zhuǎn)化率均高，具有很大的科學(xué)研究 及應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例 1、在橡膠樹花藥組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，選擇花藥脫分化愈傷經(jīng)胚誘導(dǎo)過程3個(gè)月產(chǎn) 生的新鮮、健康，長1 3cm以上的子葉胚為外植體，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行切片處理，先縱切 再橫切成寬2 3mm、長3 5mm的米粒狀小切片。 2、將子葉胚切片接種到子葉胚胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，用9cm的培養(yǎng)皿，每 個(gè)培養(yǎng)皿接10 15個(gè)切片，切片均勻放置，培養(yǎng)室溫度保持在26 2『C，暗培養(yǎng)。其中 20 30天的愈傷出胚效率最高，應(yīng)選擇為轉(zhuǎn)化受體材料，20天以前的切片愈傷量很少，40 天以后的愈傷出胚效率明顯降低都不宜選擇為受體材料。 3、遺傳轉(zhuǎn)化過程利用基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以25天的子葉胚胚性愈傷組織 為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。與橡膠花藥脫分化愈傷組織的對比實(shí)驗(yàn)表明，橡膠樹子葉胚胚性愈 傷組織是更適宜轉(zhuǎn)化的好材料，在轉(zhuǎn)化、抑菌、篩選、成胚各環(huán)節(jié)都表現(xiàn)出相當(dāng)明顯的優(yōu)越 性，具體表現(xiàn)為子葉胚胚性愈傷組織再生能力和抗褐化能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)化后誘導(dǎo)成胚能力仍然 很強(qiáng)，受抑菌、篩選等轉(zhuǎn)化過程的副作用??；通過篩選過程產(chǎn)生的子葉胚可進(jìn)一步進(jìn)行切 片處理，通過橡膠樹子葉胚高效胚性愈傷誘導(dǎo)及再生方法達(dá)到胚性組織循環(huán)增殖的目的， 這樣可以得到大量的轉(zhuǎn)基因植株；轉(zhuǎn)化工作的安排較隨意，操作過程不大受時(shí)間限制。在 D06。。0. 8 1. 0、25t:、侵染10 15分鐘、共培養(yǎng)2天、抑菌良好的情況下進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化， 脫分化愈傷組織的誘導(dǎo)成胚率為0，然而用子葉胚胚性愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)成胚率可達(dá) 80%以上。 4、選取經(jīng)體胚誘導(dǎo)過程產(chǎn)生的健康、完整、高1.5cm以上的子葉胚接到自根苗培 養(yǎng)基上，約10天子葉胚可抽出健狀的主根，約20天子葉胚可抽出10cm的健狀莖段。培養(yǎng) 室溫度保持在28 3(TC，光培養(yǎng)，每天12小時(shí)光照。
權(quán)利要求
一種橡膠樹子葉胚胚性愈傷高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括胚性組織的選取與處理過程、體細(xì)胞胚高效胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與選擇過程、遺傳轉(zhuǎn)化過程、轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷誘導(dǎo)成胚過程、成熟胚的選取與誘導(dǎo)成苗過程；1)、胚性組織的選取與處理過程在橡膠樹花藥或內(nèi)珠被組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，選擇花藥或內(nèi)珠被脫分化愈傷經(jīng)胚誘導(dǎo)過程產(chǎn)生的新鮮、健康，長1cm以上的子葉胚為外植體，進(jìn)行切片處理；2)、體細(xì)胞胚高效胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與選擇過程將子葉胚切片接種到胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上于26～28℃進(jìn)行暗培養(yǎng)20～30天；所述胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加0.5～2ppm 2，4-D、0.5～2ppm KT、0～1ppm BA、0～2ppm NAA、0～2ppm ZT、蔗糖70～90g/L、椰子水50ml/L、0.1～2g/L天門冬酰胺和0.1～0.2g/L肌醇；3)、遺傳轉(zhuǎn)化過程利用基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以暗培養(yǎng)20～30天的子葉胚胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；4)、轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷誘導(dǎo)成胚過程將轉(zhuǎn)化后的子葉胚胚性愈傷接到胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上于24～26℃進(jìn)行暗培養(yǎng)至生成子葉胚；所述胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素減少10～50％，微量元素增加0.5～2倍，并添加0.5～3ppm BA、0.5～3ppm KT、0～0.5ppmNAA、0.2～1ppm GA、0～.5ppm ABA、水解酪氨酸50～300mg/l、加0.1～0.2g/L肌醇、麥芽糖0～20g/L、蔗糖50～70g/L和椰子水50ml/L；5)、成熟胚的選取與誘導(dǎo)成苗過程選取經(jīng)篩選過程產(chǎn)生的健康、完整、高1.5cm以上的子葉胚接到自根苗培養(yǎng)基上于28～30℃進(jìn)行光培養(yǎng)至抽出健狀莖段；所述自根苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素減少10～30％，并添加0～2ppm BA、0.5～2ppm KT、0.2～1ppm NAA、0.5～1.5ppmGA、糖30～50g/L和椰子水50ml/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的橡膠樹子葉胚胚性愈傷高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所 述子葉胚的切片處理是切成寬2 3mm、長3 5mm的米粒狀切片。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種橡膠樹子葉胚胚性愈傷高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是在橡膠樹花藥或內(nèi)珠被組織培養(yǎng)，以子葉胚為外植體，進(jìn)行誘導(dǎo)、遺傳轉(zhuǎn)化，然后將轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷誘導(dǎo)成胚，對成熟胚進(jìn)行選取后誘導(dǎo)成苗。本發(fā)明工藝流程簡單，轉(zhuǎn)化效率極高，成本低，克服了橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化體系成胚率低、胚性愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間長等嚴(yán)重缺陷；同時(shí)也彌補(bǔ)了橡膠樹轉(zhuǎn)化受體材料的獲得易受季節(jié)等自然條件限制的缺點(diǎn)，大大縮短了轉(zhuǎn)化周期，是一種高效的橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化方法，具有很大的科研及應(yīng)用價(jià)值，為橡膠樹轉(zhuǎn)化體系的建立開創(chuàng)了展新的技術(shù)路線。
文檔編號A01H5/00GK101775408SQ20101011391
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日
發(fā)明者彭明, 曾會(huì)才, 王旭, 趙輝 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所