海島棉GbHyPRP1基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因啟動(dòng)子，具體地說，涉及海島棉GbHyPRPI基因啟動(dòng)子。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花不僅是最重要的纖維作物，還是重要的經(jīng)濟(jì)作物，其生產(chǎn)對全球經(jīng)濟(jì)有著巨 大的影響。人類植棉的歷史可追溯至5000~10000年前。目前，全世界有超過80個(gè)國家 進(jìn)行棉花的商業(yè)化種植，如中國、美國、印度、澳大利亞等。中國是全球最大的皮棉生產(chǎn)國與 消費(fèi)國。全球約1億個(gè)家庭從事與棉花相關(guān)的產(chǎn)業(yè)，每年產(chǎn)值約1000億美元。
[0003] 作為主要栽培種的陸地棉是黃萎?。╒erticilliumwilt)菌的重要寄主之一。通 常，黃萎病能夠造成10%~20%的棉花產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)超過60%。目前，對于該病尚無 有效的殺菌劑。隨著棉花基因組測序工作的完成，解析棉花抗黃萎病的分子機(jī)制，挖掘抗 病基因和能激發(fā)植物免疫反應(yīng)的相關(guān)基因，并通過基因工程技術(shù)改良棉花品種黃萎病抗 性對防治棉花黃萎病的發(fā)生不失為一種有效的措施。HyPRP蛋白在植物應(yīng)對多種生物和 非生物脅迫中顯示重要功能。來源于玉米（Zeamays)的ZmHyPRP基因受ABA(abscisic acid)誘導(dǎo)和鹽脅迫而表達(dá)下調(diào)，但是受冷脅迫卻是表達(dá)上調(diào)；草莓（Fragariaxananassa cv.Chandler)的FaHyPRP基因在果實(shí)中特異表達(dá)，并受生長素調(diào)節(jié)；Zhang等發(fā)現(xiàn)敲除 AtHyPRP(EARLIl)基因?qū)⒔档蛿M南芥（Arabidopsisthaliana)對寒冷的抵抗；隨后的試 驗(yàn)又發(fā)現(xiàn)EARLI1基因能夠在低溫下促進(jìn)發(fā)芽以及提高植物的耐鹽性，更重要的是EARLI1 重組蛋白顯示出對灰霉菌（Botrytiscinerea)和尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum)的 抑制作用。來源于甜椒（Capsicumannuum)和煙草（Nicotianabenthamiana)的HyPRPs 蛋白被證明在植物根部的表達(dá)量最高，并且在葉片中過量表達(dá)可引起細(xì)胞程序化死亡 (programmedcelldeath，PCD)和過敏反應(yīng)（hypersensitiveresponse，HR)，而水楊酸 (salicylicacid,SA)、茉莉酸甲酯（methyljasmonicacid,MeJA)和乙?。╡thylene，ET) 等信號分子能夠誘導(dǎo)HyPRPs基因下調(diào)表達(dá)，由此說明該基因負(fù)向調(diào)節(jié)植物抗病性。法國 菜豆（Phaseolusvulgaris)在受到病原菌侵染后，PvPRP表達(dá)量顯著下調(diào)，而在受到機(jī)械 損傷后表達(dá)量顯著上調(diào)，因而認(rèn)為該蛋白在植物免疫中起到負(fù)調(diào)控作用，同時(shí)具有高效表 達(dá)修復(fù)細(xì)胞壁損傷的功能。對苜蓿（Medicagofalcata)中的HyPRP研究顯示，其表達(dá)可 受多種環(huán)境脅迫影響，特別是對于低溫和干旱，且HyPRP表達(dá)可能受一氧化氮信號分子調(diào) 節(jié)。來源于野生番前（LycopersiconesculentumMill.cv.Castlemart)的一個(gè)HyPRP被 命名為LepreproHypSys，它除了參與構(gòu)成細(xì)胞壁，還可在植株受到傷害（機(jī)械的和病原菌 的）后分解成3個(gè)多肽（LeHypSysI，II，和III)，這些小肽能夠起到類似肽激素（p印tide hormones)的功能，即激活植物免疫反應(yīng)。
[0004] 目前，棉花上已報(bào)道的HyPRP基因有5個(gè)，包括許文亮等從陸地棉胚珠和纖維CDNA 文庫中分離的GhHyPRPl和GhHyPRP2。RT-qPCR分析顯示GhHyPRPl在幼苗下胚軸中大量表 達(dá)，而GhHyPRP2在胚珠中優(yōu)勢表達(dá)，暗示它們可能分別在棉花下胚軸伸長以及胚發(fā)育過程 中發(fā)揮作用。GhHyPRP3在棉花花瓣中表達(dá)量豐富，但當(dāng)植物受到鹽或低溫脅迫時(shí)，其在根中 的表達(dá)會(huì)顯著升高；此外，該基因受赤霉素（gibberellicacid，GA)誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)顯著下調(diào)。GhHyPRP4是分離自陸地棉的又一HyPRP基因，編碼一個(gè)由122個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，對 于植物抗寒顯示出潛在的作用。來自于海島棉的GbHyPRPl參與棉花抗黃萎病的過程，且是 一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子?；虻挠行мD(zhuǎn)錄和表達(dá)是發(fā)揮其基因功能的重要條件，基因成功 轉(zhuǎn)錄和表達(dá)需要依靠啟動(dòng)子對其調(diào)控。然而，在本發(fā)明的研究之前，尚無棉花HyPRP蛋白基 因啟動(dòng)子及其調(diào)控元件的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種海島棉GbHyPRPl基 因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供海島棉GbHyPRPl基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQIDNo.1 所示，或該序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的編碼同等功能氨基酸序 列的由SEQIDNo.1衍生的核苷酸序列。
[0008] 第二方面，本發(fā)明提供含有前述啟動(dòng)子的基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNo. 2 所示。
[0009] 第三方面，本發(fā)明提供前述基因序列的克隆方法，具體為：以海島棉基因組DNA為 模板，利用引物采用染色體步移法克隆得到所述基因序列；
[0010] 所述引物的核苷酸序列如下：
[0011]GSP1:5 ' -AACTTGGCGGCTTGCTGGGTGACTTGG-3'
[0012] GSP2:5' -GCGTAAGTTGGCGGCTTGCTTGGTGAC-3，。
[0013] 第四方面，本發(fā)明提供含有前述啟動(dòng)子或前述基因序列的表達(dá)載體。
[0014] 作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體為真核表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選為pBI121載體。例如，所述 真核表達(dá)載體可以為將前述啟動(dòng)子或前述基因序列克隆進(jìn)PBI121載體獲得。
[0015] 第五方面，本發(fā)明提供含有前述表達(dá)載體的宿主。
[0016] 可選的，所述宿主可以為大腸桿菌、模式生物（如擬南芥）、棉花等。
[0017] 例如，所述棉花可以為海島棉Pima90_53或中棉所8號。
[0018] 第六方面，本發(fā)明提供前述啟動(dòng)子或前述基因序列在調(diào)控植物對黃萎病菌的抗病 性方面的應(yīng)用。作為優(yōu)選，所述植物為棉花。更為優(yōu)選，所述棉花為海島棉。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0020] 本發(fā)明提供了海島棉GbHyPRP1基因啟動(dòng)子及GbHyPRP1基因0RF5 '端DNA片段 pGbHyPRPl。并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了所述啟動(dòng)子中與激素和效應(yīng)子調(diào)控相關(guān)的元件，并發(fā)現(xiàn)其具 有啟動(dòng)GUS基因表達(dá)的能力，在根尖優(yōu)勢啟動(dòng)。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明PCR擴(kuò)增GbHyPRPl0RF5'端DNA片段的電泳圖；其中：M:DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)DL5000 ;1:GbHyPRPl0RF5' 端DNA片段。
[0022] 圖2為本發(fā)明所述GbHyPRPl0RF5'端DNA片段序列。
[0023] 圖3為本發(fā)明所述pGbHyPRPl中與激素和效應(yīng)子調(diào)控相關(guān)元件。
[0024] 圖4為本發(fā)明所述pGbHyPRPl在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)模式。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí) 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
[0026] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0027] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 1.供試材料
[0030] 1. 1植物材料
[0031] 供試棉種為抗黃萎病品種海島棉Pima90_53。用于轉(zhuǎn)基因擬南芥為Columbia生態(tài) 型。
[0032] 1. 2菌株與載體
[0033] 大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞（CB104)購自天根生化科技（北京）有限公司。T克 隆載體pEASY-TlSimple購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。農(nóng)桿菌GV3101和植物超表 達(dá)載體PBI121由本研究室保存。
[0034] 1. 3主要試劑
[0035]GenomeWalkingKit購自寶生物工程（大連）有限公司；5-溴-4-氯-3-口引 噪-β-D-葡萄糖苷酸（X-Gluc)購自西格瑪奧德里奇中國公司；Plant GenomicDNAKit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。E.Z.N.A. ?GelExtractionKit購 自美國OmegaBio-tek公司。2XEsTaqMasterMix(含染料）購自康為世紀(jì)生物科技有限 公司。DNAMarkerDL2000和DL5000購自寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑及化學(xué) 藥品均為國產(chǎn)分析純。
[0036]引物委托生工生物工程上海（股份）有限公司合成。
[0037] 1. 4主要儀器
[0038]HirayamaHVE-50 高壓滅菌鍋；Eppendorf移液器；ABI2720PCR儀；北京六一 DYCP-31BN瓊脂糖水平電泳槽；北京六一DYY-iro(P)型電腦三恒多用電泳儀；Thermo ScientificNanoDrop2000超微量分光光度計(jì)。
[0039]2.試驗(yàn)方法
[0040] 2.1基因組DNA提取
[0041] 生長約2周的棉苗根組織用于基因組DNA提取，具體操作按Plant GenomicDNAKit說明書進(jìn)行。
[0042] 2· 2GbHyPRPl0RF5' 端DNA片段克隆
[0043] 2. 2. 1以提取的基因組DNA為模板，采用染色體步移法克隆GbHyPRPl 0RF 5'端 DNA片段，具體操作按照Genome Walking Kit說明書進(jìn)行?；蛱禺愐餅椋?br>[0044]GSP1 :5，-AACTTGGCGGCTTGCTGGGTGACTTGG-3'
[0045]GSP2:5' -GCGTAAGTTGGCGGCTTGCTTGGTGAC-3，。
[0046] 2. 2. 2對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測（110V，20min)，并利用E.Z.N.A. ?Gel ExtractionKit對目的條帶回收。
[0047] 2. 2. 3將膠回收的目的片段與pEASY-TlSimple載體進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：
[0048]