專利名稱：天山雪蓮抗寒基因SiCOR3708及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域中基因克隆和生物體轉化技術領域，具體的，本發(fā)明涉 及一種天山雪蓮抗寒基因及其在植物抗寒中應用的技術領域。
背景技術：
溫度是植物正常生長、生存的重要條件之一，同時也是限制植物形態(tài)和分布的重 要因素之一。低溫傷害植物已成為全球公害。我國緯度跨度大，氣候多樣，寒害時有發(fā)生， 而且近年來看在非寒冷季節(jié)寒害已經(jīng)成為我國重要自然災害之一，并且有逐漸加劇趨勢， 有可能成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最大的自然災害。目前，解決寒害基本途徑有三條第一，采取更加 先進的栽培技術；第二，對已有植物品種，尤其是具有較高經(jīng)濟價值的植物品種進行改良， 然而傳統(tǒng)改良方法費時、費力，并缺乏針對性；第三，隨植物抗寒機制的研究，抗寒相關基因 的克隆以及轉基因技術的發(fā)展，以相關受體植株的轉基因植物的研究，使得基因工程培育 高效抗寒品種成為一種重要途徑，因此，迫切需要開發(fā)抗寒的相關基因與蛋白。在1970年Weiser提出低溫鍛煉可能會引起基因表達改變的設想，之后通過大量 研究表明大多數(shù)植物在低溫鍛煉過程中均有冷調(diào)節(jié)物質(zhì)的存在，目前已經(jīng)從棉花、大麥、水 稻、冬葡萄、花椰菜、擬南芥、黑麥、沙冬青、胡蘿卜、紅景天等多種植物中發(fā)現(xiàn)冷調(diào)節(jié)基因。 而天山雪蓮有著極強的生命力，耐寒能力很強，是天山上植物分布最高上線的惟一大型高 等植物，其有效積溫的生理功能具有很高的利用性。如果將獲得這種雪蓮抗凍蛋白基因與 植物表達載體連接，再導入棉花、小麥、水稻、玉米等農(nóng)作物中，可提高植物的抗寒性能，產(chǎn) 生巨大的經(jīng)濟效益，尤其是可挽回4月至5月“倒春寒”對農(nóng)作物造成的經(jīng)濟損失，甚至可 使農(nóng)作物提前早播或延長種植期，把對霜凍敏感的農(nóng)作物改造成耐霜凍的農(nóng)作物，并延長 農(nóng)作物的生產(chǎn)期。因此，這一技術應用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種天山雪蓮中克隆抗寒相關基因SiC0R3708及其制備方法。本發(fā)明所提供的SiC0R3708基因如序列表中序列1所示，由632個堿基組成，該基 因的編碼框為自5’端28至585堿基；以及與序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性， 且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列1所述的DNA序列，是通過以下技術得到。將雪蓮組培苗在4°C培養(yǎng)0.5小 時后，提取其mRNA，同時提取20°C生長的雪蓮無菌苗的mRNA，采用抑制差減雜交技術，得到 雪蓮低溫誘導cDNA差減文庫，對文庫中的cDNA片斷進行序列測定，得到雪蓮SiC0R3708基 因。經(jīng)Northern雜交試驗發(fā)現(xiàn)該基因的表達受低溫誘導，與雪蓮抗寒性有密切關系。本發(fā)明的另一個目的在于提供雪蓮SiC0R3708基因在植物抗寒中應用。具體的， 本發(fā)明將構建的SiC0R3708基因表達載體轉入擬南芥中，可以顯著提高植株的抗寒能力。以植物表達載體pCHF3為基礎，將雪蓮SiC0R3708基因克隆于Smal位點，
3SiC0R3708基因的表達受啟動子CaMV 35S的調(diào)控，將其命名為pCHF3_SiC0R3708。將重組 載體pCHF3-SiC0R3708轉入農(nóng)桿菌GV3101后，以農(nóng)桿菌“浸花法”導入模式植物擬南芥中， 通過卡那霉素抗性篩選得到轉基因擬南芥純系。提取轉基因擬南芥和野生型擬南芥總DNA， 進行PCR擴增確定雪蓮SiC0R3708基因已經(jīng)整合在基因組中；提取轉基因擬南芥和野生型 擬南芥總RNA，進行RT-PCR，確定雪蓮SiC0R3708基因在轉基因擬南芥中正確表達。將溫室 中生長2周的轉基因擬南芥和野生型擬南芥同時在_8°C處理6小時，之后繼續(xù)在溫室中生 長2周，統(tǒng)計凍后存活率，結果表明轉基因擬南芥的存活率顯著高于野生型擬南芥。通過實施本發(fā)明具體的技術指標，實現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下有益效果1、提供了一種天山雪蓮抗寒相關基因SiC0R3708。2、將構建的SiC0R3708基因重組表達載體轉入擬南芥中，可以顯著提高植株的抗 寒能力。


圖1所示為雪蓮Si⑶R3708基因受低溫誘導表達情況，圖中第一排為雪蓮組培苗 總RNA變性膠電泳，第二排為雪蓮組培苗Northern雜交結果，其中1為生長于22°C雪蓮苗， 2為雪蓮苗在4°C下培養(yǎng)30min，3為雪蓮苗在4°C下培養(yǎng)lh，4為雪蓮苗在4°C下培養(yǎng)2h，5 為雪蓮苗在4°C下培養(yǎng)3h。圖2所示為pCHF3_SiC0R3708重組表達載體結構圖。圖3所示為轉基因擬南芥PCR鑒定結果，圖中1為標準DNA分子量，從上至下依次 為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp ；2為野生型擬南芥，3_16為轉基因擬南芥。圖4所示為轉基因擬南芥RT-PCR鑒定結果，圖中1為標準DNA分子量，從上至下依 次為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp ；2為野生型擬南芥，3_16為轉基因擬南芥。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另外，在下述的 說明中，如無特別說明，則％皆指質(zhì)量百分比。實施例1 天山雪蓮SiC0R3708基因的克隆將雪蓮實生苗在4°C培養(yǎng)0. 5小時，采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總 RNA，利用 cDNA 抑制差減試劑盒(PCR-Select cDNA Subtraction kit，Clontech 公司)， 按其操作步驟，構建與天山雪蓮抗寒有關的cDNA差減文庫，從中挑選1800個cDNA，分別與 正向、反向差減cDNA進行雜交，從中挑選有正向雜交信號，而沒有反向雜交信號的cDNA進 行核苷酸序列測定，得到雪蓮SiC0R3708基因，序列見序列表1，基因全長為632bp，具有一 個完整的閱讀框(28-588bp)以及5，非翻譯區(qū)(l-27bp)和3，非翻譯區(qū)(589_632bp)，閱 讀框為28-588bp，5，非翻譯區(qū)為l-27bp，3，非翻譯區(qū)為589_632bp，該序列在NCBI中經(jīng) Blast比對，未發(fā)現(xiàn)同源序列。將雪蓮組培苗分別在20°C、4°C下培養(yǎng)0.5小時后，用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取總RNA后，以同位素標記的雪蓮SiC0R3708基因為探針進行 Northern雜交，結果表明SiC0R3708基因的表達受低溫誘導，參見附圖1。實施例2 :SiC0R3708基因組成型高效表達載體的構建表達載體pCHF3_Si⑶R3708的構建過程為首先以雪蓮cDNA為模板，擴增得到 SiC0R3708基因全長cDNA，擴增引物如下，兩端帶有SmaI酶切位點
正向引物5，-CCCGGGATGAGTTATTCATACGATGA-3，反向引物5，-GGGCCCCTTACTCATATCCCGCCTCCA-3，反應條件為95°C，4min，l個循環(huán)；94°C，30sec，54°C，30sec，72°C，lmin，30 個循 環(huán)；72°C，lOmin，結束反應。將得到的擴增產(chǎn)物進行純化后，進行Small酶切、純化，同時對 載體pCHF3也進行Small酶切、脫磷反應并純化，之后進行連接反應，對得到的重組載體首 先用限制性內(nèi)切酶SpecI和SalI進行雙酶切，挑選酶切片斷中有400bp的重組載體，接著 進行PCR鑒定，所用引物序列如下正向引物5，-GAAACCGACCCTTTTTTCTA-3，反向引物5，-ACTGACAAAGAGGCAAACAC-3，反應條件如下95°C，4min，l個循環(huán)；94°C，30sec，54°C，30sec，72°C，lmin，30 個 循環(huán)；72°C，10min，結束反應。挑選擴增產(chǎn)物大小為400bp的重組質(zhì)粒進行測序。經(jīng)過上述 步驟最終得到高效表達SiC0R3708基因的植物表達載體pCHF3-SiC0R3708。載體包括CaMV 35s啟動子、RBCS終止子、目的基因SiC0R3708基因、卡那霉素抗性基因NPTII、壯觀霉素抗 性基因SpeC、半乳糖苷酶基因LacZ。詳細載體結構參見附圖2。實施例3 :pCHF3-SiC0R3708表達載體轉化農(nóng)桿菌接種農(nóng)桿菌GV3101單菌落于50mlYEB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至0D_ 為0. 4，冰浴30分鐘，4000rpm離心10分鐘，收集菌體并用IOml 0. 15M CaCl2懸浮。再次 離心收集菌體，懸浮于Iml 20mM CaCl2溶液中，取IOOul菌液裝入無菌1. 5ml離心管中，加 入0. 5ug pCHF3-SiC0R3708質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30分鐘，在液氮中迅速冷凍1分鐘，37°C 融化后，加入Iml YEB培養(yǎng)液，280C、IOOrpm培養(yǎng)2小時，4000rpm離心30秒后棄上清，加入 lOOulYEB培養(yǎng)液，菌體充分懸浮后涂布于含有50ug/ml壯觀霉素的YEB固體培養(yǎng)基上，28°C 培養(yǎng)至單菌落長出，堿裂解法提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。實施例4 :PCHF3-SiC0R3708表達載體農(nóng)桿菌介導法轉化擬南芥在OD6tltl為0. 8的pCHF3-SiC0R3708表達載體農(nóng)桿菌溶液中，加入蔗糖至終濃度為 5%，將擬南芥花在其中浸泡5秒鐘后取出，繼續(xù)培養(yǎng)至結種。收集單株種子，播種在含有 0.5%卡那霉素的MS培養(yǎng)基中，置溫室中培養(yǎng)，挑選黃苗和綠苗數(shù)量比例為3 1的株系， 進行再一次播種篩選，直至在含有0. 5%卡那霉素的MS培養(yǎng)基中長出的幼苗均為綠苗，即 為轉基因擬南芥純合株系。實施例5轉基因擬南芥檢測PCR 檢測采用CTAB法提取轉基因擬南芥的總DNA，以此為模板，陽性對照為質(zhì)粒 pCHF3-SiC0R3708,陰性對照為非轉基因擬南芥總DNA，PCR擴增所用引物如下正向引物5，-ATGAGTTATTCATACGATGA-3，反向引物5，-CTCATATCCCGCCTCCACCA-3，擴增條件為94°C, 3 分鐘，1 個循環(huán)；94°C, 30s, 53°C，30s, 72°C，lmin, 30 個循環(huán)； 72°C，10min，反應結束后在1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳，得到大小為560bp的條帶，見附圖 3，初步證明該株系為轉基因株系。RT-PCR 檢測為了檢測SiC0R3708基因在轉基因植株中是否得到了表達，進一步利用RT-PCR
5法進行檢測。用CTAB法提取樣品總RNA，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用RT-PCR試劑盒 (Takara公司)進行RT-PCR反應，擴增SiC0R3708基因所用引物為
正向引物 5 ‘ -GAAACCGACCCTTTTTTCTA-3 ‘
反向引物 5 ‘ -ACTGACAAAGAGGCAAACAC-3 ‘擴增條件為94 °C，3 分鐘，1 個循環(huán)；94 V，30s, 54 V，30s, 72 V，Imin, 30 個循 環(huán)；72°C，10min，反應結束后在1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳，大小為400bp的條帶，則證明 SiC0R3708基因在擬南芥中得到了表達，參見附圖4。實施例5 轉基因擬南芥抗凍性能檢測將轉基因擬南芥純合株系和野生型擬南芥同時置于_8°C冰箱中處理6小時后取 出，置于溫室中培養(yǎng)，二周后統(tǒng)計植株存活率，結果顯示轉基因擬南芥的存活率為80%，顯 著高于野生型的存活率(25% )，證明SiC0R3708基因的導入能提高擬南芥的抗寒性，且差 異顯著。以上實驗均設置三個重復，利用Spassll. 5對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA處理以獲得平均數(shù)與標準誤差，并用t-test檢測顯著性差異(LSD)。
權利要求
一種天山雪蓮中克隆抗寒相關基因SiCOR3708如SEQUENCE LISTING所示，其特征在于，該SiCOR3708基因由632個堿基組成，該基因的編碼框為自5’端28至585堿基；一個完整的閱讀框為28 588bp，5’非翻譯區(qū)為1 27bp，3’非翻譯區(qū)為589 632bp。
2.如權利要求1所述的天山雪蓮中克隆抗寒相關基因SiC0R3708在植物抗寒中應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天山雪蓮抗寒基因SiCOR3708及其在植物抗寒中的應用。通過將雪蓮組培苗在4℃培養(yǎng)0.5小時后，提取其mRNA，同時提取20℃生長的雪蓮無菌苗的mRNA，采用抑制差減雜交技術，得到雪蓮低溫誘導cDNA差減文庫，對文庫中的cDNA片斷進行序列測定，得到雪蓮SiCOR3708基因。該雪蓮SiCOR3708基因由632個堿基組成，該基因的編碼框為自5’端28至585堿基，將構建的SiCOR3708基因表達載體轉入擬南芥中，可以顯著提高植株的抗寒能力。將獲得這種雪蓮抗凍蛋白基因與植物表達載體連接，再導入棉花、小麥、水稻、玉米等農(nóng)作物中，可提高植物的抗寒性能，具有廣泛的應用領域。
文檔編號A01H5/00GK101899448SQ20101016669
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月10日 優(yōu)先權日2010年5月10日
發(fā)明者徐虹, 李晨華, 歐陽平凱, 王博, 王志方, 艾秀蓮 申請人:南京工業(yè)大學;新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所;中國科學院新疆生態(tài)與地理研究所