專利名稱：利用根特異啟動子與抗病基因培育煙草抗青枯病品系方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種運(yùn)用基因工程技術(shù)培育煙草安全抗青枯病種質(zhì)材料的方法，屬于植物 基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙草青枯病是我國南方煙草種植過程中的重要病害，利用傳統(tǒng)的防治手段，長期以來 未能得到有效的解決，給煙草的產(chǎn)量和煙葉的品質(zhì)帶來了嚴(yán)重的影響。煙草青枯病導(dǎo)致煙 株死亡的原因很多，近年來的生物化學(xué)和基因研究表明，胞外多糖(EPS，由印s基因編碼) 以及降解植物細(xì)胞壁的纖維素酶(主要為內(nèi)切葡萄糖酶EG，由egl基因編碼)和果膠酶(主 要是內(nèi)聚半乳糖醛酸酶PG，由pglA基因編碼)是病菌在維管束中群居、蔓延以及植物細(xì)胞 壞死和溶菌作用所必須的因子(Seal S E,et al. 1999)。研究還表明，青枯病菌在導(dǎo)管中生 長時可產(chǎn)生大量的胞外多糖，影響和阻塞植物體內(nèi)水分運(yùn)輸，特別是易于對葉柄和小葉處 較小孔徑的導(dǎo)管孔板造成堵塞而引起植株萎蔫；同時，青枯病菌還分泌細(xì)胞外多種細(xì)胞壁 降解酶(如纖維素酶類和果膠酶類)，其可能也在破壞導(dǎo)管組織，引起植株枯萎死亡方面起 重要作用(何禮遠(yuǎn)和康耀衛(wèi)，1995)
煙草青枯病是一種細(xì)菌性侵染病，是典型的維管束病害，根、莖、葉都可受害。煙草青枯 病最典型的癥狀是枯萎發(fā)病初期，在晴天中午可見煙株的一側(cè)1至2片葉片凋萎下垂，而 夜間可以恢復(fù)，萎蔫一側(cè)的莖上有褪綠條斑，萎蔫葉片仍為青色，故稱“青枯”。發(fā)病中前期， 煙株一直表現(xiàn)為一側(cè)葉片枯萎，另一側(cè)葉片比較正常，這時拔出根部，可見發(fā)病一側(cè)的許多 側(cè)根變黑腐爛，但另一側(cè)比較正常。隨著病情的進(jìn)一步加重，褪綠條斑變?yōu)楹谏珬l斑，可達(dá) 到煙株頂部，發(fā)病中期枯萎的葉片由綠色變淺綠，然后逐漸變黃，大部分葉片萎蔫。有條斑 的莖和根部全部變黑。到發(fā)病后期，全部煙葉萎蔫變黃，根部全部變黑腐爛，直至整株死亡。 擠壓橫切莖部有黃白色的乳狀粘液即菌膿溢出。煙草是四倍體，遺傳背景及其復(fù)雜，主要栽培品種大多數(shù)是已經(jīng)種植十幾年 了，因此容易受到青枯病的危害，且目前尚未特效藥劑能夠防治，因此只能通過選育出新品 種才能有效的抵制青枯病，而傳統(tǒng)育種的育種年很長，且煙草是一種特殊的產(chǎn)品，因此不能 滿足煙草生產(chǎn)的需要。自從1986年，美國Powel-Abel最先報道了將TWV-CP基因轉(zhuǎn)入煙草 獲得了對TMV既有抗性的轉(zhuǎn)CP基因煙草植株以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成功運(yùn)用于煙草的分 子育種與功能基因鑒定方面。國內(nèi)科研工作者已成功將TMV、CMV、馬鈴薯X病毒與Y病毒 (PVX與PVY)等病毒的的CP基因、復(fù)制酶基因?qū)霟煵?，獲得相應(yīng)的抗植物病毒的轉(zhuǎn)基因植 株(方榮祥等，1990 ；1993 ；周汝鴻等，1994 ；吳中心等，1994 ；王振東等，1995 ；項(xiàng)瑜等，1995 ； 吳元華等，1997 ；朱小平等，1998 ；魏振承和Foster G，2000)。RIP具有廣譜的抗病毒活性， 已成為抗病毒病的研究熱點(diǎn)。分子量約為30kDa的商陸抗病毒蛋白(Pokeweed activiral protein, PAP)屬I型堿性核糖體失活蛋白，對TMV、CMV、AMV、PVX、PVY等病毒都具有一定 的抑制作用(Irvin J D，1975)。1993年成功導(dǎo)入煙草即表現(xiàn)出對植物病毒的抗性，對機(jī)械 傳播和蚜蟲傳播的多種病毒均有效。這是第一次RIP基因在植物抗病毒基因工程中發(fā)揮作 用，但RIP基因在抗煙草細(xì)菌性病害上尚無報導(dǎo)，PAP在煙草中適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)可保護(hù)其不受病毒的侵害，但高水平表達(dá)對煙草本身也產(chǎn)生毒害(Lodge J K, et al. 1993)。特異啟動子能 夠定時定量讓基因表達(dá)，因此用特異啟動子攜帶抗病基因在植物里面表達(dá)能在一定程度上 解決基因本身給植物帶來的影響。
本發(fā)明就是針對以上背景技術(shù)，通過分離克隆/？爐基因，與煙草根特異啟動子，將啟 動子、目的基因連接在載體上，構(gòu)建植物表達(dá)載體，建立以抗生素為篩選劑的轉(zhuǎn)基因遺傳體 系，以及快速、高效的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)和接種抗病鑒定，大幅度的提高煙草抗青枯病能力， 為解決煙草安全抗青枯病品種的培養(yǎng)奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用煙草根特異啟動子、抗病基因RIP培育抗青枯病煙草新 品系的方法。所解決的技術(shù)問題是一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全有效的解決煙草青枯病的方 法。本發(fā)明利用煙草根特異啟動子、抗病基因AVT^咅育抗青枯病煙草新品系的方法， 包括包括根特異啟動子的克隆，抗病基因RIP的克隆，抗煙草青枯病表達(dá)載體的構(gòu)建，培育 抗青枯病轉(zhuǎn)基因煙草，以及接種轉(zhuǎn)基因煙草青枯菌進(jìn)行材料的篩選鑒定。具體地說在成熟 苦瓜種子中分離克隆得到核糖體失活蛋白(RIP)基因，以及從煙草DNA組中擴(kuò)增得到煙草 NRT12根特異啟動子，構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草翠碧一號，培育 抗青枯病煙草轉(zhuǎn)基因植株，對煙草轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行青枯菌的接種鑒定，篩選出抗青枯病轉(zhuǎn) 基因煙草的新材料。其中
1.煙草NRT12根特異啟動子核苷酸序列為SEQ ID No. 3所顯示的堿基序列；
2.RIP基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 1所顯示的堿基序列，以及RIP核苷酸序 列所推演的氨基酸序列為SEQ ID No. 2 ；
3.構(gòu)建含有特異啟動子驅(qū)動抗病基因表達(dá)的植物載體PSC1300-NRT12-RIP，構(gòu) 建過程如


圖1所示；其中載體指的是PCAMBIA1300，啟動子是NRT12，基因是RIP核糖體失活 蛋白基因；
4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草獲得抗青枯病轉(zhuǎn)基因煙草植株。根據(jù)上述培育獲得煙草特異啟動子驅(qū)動抗病基因RIP的轉(zhuǎn)基因材料，通過對轉(zhuǎn)基 因煙草進(jìn)行青枯菌接種鑒定，已獲得一批高抗煙草青枯病的轉(zhuǎn)AVP基因煙草的新材料。培 育出來的轉(zhuǎn)RIP基因新材料，其在抗煙草青枯病表現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢，遠(yuǎn)優(yōu)于對照品種和非 轉(zhuǎn)基因的組培后代。獲得的轉(zhuǎn)RIP基因煙草品系，其抗性明顯高于受體品種翠碧一號及非轉(zhuǎn)基因后 代。目前對轉(zhuǎn)RIP基因煙草進(jìn)行根、莖接種鑒定，表明了轉(zhuǎn)基因煙草具有高抗煙草青枯病的 能力。將煙草根特異啟動子與抗病基因RIP結(jié)合在一起構(gòu)建的植物表達(dá)載體，遺傳 轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因煙草，RIP基因不在煙草葉片表達(dá)，符合分子安全育種的有效基因工程手 段。本發(fā)明的載體是將已經(jīng)報道的TtV戶基因與克隆的煙草根特異啟動子相結(jié)合構(gòu)建 植物表達(dá)載體，運(yùn)用于煙草分子育種上，提高分子育種的安全性。其中所克隆得到的/？^基 傻全長為861bp，編碼286個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為32. 03 KDa，等電點(diǎn)為9. 41。融合GST 標(biāo)簽后蛋白分子量為59. 01 KDa0同源克隆得到的煙草NRT12根特異啟動子全長956bp，NtR12啟動子AT占64. 6%, GC占35. 8%。AT豐富序列的低復(fù)雜度有利于DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的解 螺旋，提高基因的轉(zhuǎn)錄效率。啟動子存在GC盒，因?yàn)镚C盒一般位于TATA-box和CAAT_box 的上游，所以猜測這個基因啟動子序列是完整的啟動子。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草新材料具有以下優(yōu)點(diǎn)將煙草根特異啟動子運(yùn)用于煙草分子育 種上，提高了轉(zhuǎn)基因安全性，由根特異啟動子攜帶光譜抗病基因在煙草根和莖部表達(dá)，對煙 草青枯病有較強(qiáng)的抵抗能力甚至達(dá)到免疫功能。通過對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行RT-PCR鑒定，表 明了 RIP基因不在煙草葉片表達(dá)，通過對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行接種青枯菌進(jìn)行抗性鑒定，得到 了高抗煙草青枯病的轉(zhuǎn)基因新材料，為培養(yǎng)高抗煙草青枯病的轉(zhuǎn)基因植株奠定了有利的基 石出。說明書附圖
圖 1 為 Pscl300- NRT12-RIP 的構(gòu)建； 圖2為轉(zhuǎn)基因煙草PCR分子檢測；
圖3為不同轉(zhuǎn)基因煙草及對照RIP基因表達(dá)的TR-PCR檢測；其中泳道1-6分別為轉(zhuǎn)基 因煙草植株RIPlO和RIP-14的根、莖、葉片組織RT-PCR結(jié)果。泳道7-12分別為轉(zhuǎn)基因陰 性植株和非轉(zhuǎn)基因翠碧一號植株的根、莖、葉片組織RT-PCR結(jié)果；
圖4為轉(zhuǎn)基因植株青枯菌的接種鑒定；其中a表示轉(zhuǎn)基因煙草，b表示對照品種。
具體實(shí)施例方式
為了進(jìn)一步更詳細(xì)地闡明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。實(shí)施例1成熟苦瓜種子RNA與煙草基因組DNA的提取
取2. 5g成熟苦瓜種子置于研缽中加液氮研磨，取0. Ig倒入預(yù)冷的0.5ml異硫氰酸胍 變性勻漿液中，充分混勻Imin0加入0. Iml 2mol/L NaAc (ρΗ4· 0)混勻Imin ；加入0. 5ml 水飽和酚，振蕩30秒，冰浴5min。加入0. 2ml氯仿異戊醇(24 1 )，劇烈振蕩2次3min,冰 上放置lOmin。4°C，12000g離心15min。小心移取上層水相，棄去中間和下層有機(jī)相。加 入等體積酚氯仿異戊醇(25 24 :1)，振蕩2次3min，冰上放置5min。4°C，12000g離心 10-15min，移取上層水相，棄去中間和下層有機(jī)相。加入等體積異丙醇，放置-20°C 30分種 以沉淀RNA。4°C，12000g離心15min收集RNA沉淀，用75%乙醇洗滌沉淀；將RNA沉淀在空 氣中干燥。用30ul RNase-free ddH20或去離子甲酰胺溶解RNA沉淀；
取煙草葉片取0. 3g左右的凍存組織，液氮研成粉末。加入500 μ 1裂解緩沖液(IOmmol Tris-Cl pH8. 0 ；0. Imol EDTA pH8. 0 ；0. 5% SDS ；20μ g/ml RNase A)，50°C水浴 3_5hr。加 入500 μ 1平衡酚，振蕩混勻后，于4°C 12000g離心15min，取上層水相。反復(fù)抽提一次。加 入等體積的氯仿異戊醇(24 :1)，振蕩混勻后，于4°C 12000g離心IOmin ；取上層水相，加 入2倍體積的冰預(yù)冷的無水乙醇，置_20°C 20min。以吸頭小心挑取云絮狀物轉(zhuǎn)入另一 Ep 管中，以70%乙醇洗滌1-2次。待沉淀風(fēng)干后，加入100 μ ITE溶液溶解，置-20°C保存。實(shí)施例2苦瓜核糖體失活蛋白基因(RIP)的克隆
通過GENBANK已經(jīng)公布的RIP基因序列，對其所編碼的多聚蛋白氨基酸序列進(jìn)行分 析，設(shè)計引物 MCRIP-BamH I -F5， -CGGCGGATCCGTCACCA TGGTGAAATGCTTACTACT-3，和 MCRIP-Sac I -R: 5’ - CGGCGAGCTCTCAATT
CACAACAGATTCC-3’，將上述實(shí)施例1中所得的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用上面兩對引物進(jìn)行 RT-PCR，獲得一個條帶為861bp的片度，膠回收目的片度，將其連接到pMD 18-T Vector載體上，利用T4連接酶16°C過夜連接，大腸桿菌DH5ci轉(zhuǎn)化涂板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中過 夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行搖菌，提質(zhì)粒，送出去測序。將測序結(jié)果與GenBank中已報道的 序列進(jìn)行序列相似性檢索。檢索結(jié)果表明其與Leelamanit.W.等人已發(fā)表的AY817142.序 列相比，不存在核苷酸的差異，核苷酸序列的同源性為100%。結(jié)果表明我們得到了核糖體 失活蛋白基因片段。實(shí)施例3煙草NRT12根特異啟動子的克隆
利用同源克隆法，合成兩條引物P12_BamH I -F 5’-GCAAGCTTCAAGATC AAAATTTTGA-3 ；PI-Hind III’ -R: 5’ -GTGGATCCAGTAGTACAATTCATTGTGC TTTATATTT-3’，同時在引物上設(shè)計限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind III的識別序列，通過擴(kuò) 增PCR，從煙草基因組中擴(kuò)增克隆到根特異啟動子NRT12。實(shí)施例4煙草NRT12根特異啟動子攜帶抗病基因RIP的載體構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶PST I、EcoR I雙酶切載體PSPROK和載體PCAMBIA1300，并將回收到 的目的片段進(jìn)行純化，用T4連接酶過夜連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α菌株，涂板后，倒置放 在37°C過夜培養(yǎng)后挑起單菌落，用試劑盒提取質(zhì)粒，用PST I , EcoR I雙酶切鑒定，獲得的 重組的載體命名為Psc 1300。利用BamH I、Hind III雙酶切載體Pscl300以及NRT12啟動子，回收目的片段，用 T4連接酶16 °C過夜連接，用大腸桿菌DH5 α菌株轉(zhuǎn)化，涂板后，倒置放在37 °C過夜培養(yǎng)后 挑起單菌落，用試劑盒提取質(zhì)粒，用BamH I、Hind III雙酶切鑒定，獲得的重組的載體命名為 PSC1300-NRT12。分別用BamH I ,Sac I單酶切載體pSC1300_NRT12和膠回收目的基因RIP，并同時 回收酶切產(chǎn)物，用T4連接酶16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci菌株，涂板后，倒置放在 37°C過夜培養(yǎng)后挑起單菌落，進(jìn)行PCR鑒定，挑單個陽性重組菌于Kan含量為50mg. L-I的 LB培養(yǎng)基中37°C振蕩過夜培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒，命名為pSC1300-NRT12-RIP。實(shí)施例5煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
1. 煙草無菌苗的獲得以及根瘤農(nóng)桿菌侵染液的制備
往1. 5毫升的離心管中放入大概200粒左右的CB—1煙草種子，用70%的酒精進(jìn)行消 毒1分鐘，在超凈工作臺上用事先準(zhǔn)備好的無菌水清洗三次用0. 1%的砷汞進(jìn)行消毒10-15 分鐘無菌水再次清洗5次，將處理好的無菌種子種植在1/2MS培養(yǎng)基上。從YEB固體平板上挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落，接種到含有Rif和Km的液體培 養(yǎng)基中，28°C 250rpm培養(yǎng)過夜；取Iml過夜培養(yǎng)的菌液接種到30ml含有相應(yīng)抗生素(或無 任何抗生素)的YEB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至0. D. 600 =0. 6-0. 8,4000rpm, 4°C離心 IOmin,棄上清；沉淀用20ml MS液體培養(yǎng)基(MS大量+ MS微量+20 g/Ι蔗糖，pH=5. 8)重 新懸浮備用。分光光度計測得此時菌液的0. D. 600在0.3-0. 6左右。2. 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化
外植體制備取事先培養(yǎng)的無菌苗嫩葉，剪切成0. 5X0. 5cm大小。葉盤法轉(zhuǎn)化將處 理好的外植體投入制備好的菌液中，浸泡侵染5min后，用含有Cef 500mg/L的無菌水沖 洗3-5次后，接種于共培養(yǎng)基中于28°C暗培養(yǎng)；2天后轉(zhuǎn)入含有Cef 500mg/L, Hyg IOmg/ L的葉片芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，控制溫度為25-28°C、光強(qiáng)為20001eX、每天光照時間 為12-14hr。等葉芽長至Icm大hr，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。待基部伸出大量根系、上部生長至3 4cm的幼苗轉(zhuǎn)至盛有無菌沙土的培養(yǎng)盒內(nèi)，煉苗后轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)基 +0. lmg/L NAA+ lmg/L 6-BA，共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS 培養(yǎng)基+0. lmg/L NAA+ lmg/L 6-BA，誘導(dǎo)篩 選培養(yǎng)基:MS 培養(yǎng)基 +0. lmg/L NAA+lmg/L 6-BA+lOmg/L Hyg +500mg/L Cef，生根培養(yǎng)基 MS 培養(yǎng)基 5mg/L Hyg +500mg/L Cef。實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因煙草的PCR、RT-PCR、抗性檢測
1.采用CTAB法快速提取轉(zhuǎn)煙草基因組DNA，葉片粉末取0. Ig,加入600-700ul CTAB (100 mM Tris ‘ Cl, pH 8. 0 ,20 mM EDTA, pH 8. 0，1. 4 M NaCl)，65°C水浴 15min_30min， 加入相同體積的氯仿異戊醇，劇烈震動lmin，10，OOOrpm.離心lOmin，取上清液到新的離 心管中，加入相同體積的異丙醇(預(yù)冷)10, OOOrpm.離心lOmin，用70%酒精清洗兩次。并 烘干用30-50ul H20溶解，并加入小量的RNAase，取l_3ul用于PCR檢測，檢測的結(jié)果如圖 2所示，圖中陽性轉(zhuǎn)基因植株的根和莖顯示較深的PCR帶。表明轉(zhuǎn)基因植株中含有目的啟 動子、抗病基因及終止子的整個表達(dá)單元元件，目的條帶剛好符合引物所擴(kuò)增的條帶。結(jié)果 表明了已經(jīng)成功的將整個載體Pscl300- NRT12-RIP轉(zhuǎn)入煙草翠碧一號品種中，獲得了轉(zhuǎn) Pscl300- NRT12-RIP的轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株。2.采用Trizol方法提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片總RNA，取5ul總RNA樣品(約2ug)，加 入Iul 0. 5ug/ul的Oligo (dT) 15，于70°C水浴鍋溫浴3min，置于冰上2min，分別加入下列成 分5ul 的 5*RNAM-MLV 緩沖液，9. 5ul 的無水 RNase 的水，2ul 的 dNTPs，0. 5ul 的 RNase 抑 制劑以及2ul的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶?；靹?，瞬間離心，42°C溫浴60min。然后將反應(yīng)物加熱至 75°C，溫浴Smin終止反應(yīng)，冰上冷卻并離心后于-20°C保存。然后利用上述基因引物對煙 草根莖葉進(jìn)行RT-PCR，在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察基因的表達(dá)情況如圖3所示， 結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株，在特異啟動子NRT12驅(qū)使下，抗病基因只在煙草根、莖部表 達(dá)，而在煙草的葉片不表達(dá)。而對照品種翠碧一號與及陰性轉(zhuǎn)基因植株，在煙草的各個部位 都沒有表達(dá)。從而證明了利用NRT12啟動子可以驅(qū)使抗病基因的特異性表達(dá)。3.將實(shí)驗(yàn)室保存的青枯菌種劃板，挑取單克隆于SPA培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取Iml菌 液于新的SPA培養(yǎng)基培養(yǎng)，5個小時后，檢測濃度，OD=O. 5的時候，取出菌液離心，收集菌體， 用等量的無菌水懸浮。用一毫升容量的注射器吸取重懸的菌液接種于轉(zhuǎn)基因植株上，以同 期生長的CB-I作為對照。轉(zhuǎn)基因煙草植株對青枯菌有一定的抵抗能力，個別轉(zhuǎn)RIP基因煙 草植株達(dá)到免疫能力如圖4所示，結(jié)果表明了，在接種同樣量的青枯菌菌液后，轉(zhuǎn)基因煙草 表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫能力，對青枯菌有一定的抑制作用，而對照品種在接種青枯菌過程后，馬 上出現(xiàn)致病的表現(xiàn)，出現(xiàn)葉片凋萎，莖部發(fā)黑等青枯病明顯癥狀。這說明轉(zhuǎn)基因植株在受 青枯菌誘導(dǎo)的情況下，對青枯菌有較強(qiáng)的免疫能力，能起到抑制青枯菌的能力，同時證實(shí)了 RIP基因能對細(xì)菌性病害有一定的抑制能力，證實(shí)了 RIP基因并非只對真菌性病害抑制作 用。
權(quán)利要求
一種利用根特異啟動子與抗病RIP基因培育煙草抗青枯病品系的方法，其特征在于包括根特異啟動子的克隆，抗病基因RIP的克隆，抗煙草青枯病表達(dá)載體的構(gòu)建，培育抗青枯病轉(zhuǎn)基因煙草，以及接種轉(zhuǎn)基因煙草青枯菌進(jìn)行材料的篩選鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用根特異啟動子與抗病/？/^基因培育煙草抗青枯病品系的 方法，其特征在于所述RIP基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列；所述 RIP核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用根特異啟動子與抗病/？/^基因培育煙草抗青枯病品系的 方法，其特征在于所述根特異啟動子為煙草根特異啟動子NtR12，所述啟動子具有如SEQ ID No. 3所示的堿基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用根特異啟動子與抗病/？/^基因培育煙草抗青枯病品系的 方法，其特征在于所述表達(dá)載體為PSC1300-NRT12-RIP，其中所用的載體是PCAMBIA1300, 啟動子是邏T7之基因是/？/^核糖體失活蛋白基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用根特異啟動子與抗病/？/^基因培育煙草抗青枯病品系的 方法，其特征在于利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得抗青枯病轉(zhuǎn)基因煙草。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用根特異啟動子與抗病RIP基因培育煙草抗青枯病品系的方法，包括根特異啟動子的克隆，抗病基因RIP的克隆，抗煙草青枯病表達(dá)載體的構(gòu)建，培育抗青枯病轉(zhuǎn)基因煙草，以及接種轉(zhuǎn)基因煙草青枯菌進(jìn)行材料的篩選鑒定。將煙草根特異啟動子運(yùn)用于煙草分子育種上，提高了轉(zhuǎn)基因安全性，由根特異啟動子攜帶光譜抗病基因在煙草根和莖部表達(dá)，對煙草青枯病有較強(qiáng)的抵抗能力甚至達(dá)到免疫功能。通過對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行RT-PCR鑒定，表明了RIP基因不在煙草葉片表達(dá)，通過對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行接種青枯菌進(jìn)行抗性鑒定，得到了高抗煙草青枯病的轉(zhuǎn)基因新材料，為培養(yǎng)高抗煙草青枯病的轉(zhuǎn)基因植株奠定了有利的基礎(chǔ)。
文檔編號A01H5/00GK101880673SQ20101022746
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者蘭嵐, 莊偉建, 潘建箐, 蔡鐵城, 閆利明, 陳華, 陳順輝 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)