專利名稱：甘薯莖尖的包埋玻璃化超低溫保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘薯種質(zhì)保存及植株再生的技術(shù)，特別涉及甘薯莖尖的包埋玻璃化超 低溫保存方法，屬于甘薯組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長期以來，甘薯的很多品種在推廣生產(chǎn)后迅速退化，喪失新品種的優(yōu)良種性，對 甘薯的產(chǎn)量與品質(zhì)造成極大影響。因此，如何較好地收集和保存甘薯種質(zhì)資源逐漸受到 重視。目前，常用的保護植物種質(zhì)資源的方法都有著各自的局限性。眾多的試驗表明，包 埋玻璃化法超低溫冷凍保存植物種質(zhì)技術(shù)是較為理想的一種方法。它的功能及優(yōu)點如 下1、長期保持種質(zhì)活力，2、凍存材料后的遺傳穩(wěn)定性好，3、同時處理大量材料、處理后 材料恢復生長快、對材料毒害小及出芽率高，4、操作簡單等優(yōu)點?，F(xiàn)有的包埋玻璃化超低 溫保存技術(shù) A,參見 D. Hira, A. Sakai, Simplified cryopreservation of sweet potato [Ipomoeabatatas(L.)Lam. ]by optimizing conditions for osmoprotection,Plant Cell Reports, (2003)21 :961_9660目前已有包埋玻璃化法應(yīng)用于蘋果、葡萄、馬鈴薯以及木薯等多種植物上的報道。 但至今未發(fā)現(xiàn)有中國甘薯品種用包埋玻璃化超低溫方法保存的應(yīng)用。本發(fā)明中的甘薯莖尖的包埋玻璃化超低溫保存技術(shù)，根據(jù)對國內(nèi)品種進行研究， 提出一種適合中國甘薯品種的超低溫保存技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種適合中國甘薯品種的甘薯莖尖包埋玻璃化 超低溫保存方法及冷凍后植株再生的技術(shù)。術(shù)語說明MS(murashige skoog)是組織培養(yǎng)常用基本培養(yǎng)基，屬于本領(lǐng)域公知術(shù)語。MS固 體培養(yǎng)基可用于誘導愈傷組織，也可用于胚、莖段、莖尖及花藥的培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基用于 細胞懸浮培養(yǎng)。MS培養(yǎng)基的無機養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，可滿足植物細胞在營養(yǎng)上和 生理上的需要。PVS (plant vitrification solution)玻璃化溶液即植物玻璃化溶液，是處理植 物樣品的復合高滲溶液。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，步驟如下1.從甘薯的試管苗上取1 1.5mm甘薯莖尖；將甘薯莖尖移入到濃度為3克 /IOOrnl的海藻酸鈉和0. 2M甘油的無鈣離子的MS溶液中，室溫浸泡5 20秒；2.將含有11. lg/1 CaCl2,2M甘油、0. 2M蔗糖的MS溶液在冰塊中預冷15 25分 鐘，將步驟1的甘薯莖尖連同浸泡溶液一起加入其中，形成直徑為0. 5-0. 8cm甘薯莖尖小 球；將甘薯莖尖小球依次移入以下預培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)
將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基I溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基I溶液配方為 MS+30g/l蔗糖+lg/Ι酪蛋白氨基酸，搖床培養(yǎng)24小時，25 28°C，60 90rpm ；將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基II溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基II溶液配方為 MS+0. 3M蔗糖，搖床培養(yǎng)16小時，25 28°C，60 90rpm ；將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基III溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基III溶液配方為 MS+1. 6M蔗糖+2M甘油，搖床培養(yǎng)3小時，25 28°C，60_90rpm。制得預培養(yǎng)好的甘薯莖尖小球。3.將上述預培養(yǎng)好的甘薯莖尖小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中， 25°C 培養(yǎng) 90 120min。4.將步驟3處理過的甘薯莖尖小球移入2ml規(guī)格的超低溫管中，每個管中裝8_10 個小球，置入液氮中冷凍保存。當需要將冷凍保存的甘薯莖尖恢復培養(yǎng)時，繼續(xù)進行以下步驟5.將步驟4得到的盛有小球的超低溫管從液氮中取出，迅速移到38°C的水浴鍋 中，解凍2-4分鐘，將小球放入卸載溶液中，室溫，放置20-25min。卸載溶液組成為1. 2M蔗糖+MS，pH5. 8。6.將步驟5得到的小球移入盛有25ml成活培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，成活培養(yǎng)基配方 為:MS+0. 5mg/l 6-芐氨基嘌呤+lmg/1赤霉素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH5. 8，25°C黑暗 培養(yǎng)3天；然后在24-28°C培養(yǎng)7天，并保持每天16小時的30001ux光照培養(yǎng)和每天8小 時的黑暗培養(yǎng)。得成活小球。7.將上述成活小球移入盛有25ml再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在24_28°C培養(yǎng)并保持 每天16小時的30001UX光照，培養(yǎng)成苗，每隔三周，將成苗小球轉(zhuǎn)移到盛有新配的再生培養(yǎng) 基的培養(yǎng)皿中。所述再生培養(yǎng)基配方為MS+2. 5mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH 5. 8。待成苗小球的苗長達0. 4-0. 6cm時，轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中生根。上述步驟3中PVS玻璃化溶液組成為MS+30克/IOOml甘油+15克/IOOml乙二 醇 +15 克 /IOOml 二甲基亞砜(DMSO) +0. 4M 蔗糖，pH 5. 8。本發(fā)明方法中所述甘薯為中國甘薯品種，進一步優(yōu)選的是濟薯18或濟徐23。本發(fā)明方法中步驟4冷凍保存60min以上，可以長久保存。本發(fā)明的優(yōu)良效果如下1、本發(fā)明確定了中國甘薯品種的保存方法，經(jīng)試驗證明以前公開報道的技術(shù)都不 適合我國的甘薯品種的種質(zhì)保存，特別是濟薯18和濟徐23甘薯品種。本發(fā)明方法超低溫 冷凍后的成活率80-90 %，現(xiàn)有技術(shù)僅為30-35 %。2、本發(fā)明以中國甘薯品種的甘薯苗為材料，無需預培養(yǎng)將其莖尖進行包埋。在不 同濃度的蔗糖MS溶液中進行包埋后預培養(yǎng)，在玻璃化溶液脫水處理90分鐘，超低溫冷凍保存。3、本發(fā)明方法在超低溫冷凍后的恢復培養(yǎng)后，不經(jīng)過愈傷組織直接出芽形成完整 的小植株，可以進行大量的無性繁殖。4、本發(fā)明的方法所用材料來源于國內(nèi)甘薯品種，操作簡單、有效，長期凍存后材料 恢復生長快。


圖1中發(fā)亮白色的小球為成活小球，實施例1步驟6。圖2為恢復培養(yǎng)后生成的小植株，苗長達0. 5cm,實施例1步驟7。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例中使用的MS培養(yǎng)基為上海源葉 生物科技有限公司產(chǎn)品。配方如表1表1. MS 配方 實施例1 中國甘薯品種為濟薯18一種甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，步驟如下1.從甘薯(濟薯18)的試管苗上取1. 5mm甘薯莖尖；將甘薯莖尖移入到3% (克 /ml)海藻酸鈉和0. 2M甘油的無鈣離子的MS溶液中，室溫浸泡15秒；2.將含有11. lg/1 CaCl2、2M甘油、0. 2M蔗糖的MS溶液在冰塊中預冷20分鐘，將步驟1的甘薯莖尖連同浸泡溶液一起加入其中，形成直徑為0. 5-0. 6cm甘薯莖尖小球；將甘 薯莖尖小球依次移入以下預培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基I溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基I溶液配方為 MS+30g/l蔗糖+lg/Ι酪蛋白氨基酸，搖床培養(yǎng)24小時，25°C，90rpm ；將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基II溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基II溶液配方為 MS+0. 3M 蔗糖，搖床培養(yǎng) 15-16 小時，25°C，90rpm ；將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基III溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基III溶液配方為 MS+1. 6M蔗糖+2M甘油，搖床培養(yǎng)3小時，25°C，90rpm。制得預培養(yǎng)好的小球。3.將上述預培養(yǎng)好的小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25°C培養(yǎng) 90min，PVS玻璃化溶液組成為MS+30% (克/ml)甘油+15% (克/ml)乙二醇+15% (克 /ml) 二甲基亞砜(DMSO)+0. 4M 蔗糖，pH 5.8。4.將步驟3處理過的小球移入2ml規(guī)格的超低溫管中，每個管中裝8_10個小球， 置入液氮中，保持1小時；當需要將冷凍保存的甘薯莖尖恢復培養(yǎng)時，直接進行以下步驟5.將盛有小球的超低溫管從液氮中取出，迅速移到38°C的水浴鍋中，解凍3分鐘， 將小球放入卸載溶液中，室溫，放置20min。卸載溶液組成為1. 2M蔗糖+MS，pH5. 86.將小球移入盛有25ml成活培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，成活培養(yǎng)基配方為MS+0. 5mg/ 16-芐氨基嘌呤+lmg/1赤霉素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH5. 8，25°C黑暗培養(yǎng)3天；然后 在25°C培養(yǎng)7天，并保持每天16小時的30001UX光照培養(yǎng)和每天8小時的黑暗培養(yǎng)。得成 活小球。7.將成活小球移入盛有25ml再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在25°C培養(yǎng)并保持每天16 小時的30001UX光照，培養(yǎng)成苗。每隔三周，將小球轉(zhuǎn)移到新鮮的盛有再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿 中。所述再生培養(yǎng)基配方為:MS+2. 5mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH 5. 8。待苗長達0. 5cm時，轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中生根。實施例2 中國甘薯品種為濟徐23步驟如實施例1所述，所不同的是1.從甘薯(濟徐23)的試管苗上取1. Omm甘薯莖尖；將甘薯莖尖移入到3% (克 /ml)海藻酸鈉和0. 2M甘油的無鈣離子的MS溶液中，室溫浸泡10秒；2.將含有11. lg/1 CaCl2、2M甘油、0. 2M蔗糖的MS溶液在冰塊中預冷20分鐘，將 步驟1的甘薯莖尖連同浸泡溶液一起加入其中，形成直徑為0. 6-0. 8cm甘薯莖尖小球；將甘 薯莖尖小球依次移入以下預培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基I溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基I溶液配方為 MS+30g/l蔗糖+lg/Ι酪蛋白氨基酸，搖床培養(yǎng)24小時，28°C，60rpm ；將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基II溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基II溶液配方為 MS+0. 3M 蔗糖，搖床培養(yǎng) 15-16 小時，28°C，60rpm ；將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基III溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基III溶液配方為 MS+1. 6M蔗糖+2M甘油，搖床培養(yǎng)3小時，28°C，60rpm。
制得預培養(yǎng)好的小球。3.將上述預培養(yǎng)好的小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25°C培養(yǎng) 120min，PVS玻璃化溶液組成為MS+30% (克/ml)甘油+15% (克/ml)乙二醇+15% (克 /ml) 二甲基亞砜(DMSO)+0. 4M 蔗糖，pH 5.8。4.同實施例1中步驟4。5.同實施例1中步驟5。6.將小球移入盛有25ml成活培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，成活培養(yǎng)基配方為MS+0. 5mg/ 16-芐氨基嘌呤+lmg/1赤霉素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH5. 8，28°C黑暗培養(yǎng)3天；然后 在28°C培養(yǎng)7天，并保持每天16小時的30001UX光照培養(yǎng)和每天8小時的黑暗培養(yǎng)。得成 活小球。7.將成活小球移入盛有25ml再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在28°C培養(yǎng)并保持每天16 小時的30001UX光照，培養(yǎng)成苗。每隔三周，將小球轉(zhuǎn)移到新鮮的盛有再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿 中。所述再生培養(yǎng)基配方為:MS+2. 5mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH 5. 8。待苗長達0. 5cm時，轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中生根。實施例1-2的實驗結(jié)果如下

注現(xiàn)有技術(shù) A 為 D. Hira, A. Sakai, Simplified cryopreservation of sweet potato[Ipomoea batatas (L.)Lam. ]by optimizing conditions for osmoprotection, Plant Cell Reports, (2003)21 :961_966。
權(quán)利要求
一種甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，步驟如下(1)從甘薯的試管苗上取1～1.5mm甘薯莖尖；將甘薯莖尖移入到濃度為3克/100ml的海藻酸鈉和0.2M甘油的無鈣離子的MS溶液中，室溫浸泡5～20秒；(2)將含有11.1g/l CaCl2、2M甘油、0.2M蔗糖的MS溶液在冰塊中預冷15～25分鐘，將步驟1的甘薯莖尖連同浸泡溶液一起加入其中，形成直徑為0.5 0.8cm甘薯莖尖小球；將甘薯莖尖小球依次移入以下預培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基I溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基I溶液配方為MS+30g/l蔗糖+1g/l酪蛋白氨基酸，搖床培養(yǎng)24小時，25～28℃，60～90rpm；將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基II溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基II溶液配方為MS+0.3M蔗糖，搖床培養(yǎng)16小時，25～28℃，60～90rpm；將小球移入盛有50ml預培養(yǎng)基III溶液的三角瓶中，預培養(yǎng)基III溶液配方為MS+1.6M蔗糖+2M甘油，搖床培養(yǎng)3小時，25～28℃，60 90rpm；制得預培養(yǎng)好的甘薯莖尖小球；(3)將上述預培養(yǎng)好的甘薯莖尖小球移入盛有20ml PVS玻璃化溶液的三角瓶中，25℃培養(yǎng)90～120min；(4)將步驟(3)處理過的甘薯莖尖小球移入2ml規(guī)格的超低溫管中，每個管中裝8 10個小球，置入液氮中冷凍保存。
2.如權(quán)利權(quán)利要求1所述的甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，其特征在于步驟 (3)中PVS玻璃化溶液組成為MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4M蔗糖，pH 5. 8 ；百分比是質(zhì)量體積比，單位克/ml。
3.如權(quán)利權(quán)利要求1所述的甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，其特征在于將冷凍 保存的甘薯莖尖恢復培養(yǎng)時，繼續(xù)以下步驟(5)將步驟⑷得到的盛有小球的超低溫管從液氮中取出，迅速移到38°C的水浴鍋中， 解凍2-4分鐘，將小球放入卸載溶液中，室溫，放置20-25min ；卸載溶液組成為1. 2M蔗糖+MS, ρΗ5· 8 ；(6)將步驟(5)得到的小球移入盛有25ml成活培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，成活培養(yǎng)基配方為 MS+0. 5mg/l 6-芐氨基嘌呤+lmg/1赤霉素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，ρΗ5· 8，25°C黑暗培 養(yǎng)3天；然后在24-28°C培養(yǎng)7天，并保持每天16小時的30001ux光照培養(yǎng)和每天8小時 的黑暗培養(yǎng)，得成活小球；(7)將上述成活小球移入盛有25ml再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在24-28°C培養(yǎng)并保持每 天16小時的30001UX光照，培養(yǎng)成苗，每隔三周，將成苗小球轉(zhuǎn)移到盛有新配的再生培養(yǎng)基 的培養(yǎng)皿中。所述再生培養(yǎng)基配方為MS+2. 5mg/l赤霉素+30g/l蔗糖+7. 5g/l瓊脂，pH 5. 8。待成苗小球的苗長達0. 4-0. 6cm時，轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中生根。
4.如權(quán)利權(quán)利要求1所述的甘薯莖尖包埋玻璃化超低溫保存方法，其特征在于所述甘 薯品種為濟薯18或濟徐23。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甘薯莖尖的包埋玻璃化超低溫保存方法，以中國甘薯品種的甘薯苗為材料，無需預培養(yǎng)將其莖尖進行包埋。在不同濃度的蔗糖MS溶液中進行包埋后預培養(yǎng)，在玻璃化溶液脫水處理90-120分鐘，超低溫冷凍保存；冷凍后的恢復培養(yǎng)，不經(jīng)過愈傷組織直接出芽形成完整的小植株，可以進行大量的無性繁殖。本方法所用材料來源于國內(nèi)甘薯品種，操作簡單，長期凍存后材料恢復生長快。
文檔編號A01H4/00GK101904305SQ20101022849
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者侯夫云, 張海燕, 張立明, 李愛賢, 王慶美, 董順旭, 解備濤 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所