專利名稱：薺菜CBF途徑關(guān)鍵基因CbCBF的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及植物逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子
的克隆及其應(yīng)用。通過(guò)鑒定、克隆一個(gè)薺菜受低溫誘導(dǎo)的、能調(diào)控冷誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄因子基 因的啟動(dòng)子，將其應(yīng)用于植物逆境基因特別是用于植物抗寒基因的遺傳轉(zhuǎn)化，達(dá)到提高植 物抗寒性的目的。
背景技術(shù)：
植物對(duì)環(huán)境變遷及不良環(huán)境有足夠的適應(yīng)性和抵抗能力，這種抗逆性既受系統(tǒng)進(jìn) 化的遺傳基因型控制，又受個(gè)體發(fā)育中的生理生態(tài)因素制約。溫度作為重要的環(huán)境因子之 一，限制植物的分布及生長(zhǎng)和產(chǎn)量，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起著決定性作用(Viswanathan C， Zhu JK. Molecular genetic analysis of cold—regulated gene transcription.Philos Trans R Soc Lond B BiolSci. 2002， 357 (1423) :877-886.)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日益成熟，人們已 從植物中分離了大批抗寒相關(guān)基因(藺忠龍，李維薇，白現(xiàn)廣，呂廣磊，程在全.植物抗凍基 因最新研究進(jìn)展，北方園藝，2009(1) :119-123)用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相關(guān)基 因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗寒植物培育時(shí)均發(fā)現(xiàn)在獲得優(yōu)良低溫抗性植株的同時(shí)，普遍出現(xiàn)不同程度 的生長(zhǎng)延滯(retardation)現(xiàn)象。主要是利用抗寒相關(guān)基因進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因植物都是在組成 性啟動(dòng)子CaMv(cauliflowermosaic virus) 35S驅(qū)動(dòng)下產(chǎn)生的。這種基因的組成性表達(dá)對(duì)植 物的生長(zhǎng)造成了一定的影響。為了克服轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)的生長(zhǎng)延滯現(xiàn)象，人們開(kāi)始利用冷 誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子代替組成性啟動(dòng)子。冷誘導(dǎo)基因RD29A(來(lái)源于擬南芥C0R78基因)啟 動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株的研究表明，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)延滯比CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基 因植株所表現(xiàn)出來(lái)要輕微得多(Kasuga M， Miura S， Shinozaki K. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene an dstress—inducible RD29A promoter improved drought and low_temperature stress tolerance intobacco by gene transfer. Plant Cell Ph siol，2004，45 :346-350)。利用特異性的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子避免外源基因在宿主植物中非特異 性的持續(xù)、高效表達(dá)已經(jīng)得到廣泛共識(shí)，但是真正能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的特異性啟動(dòng)子不多， 而冷誘導(dǎo)型特異啟動(dòng)子更少。目前特異啟動(dòng)子的克隆及其結(jié)構(gòu)功能的研究是轉(zhuǎn)基因植物研 究中的一個(gè)熱點(diǎn)，也是一個(gè)生發(fā)點(diǎn)。這一領(lǐng)域的研究成果將極大推動(dòng)轉(zhuǎn)基因植物基礎(chǔ)研究 的進(jìn)展，加速轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)業(yè)化。 薺菜(C即sella bursa-pastoris)是一種1年或2年野生的草本植物，平鋪地面， 喜陰，在南方是隨處可見(jiàn)的一種可食用的蔬菜，屬于十字花科、薺菜屬C即sella Medik，在 低溫條件下能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育并結(jié)實(shí)。以前的研究證實(shí)薺菜中存有CBF抗逆應(yīng)答機(jī)制，薺 菜中的CBF基因(GenBank登錄號(hào)AY391121)的全長(zhǎng)cDNA序列1034bp，包括一個(gè)雙向的核 定位序列(NLS)結(jié)構(gòu)域， 一個(gè)推定的60個(gè)氨基酸基元的AP2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)ALA-Rich結(jié)構(gòu) 域。冷適應(yīng)分析表明薺菜中的CBF基因的表達(dá)受冷誘導(dǎo)調(diào)節(jié)(Wang X， Liu S， Liu X， Chen Z， Liu X， Pang Y， S皿X， Tang K. Molecular Cloning and Characterization of a CBF Genefrom Capsella bursa-pastoris. DNA sequence. 2004， 15 (3) :180-187)。本發(fā)明所涉及的薺菜CBF途徑關(guān)鍵基因CbCBF基因的啟動(dòng)子是從薺菜葉片的總DNA中克隆到的。目前 尚未發(fā)現(xiàn)利用薺菜CBF途徑關(guān)鍵基因CbCBF基因啟動(dòng)子用于培育耐寒植物的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆、鑒定一個(gè)低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的植物內(nèi)源啟動(dòng)子，并利用該 啟動(dòng)子構(gòu)建抗寒相關(guān)基因表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化方法達(dá)到提高植物的抗寒性，最終獲得 抗(耐)寒能力明顯增強(qiáng)的優(yōu)良植物品種。 本發(fā)明首先分離得到低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，所提供的低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的 啟動(dòng)子來(lái)源于薺菜。該啟動(dòng)子控制的薺菜內(nèi)源基因?yàn)榫幋a受低溫誘導(dǎo)的、能調(diào)控冷誘導(dǎo)基 因的轉(zhuǎn)錄因子CBF(CRT/DRE binding factor)家族的一個(gè)成員，被命名為CbCBF，故該啟動(dòng) 子記為CbCBFP(CbCBF Promoter) 。 CbCBFP啟動(dòng)子是具有序列表SEQ ID NO:l中的堿基第 1-1623位的序列。CbCBFP啟動(dòng)子控制的CbCBF基因是具有序列表SEQ ID NO. 1中堿基第 1624-2283位的編碼序列或含有與其編碼的蛋白質(zhì)同源性至少在80%以上具有相同功能 的序列。 本發(fā)明所提供的CbCBFP啟動(dòng)子區(qū)域含有兩個(gè)ABRE順式作用元件，三個(gè)MYCB順 式作用元件(附圖l)，前者能特異性地對(duì)低溫和ABA起應(yīng)答反應(yīng)，后者是上游調(diào)控因子 ICE(inducer of CBF expression)基因的冷調(diào)控元件ICE盒，是ICE基因的結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明利用CbCBFP啟動(dòng)子構(gòu)建了誘導(dǎo)性表達(dá)載體，該表達(dá)載體可以在植物受到 低溫脅迫時(shí)強(qiáng)烈地誘導(dǎo)報(bào)告基因GUS的表達(dá)。 利用本發(fā)明所提供的CBFP啟動(dòng)子構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化模式植物煙草，檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒的生理指標(biāo)，顯示植株耐寒性能有了顯著提高。
本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述如下 —種分離出的薺菜DNA分子，它的核苷酸序列如序列SEQ ID NO. l所示，其中薺菜 CbCBF基因及其啟動(dòng)子CbCBFP包含序列表SEQ ID NO. 1所示序列中的2283位堿基的核酸 序列，該核酸序列編碼一個(gè)受低溫誘導(dǎo)的、能調(diào)控冷誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄因子。
所述薺菜啟動(dòng)子CbCBFP區(qū)包含兩個(gè)串聯(lián)排列的ABRE順式作用元件ACGTGGC和 CACGTG，和三個(gè)MYCRE順式作用元件CANNTG。 所述的啟動(dòng)子CbCBFP全部或部分序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體。 所述的啟動(dòng)子CbCBFP全部或部分序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化培育 抗寒植物的方法。 所述的啟動(dòng)子CbCBFP全部或部分序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化培育 抗寒植物材料。所述的抗寒植物材料是指植株、種子或無(wú)性細(xì)胞系。 按照以上的技術(shù)方案，很顯然，人們可以利用本發(fā)明所提供的CbCBFP啟動(dòng)子構(gòu)建 抗寒相關(guān)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物以提高植物的抗寒性。受體植物主要包括水稻、小麥、玉 米等在內(nèi)的禾谷類作物，當(dāng)然也包括其他一些重要的經(jīng)濟(jì)作物，例如棉花、油菜或番茄作物 上的應(yīng)用。 序列表SEQ ID NO. 1，為本發(fā)明克隆的包含啟動(dòng)子序列CbCBFP的薺菜冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄 因子CbCBF基因序列全長(zhǎng)和引物的序列。序列表SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 4，為本發(fā)明用于克隆薺菜CbCBF基因啟動(dòng)子CbCBFP序列的引物序列。 序列表SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6，為本發(fā)明用于克隆薺菜CbCBF基因序列的引物 序列。


圖1顯示的是CbCBF基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件。斜體標(biāo)注序列為開(kāi)放閱讀框 (ORF);兩個(gè)ABRE元件用和三個(gè)MYCRE順式作用元件加文本框表示；灰色背景顯示的是基 本啟動(dòng)子元件序列。雙下劃線為擴(kuò)增CbCBF基因所用的引物序列；單下劃線序列為擴(kuò)增 CbCBF基因啟動(dòng)子所用的引物序列。 圖2顯示的CbCBF基因的誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明只有在低溫誘導(dǎo)條件下(4°C for 8h) ， CbCBF基因才出現(xiàn)表達(dá)條帶。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō) 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常 按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York : Co Id Spring Harbor LaboratoryPress， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1薺菜CBFP啟動(dòng)子的分離和鑒定
1.薺菜幼苗的培養(yǎng) 薺菜種子來(lái)源于上海市種子公司，薺菜種子經(jīng)過(guò)消毒處理后，播種于含有MS。培養(yǎng) 基的培養(yǎng)罐內(nèi)，置于25t:下培養(yǎng)4周，其中光照周期為16h光照，8h黑暗。
2.啟動(dòng)子序列的克隆 采用Genome walking技術(shù)擴(kuò)增薺菜CbCBF基因的啟動(dòng)子序列。實(shí)驗(yàn)操作按照 UniversalGenomeWalker Kit (CLONTECH)的使用手冊(cè)進(jìn)行。薺菜的Genome walking庫(kù)建 好后，根據(jù)CBF基因(GenBank Accession No. :AY391121)的cDNA序列的開(kāi)放閱讀框(ORF) 設(shè)計(jì)2條引物5' -TCCGACGAACTCCTC TGTAAAC TGG-3'(記為SEQ ID NO. 2)和5' -CGGG TCTCACGAMCTTCTTCCTAC-3'(記為SEQ ID NO. 3)，與試劑盒中的2個(gè)接頭引物配合，進(jìn)行兩 輪PCR反應(yīng)，同時(shí)電泳檢測(cè)兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。挑選第二輪中的特異條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序。 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計(jì)1條引物(5' -AAGGCTGTTACTCACTCATTGTC-3')(記為SEQ ID NO. 4)，與試劑盒中的接頭引物2配合，進(jìn)行第3輪PCR反應(yīng)，電泳檢測(cè)并克隆、測(cè)序。
測(cè)序顯示克隆到的CbCBF基因的啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)1623bp(記為SEQ ID NO. 1)。薺 菜CbCBF基因編碼框的第一個(gè)起始密碼子在(1624-1626bp)處，第一個(gè)起始密碼子ATG前 的1623個(gè)堿基為CbCBF基因的5'側(cè)翼序列，命名為CBFP。
實(shí)施例2薺菜CBF途徑關(guān)鍵基因CbCBF基因的誘導(dǎo)表達(dá) 通過(guò)半定量RT-PCR驗(yàn)證CbcbfmRNA的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)。以野生型薺菜為材料， 依次按照三種不同的低溫誘導(dǎo)條件處理材料28°C 4d;4°C 8h;28°C 4d。依次提取三個(gè)不 同階段的三種薺菜葉片總RNA，電泳檢測(cè)并測(cè)定所抽提RNA的OD，值。使用One St印PCR Kit(Takara)進(jìn)行半定量RT-PCR。 RT-PCR反應(yīng)條件為50°C 30min，隨之94°C lmin，60。C lmin和72t: 2min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。未誘導(dǎo)的RNA被抽提用于ubiquitin基因(約250nt)的擴(kuò)增(AY189972)，用作對(duì)照便于更好的比較分析。 結(jié)果表明只有在低溫誘導(dǎo)條件下(4°C for 8h)， CbCBF基因才出現(xiàn)表達(dá)條帶(圖 2)。這說(shuō)明CbCBF基因的轉(zhuǎn)錄是受低溫條件觸發(fā)的，并且當(dāng)解除誘導(dǎo)條件時(shí)，其轉(zhuǎn)錄不能維 持很長(zhǎng)的時(shí)間。該結(jié)果證明CbCBF基因的確與冷適應(yīng)過(guò)程相關(guān)。
實(shí)施例3薺菜CBFP啟動(dòng)子低溫誘導(dǎo)活性分析 在該實(shí)施例中，將克隆得的薺菜CBFP啟動(dòng)子序列連至pCAMBA1301載體上 (由澳大禾U亞CAMBIA[the Center of the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture， Australia]提供)，構(gòu)建一個(gè)驅(qū)動(dòng)GUS基因的植物表達(dá)載體。 瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，在單子葉和雙子葉植物中，薺菜CBFP啟動(dòng)子均在低溫誘導(dǎo)下能增強(qiáng) GUS基因的表達(dá)。因此，薺菜CBFP啟動(dòng)子在作物抗寒基因工程中具有較好的應(yīng)用前景。
瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建 在本實(shí)施方案中，構(gòu)建成瞬時(shí)表達(dá)載體pCAMBA1301-CBFP-GUS 切除商品化的植物表達(dá)載體pCAMBA1301自帶的CaMV35S啟動(dòng)子，連入薺菜CBFP
啟動(dòng)子，調(diào)控GUS基因的表達(dá)。用商品化的植物表達(dá)載體pCAMBA1301，作為薺菜CBFP的啟
動(dòng)子在單子葉和雙子葉植物中瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。 基因槍法轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織和煙草幼葉 以1300psi系統(tǒng)壓力和28時(shí)滎柱真空度，在Bio-Rad公司DuPont PDS1000/He型 基因槍上，分別轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織和煙草幼葉，每槍1 P g質(zhì)粒DNA。玉米胚性愈傷組織 在N6培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)，煙草幼葉在1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。用薺菜CBFP啟動(dòng)子啟動(dòng)的誘 導(dǎo)型表達(dá)載體pCAMBA1301-CBFP-GUS轉(zhuǎn)化，以組成型表達(dá)載體pCAMBA1301為對(duì)照，各轉(zhuǎn)化 玉米胚性愈傷組織150塊和煙草幼葉90片。
低溫逆境處理和GUS組織化學(xué)染色 轉(zhuǎn)化后將1/2玉米愈傷組織轉(zhuǎn)移至Ne培養(yǎng)基上，27t:黑暗培養(yǎng)；l/2煙草幼葉轉(zhuǎn)移 至1/2MS培養(yǎng)基上，24t:條件下，每天16h光照培養(yǎng)，作為正常生長(zhǎng)條件的對(duì)照。同時(shí)將另
外1/2玉米愈傷組織或煙草幼葉在原培養(yǎng)基上于4t:低溫培養(yǎng)。 處理3d以后，用GUS反應(yīng)液(0. lmol/LNaH2P04緩沖液，pH 7. 0 ; 10mmol/LEDTA， pH 7. 0 ;5mmol/L鐵氰化鉀；5mmol/L亞鐵氰化鉀；1. Ommol/L X-gluc ;0. 1% Triton X-100)浸 泡上述各處理的玉米愈傷組織或煙草幼葉，抽真空(200Mbar，重復(fù)2次，每次30s) ，37。C溫 育16h，用蒸餾水清洗。玉米愈傷組織無(wú)色素干擾，直接在顯微鏡下觀察拍照。煙草幼葉有 色素干擾，用固定液(無(wú)水乙醇冰乙酸=3 : 1)固定lh，25% _95%乙醇逐級(jí)脫色脫水， 蒸餾水清洗，然后觀察拍照。 GUS基因的表達(dá)產(chǎn)物，可將反應(yīng)液中的X-Gluc水解成藍(lán)色物質(zhì)，使組織呈現(xiàn)藍(lán)色， 藍(lán)色的深淺及斑點(diǎn)數(shù)量，能在一定程度上反應(yīng)GUS基因的表達(dá)水平。在低溫和對(duì)照條件下， 用組成型表達(dá)載體pCAMBA1304轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織和煙草幼葉，正常顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。用冷 誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pCAMBA1304-CBFP-GUS轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織和煙草葉片，在正常培養(yǎng)條件下 檢測(cè)不到藍(lán)色斑點(diǎn)，無(wú)法鑒別陽(yáng)性克隆，但在高鹽和低溫條件下，玉米愈傷組織和煙草幼葉 均顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)的面積和著色強(qiáng)度均高于用組成型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的對(duì)應(yīng)處理。由此 說(shuō)明，薺菜CBFP啟動(dòng)子在單子葉和雙子葉植物中，均可受低溫誘導(dǎo)，啟動(dòng)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
實(shí)施例4利用薺菜CBFP啟動(dòng)子控制CBF基因轉(zhuǎn)化煙草提高抗寒性
植物表達(dá)載體的構(gòu)建 構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBA2301-CBFP-CbCBF。 在本實(shí)施方案中，CbCBF基因被置于CBFP啟動(dòng)子之后，再連至pCAMBA2301 ，構(gòu)建一
個(gè)植物表達(dá)載體，用于植物的轉(zhuǎn)化。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化 1.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)挑取單菌落，在2ml農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中，28t:培養(yǎng)過(guò)夜；取 lmL以上培養(yǎng)物，加入50mL農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中，28t:培養(yǎng)至0D6。。 = 0. 6_1. 0 ;8000rpm離 心10min，收集菌體，用MS。重懸，使0D6。。 = 1. 0。 2.共培養(yǎng)取煙草無(wú)菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成0.8cmX0.8cm 左右的葉盤，放在MS工培養(yǎng)基上，防止葉盤脫水；將葉盤放入農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，190rpm，28t: 搖床上浸染10min ;用藥勺撈出葉盤，放在滅菌的吸水紙上，吸干葉盤上的多余菌液；將吸 干的葉盤平放在加蓋一層濾紙的MS工培養(yǎng)基上，25t:左右，于暗處共培養(yǎng)約2d。
3.誘導(dǎo)叢生芽共培養(yǎng)后，按以下步驟將葉盤表面的農(nóng)桿菌洗掉，其間不時(shí)搖動(dòng)， 使葉盤充分接觸下列溶液無(wú)菌水，15min ;無(wú)菌水+羧芐青霉素(500mg/L) ， 15min ;MS。+羧 芐青霉素(500mg/L)，20min。用藥勺撈出葉盤，放在吸水紙上，吸干多余水分；將葉盤放在 MS2培養(yǎng)基上，葉盤邊緣輕壓入培養(yǎng)基中；25t:左右，16h光照培養(yǎng)。 4.誘導(dǎo)生根在MS2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)約4周后，將葉緣長(zhǎng)出的幼芽從基部與葉盤切 開(kāi)，將幼芽插入MS3培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，25t:左右，16h光照培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)基因煙草微暈DNA提取及PCR檢測(cè)篩選 1.取少量轉(zhuǎn)基因植株葉片，剪碎，置研缽中，加入lmL提取緩沖液(10Ommol/L Tris ClpH 8.0，20mmol/L EDTA， 500mmol/L NaCl，1.5% SDS)，石開(kāi)磨成槳。
2.吸入1. 5mL EP管中，劇烈搖動(dòng)混勻。
3. 60。C水浴保溫30-60min，不時(shí)顛倒混勻。
4.室溫下10000rpm離心5min。 5.小心吸取上清于新的離心管中，加入等體積氯仿，劇烈震動(dòng)。
6.室溫下10000rpm離心5min。
7.小心將上清吸入新的離心管中。 8.加入1倍體積異丙醇，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。8000rpm離心 5min，棄掉上清；75%酒精洗一次，晾干沉淀。9.加入5 ii L RNaseA(lO y g/ y L) ， 37°C 10min，除去RNA。
10.加50-100 ii L水融解，-20。C貯存。 11.以提取出的DNA為模板，用表達(dá)載體自帶HYG基因引物及CbCBF基因特異性引 物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，鑒定目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草基因組中的表達(dá)狀況。
轉(zhuǎn)基因煙草的DNA提取Southern blot檢測(cè) 煙草葉片DNA的提取取煙草葉片100mg，加入500 y 1提取緩沖液[1倍體積的 DNA提取緩沖液[(63. 77g/L山梨糖醇，12. lg/L Tris-HCl pH8. 2， 1. 861g/L EDTA-NaJ); 1倍體積的核酸裂解緩沖液(200ml 1M Tris-HCl pH 7. 5， 200ml 0. 25M EDTA， 400ml 5M NaCl，20gCTAB，200ml MQ Water) ;0. 4倍體積的5% SDS ;使用前加入亞硫酸氫納(終濃度為 0. 02M)]，65。C水浴放置30min后，加750iil氯仿:異丙醇(24 : 1)，離心(12000rpm) 5min，移取上清液到一新離心管中，加入同體積的冷異戊醇，搖動(dòng)，直到DNA沉淀出現(xiàn)。離心 (12000rpm) 10min，棄去上清液。用70%乙醇洗沉淀，干燥后溶于適量的TE中。
應(yīng)用分光光度法定量分析DNA或RNA，具體操作步驟如下用TE或蒸餾水對(duì)待測(cè) 樣品做適量的稀釋。用TE或蒸餾水作為空白，在波長(zhǎng)為260nm，280nm及310nm處調(diào)節(jié)紫外 分光光度儀讀數(shù)至零，加入樣品溶液于三處波長(zhǎng)處讀取OD值，記錄OD值，并通過(guò)計(jì)算確定 DNA或RNA的濃度和純度。 探針的制備我們?cè)O(shè)計(jì)了用于克隆薺菜的CBF的核苷酸序列的引物 (5' -ATGTCTTTCTCAGGAGCTGT-3'和5' -CTACTTGGTGGCATCCTTAG-3')(分別記為SEQID N0.5和記為SEQ ID N0.6)，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為660bp(CbCBF基因)作為雜交探針的模板， 采用PCR法對(duì)探針實(shí)行地高辛-dUTP(digoxigenin(DIG)-dUTP) (PCR DIGProbe Synthesis Kit, Roche)標(biāo)記。于冰水上在2個(gè)標(biāo)號(hào)的500 y L E卯endorf管中分別加入CbCBF的膠 回收產(chǎn)物0. 1 ii L， 10XPCR buffer (with MgCl2) 5 ii L， 10XPCR Dig Mix 5iiL，10XdNTP stock solution 5 u L， 10 u mol/L弓l物11 u L， 10 u mol/L弓l物21 u L， Enzyme mix, Expand High Fidelity 0. 75 ii L(2. 6單位)，ddH20 32. 15 ii L，總體積50 ii L?；靹蚝筠D(zhuǎn)到已預(yù)熱到 94°C的PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4。C ， 2min — (94°C ， 30sec — 60°C ， 30sec — 72°C ， 40sec) X30cycles — 72。C，10min。每管取5 y L PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖/溴乙錠/1 X TAE凝膠 電泳和紫外檢測(cè)后，判斷探針是否標(biāo)記上及濃度。 酶切選取探針序列中不具有識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII分別對(duì) 薺菜基因組DNA進(jìn)行酶切，在2只500 ii L E卯endorf管中分別加入以下成分成分EcoRI組HindiII組10X buffer15ii L NEBuffer215ii L NEBuffer2DNA40ii "30ii g)40ii "30ii g)酶(10imits/u UEcoRI 12ii LHindIII 12iiL去離子H2083ii L83ii L 輕輕混勻后于37t:溫育24h以上，酶切3h后輕輕混勻一次，酶切24h后每管取 5 L于0. 5%瓊脂糖/溴乙錠/1 X TAE凝膠電泳，直至確認(rèn)酶切已基本徹底后轉(zhuǎn)入下一步。 Southern凝膠電泳向每管酶切產(chǎn)物中加入355 ii L ddH2(^P 500 ii L酚氯仿 異戊醇，顛倒混勻lOmin ; 1. 12000rpm離心lOmin ; 2.吸上清，加入1000 ii L-2(TC預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻； 3. 12000rpm離心lOmin ; 4.棄上清，稍干燥后用30 ii L TE (pH 8. 0)溶解沉淀； 5.配制0.8%瓊脂糖/1 X TAE凝膠; 6.凝膠冷后向每管DNA酶切產(chǎn)物中加入5 ii L6X上樣buffer,上樣； 7.常溫下于1. Ov cm—1電泳12小時(shí)左右至溴酚蘭遷移至凝膠的五分之三距離。 Southern凝膠轉(zhuǎn)膜和固定 1.電泳完畢后取出凝膠，切去多余的膠體，切下左上角作為標(biāo)記，沒(méi)于變性液中振
總體積
150 ii L
150 ii L蕩變性45min ; 2.棄去變性液，用ddH20稍事清洗后于中和液中振蕩中和2X 15min。 3.架好毛細(xì)管轉(zhuǎn)膜的平臺(tái)，倒入500mL 20 X SSC于鋁盒中，鋪好雙層3匪濾紙橋并
潤(rùn)濕； 4.將凝膠孔口一面向下置于平臺(tái)上，趕去氣泡； 5.切一張與凝膠一樣大小的HyboncHT尼龍膜，潤(rùn)濕后鋪于凝膠上，趕去氣泡；
6.用Parafilm圍住凝膠的四邊，以防短路； 7.切取與尼龍膜一樣大小的兩層3匪濾紙鋪于尼龍膜上，趕去氣泡； 8.壓上一疊與尼龍膜相同面積的吸水紙，頂上均勻壓一 500g左右的法碼盒，轉(zhuǎn)膜
24h以上； 9.轉(zhuǎn)膜完成后，取下凝膠用溴乙錠染色10min，并進(jìn)行紫外檢測(cè)，檢查轉(zhuǎn)膜效率； 10.同時(shí)用6 X SSC漂洗尼龍膜2 X 5min ; 11.將尼龍膜置于吸水紙上于室溫晾干30min ; 12.用3匪濾紙裹住尼龍膜于80°C固定2h ; 13.將尼龍膜包裹于錫泊紙中，室溫保存?zhèn)溆谩?探針與尼龍膜的Southern雜交和檢測(cè) 1.將尼龍膜取出浸入2XSSC中5min， DNA面向上鋪于雜交管中； 2.加入20mL DIG Easy Hyb (Roche)，于Shake <n， Stack雜交爐(Hybaid)中于
42。C轉(zhuǎn)動(dòng)預(yù)雜交30min ; 3.倒出預(yù)雜交液，加入12mL新鮮的DIG Easy Hyb，繼續(xù)于42"轉(zhuǎn)動(dòng)預(yù)雜交；
4.將適當(dāng)數(shù)量的檢測(cè)已標(biāo)好的探針液于沸水浴中水浴變性5min，冰水中急冷 3min ; 5.將探針迅速加入到熱的DIG Easy Hyb中，42。C轉(zhuǎn)動(dòng)雜交16h ;6.雜交時(shí)間到后取出尼龍膜，溫室下于2XSSC、0. 1% SDS洗2X5min ; 7.68。C下于0. 1XSSC、0. 1% SDS中洗滌尼龍膜2X 15min ;8.室溫下于100mL Washing Buffer (Roche)中振蕩漂洗膜2min ; 9.室溫下將膜于lOOmL Blocking Solution中振蕩阻斷l(xiāng)h ; 10.室溫下將膜于20mL AP Solution(DIG Luminescent Detection Kit, Roche)
中振蕩平衡30min ; 11.室溫下于lOOmL Washing Buffer中振蕩漂洗尼龍膜2 X 15min ; 12.室溫下將尼龍膜與20mL Detection Buffer加G Luminescent Detection
Kit, Roche)平衡3min ; 13.將膜于雜交袋中，DNA —面向上并均勻鋪上lmL CSPD(DIG LuminescentDetection Kit, Roche)，封閉均勻，于37。C預(yù)熱lOmin ;
14.于暗室中壓上一張F(tuán)uji X光片，37t:保溫10min左右； 15.顯影、停影和定影。定影完成后用大量自來(lái)水沖洗膠片，晾干后按編號(hào)對(duì)應(yīng)在 膠片上標(biāo)出編號(hào)和三個(gè)標(biāo)記點(diǎn)的位置，剪下每張膜對(duì)應(yīng)的膠片。
轉(zhuǎn)基因煙草的總RNA提取及Nouthern blot檢測(cè)
轉(zhuǎn)基因煙草的總RNA提取
探針的制備 采用southern blot設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物，以薺菜總RNA為 模板，分別克隆薺菜CBF的cDNA序歹lj (5 ' -ATGTCTTTCTCAGGAGCTGT-3 ' 和 5' -CTACTTGGTGGCATCCTTAG-3')(見(jiàn)記為SEQ ID NO. 5和記為SEQ ID NO. 6)，獲得擴(kuò)增 片段長(zhǎng)度分別為660bp(CbCBF基因)作為雜交探針的模板，配制瓊脂糖甲醛變性凝膠于一 支18(TC干烤2h的三角瓶中加入DEPC處理過(guò)的水37. 5mL ;10XM0PS 7. 5mL ;RNase-free 的低熔點(diǎn)瓊脂糖0. 55g ;總體積45mL。于微波爐中化膠，冷至60°C時(shí)加入10mL甲醛，混勻 后待冷至45t:左右倒膠，插上3mm梳子，凝膠冷后備用。 RNA變性樣品的制備和電泳取30株轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片和4tH秀導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因煙 草植株的總RNA。事先采用乙醇沉淀法將RNA樣品濃縮至3 i！ g/ i！ L以上，并計(jì)算出每個(gè)樣 品所需RNA的y L數(shù)，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的RNase-free的500 y L E卯endorf管，編號(hào)后分別加 入總RNA 30iig;甲醛7iiL;去離子甲酰胺20iiL;10XM0PS 2ii L ;DEPC處理過(guò)的水補(bǔ)足 至40 ii L混勻后于65。C變性10min，冰上急冷，加入微量溴乙錠和6 y L RNase-free的上樣 buffer,立即上樣，在1XM0PS緩沖液中于lv/cm電泳，待溴酚蘭遷移至凝膠的一半距離時(shí) 轉(zhuǎn)膜。 Northern凝膠轉(zhuǎn)膜、固定和雜交檢測(cè)電泳完畢后取出凝膠，切去多余的膠體，切下 左上角作為標(biāo)記；凝膠用DEPC處理過(guò)的水稍事清洗；采用DEPC處理過(guò)的20XSSC轉(zhuǎn)膜；在 RNase-free的環(huán)境下預(yù)雜交、雜交(均在50°C )和洗片。雜交過(guò)程均同Southern雜交和 檢測(cè)。 轉(zhuǎn)基因煙草的耐寒性試驗(yàn) 將生根兩周的轉(zhuǎn)基因苗與同時(shí)期栽培生長(zhǎng)狀況類似的野生型煙草苗置于4t:光照
培養(yǎng)，冷適應(yīng)3d，之后置于-151:處理暗l-2h，記錄存活苗數(shù)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組重復(fù)，通過(guò) t-檢驗(yàn)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因組與野生型對(duì)照組差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 通過(guò)低溫處理檢測(cè)煙草苗存活率可見(jiàn)，-15t:處理lh后，Cbcbf轉(zhuǎn)基因植株存活率
顯著高于野生型對(duì)照；2h后Cbcbf存活率降低，依然明顯高于野生型植株。三組重復(fù)實(shí)驗(yàn)
數(shù)據(jù)根據(jù)t-檢驗(yàn)證明P < 0. 05，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示薺菜基因Cbcbf的啟動(dòng)子及其編碼
蛋白在植物耐寒性和抗凍性提高方面有重要作用。 薺菜抗寒基因啟動(dòng)子核苷酸序列表 SEQ ID NO. 1 〈110>復(fù)旦大學(xué) 〈120〉薺菜CbCBF基因的編碼序列 〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>2283
〈212>DNA 〈213>薺菜(C即sella bursa-pastoris)
〈400〉 1 CGACGGCCCG GGCTGGTCTG MGACMGAG GATTGTAAGA GTCTMGAGA AATGTGGTGG 60
TCGTTGMCT TGAAGGGAAG MGAGMGAG GATCGTAAGA GAAAGGTGGT GGTTGAAGGA 1209/11頁(yè)6570 75GGAACT TTCCCT ACGGCC GAG ATG GCT GCT CGT GCT CAC GAC GTC GCC1908GlyThr PhePro ThrAla Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala808590 95GCTATA GCCCTC CGTGGC AGG TCA GCC TGT CTC MT TTC GCT GAC TCT1956Alalie AlaLeu ArgGly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser100105 110GCTTGG CGGCTA CGGATC CCC GAG TCA ACA GGC GCC MG GM ATC CAG2004AlaTrp ArgLeu Arglie Pro Glu Ser Thr Gly Ala Lys Glu lie Gin115120 125MGGCG GCGGCT GMGCT GCG CTG GCC TTT CAG GAT GAG ATG ATG ATG2052LysAla AlaAla GluAla Ala Leu Ala Phe Gin Asp Glu Met Met Met130135 140AGCGAT ACCACG ACGACG GAT CAT GGC TTT GAC ATG GAG GM ACG TTT2100SerAsp ThrThr ThrThr Asp His Gly Phe Asp Met Glu Glu Thr Phe145150 155GTGGAA GCAATT GTGACG GCG GM CAG AGC GCT TCG TTA TAT ATA GAC2148ValGlu Alalie ValThr Ala Glu Gin Ser Ala Ser Leu Tyr lie Asp160165 170 175GAAGAG GACATG TTCGGT ATG CCG AGT TTG ATG GCT AGT ATG GCC GM2196GluGlu AspMet PheGly Met Pro Ser Leu Met Ala Ser Met Ala Glu180185 190GGTATG CTTTTG CCTCTG CCG TCC GTA CM TGG AAC CAC MC TAT GAC2244GlyMet LeuLeu ProLeu Pro Ser Val Gin Trp Asn His Asn Tyr Asp195200 205ATCGAC GGCGAT GATGAC GTC TCG CTA TGG AGT TAT TAA2283lieAsp GlyAsp AspAsp Val Ser Leu Trp Ser Tyr210215SEQID NO. 2〈211>25〈212>DNA〈213〉薺菜(C即sellabursa-pastoris)TCCGACGAACTCCTCTGTAAACTGGSEQID NO. 3〈211>25〈212>DNA〈213>養(yǎng)菜(C即sella bursa-pastoris)CGGGTCTCACGAAACTTCTTCCTACSEQID NO. 4
〈211>23 〈212>DNA 〈213>薺菜(C即sella bursa-pastoris) AAGGCTGTTACTCACTCATTGTC SEQ ID NO. 5 〈211>20 〈212>DNA 〈213>薺菜(C即sella bursa-pastoris) ATGTCTTTCTCAGGAGCTGT SEQ ID NO. 6 〈211>20 〈212>DNA 〈213>薺菜(C即sella bursa-pastoris) CTACTTGGTGGCATCCTTAG
權(quán)利要求
一種分離的具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性的薺菜啟動(dòng)子，其特征在于該啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO1中堿基第1-1623位的序列所示，記為CbCBFP。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的薺菜啟動(dòng)子，其特征在于該啟動(dòng)子區(qū)包含兩個(gè)串聯(lián)排列的 ABRE順式作用元件ACGTGGC和CACGTG，和三個(gè)MYCRE順式作用元件CANNTG。
3. 如權(quán)利要求1所述的薺菜啟動(dòng)子CbCBFP的植物表達(dá)載體，其特征在于CbCBF基因置 于薺菜啟動(dòng)子CbCBFP之后，再連至pCAMBA2301，記為pCAMBA2301_CBFP_CbCBF。
4. 如權(quán)利要求1所述的薺菜啟動(dòng)子CbCBFP在培育抗寒作物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種薺菜CBF途徑關(guān)鍵基因CbCBF的啟動(dòng)子CBFP及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其中CbCBF基因及其啟動(dòng)子包含序列表SEQ ID NO1所示序列中的2283位堿基的核酸序列，該核酸序列編碼一個(gè)受低溫誘導(dǎo)的、能調(diào)控冷誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄因子。啟動(dòng)子區(qū)域包含兩個(gè)串聯(lián)排列的ABRE順式作用元件，能特異地對(duì)低溫和ABA起應(yīng)答反應(yīng)，和三個(gè)MYCRE順式作用元件CANNTG，能與上游調(diào)控因子ICE(inducer of CBF expression)基因結(jié)合。利用該基因啟動(dòng)子構(gòu)建的誘導(dǎo)性表達(dá)載體可以在植物受到低溫脅迫時(shí)強(qiáng)烈地誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)。本發(fā)明還提供上述啟動(dòng)子在培育抗寒植物中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物品種的改良。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101693891SQ20091019752
公開(kāi)日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月22日
發(fā)明者吳麗華, 周明琦, 林娟 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué);