專利名稱：一種猴偏側(cè)帕金森病模型及其藥物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種猴偏側(cè)帕金森病模型及其藥物篩選方法。
背景技術(shù)：
帕金森病(Parkinson’ s disease,PD)的實(shí)驗(yàn)動物模型已有多種，包括小鼠、大鼠的外科損傷或6-羥多巴立體定向注射毀損的模型等。最有價(jià)值的模型動物應(yīng)是和人類神經(jīng)系統(tǒng)尤其是中腦基底節(jié)區(qū)有著相似結(jié)構(gòu)、功能和復(fù)雜程度的物種。靈長類PD動物模型能夠反映PD癥狀的基本特征，是目前最接近人類PD的動物模型，為PD的基礎(chǔ)研究提供了良好的基礎(chǔ)和平臺。劉晟，等，MPTP誘導(dǎo)猴偏側(cè)帕金森病模型的制作，《中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》， 2006年22卷3期，報(bào)道的方法是經(jīng)一側(cè)頸內(nèi)動脈注入1-甲基-4-苯基_1，2，3，6_四氫吡啶(MPTP)，其劑量為1.0-2.0mg/kg，對實(shí)驗(yàn)組猴的行為表現(xiàn)及影像學(xué)表現(xiàn)包括MRI、PET 及SPECT進(jìn)行檢測及酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色；結(jié)果注射MPTP后第5 7天逐漸出現(xiàn)偏側(cè)帕金森病癥狀，肌注阿樸嗎啡后動物向左側(cè)快速旋轉(zhuǎn)；PET檢查示實(shí)驗(yàn)組猴右側(cè) (患側(cè))18F-脫氧葡萄糖平均標(biāo)準(zhǔn)攝取值較左側(cè)明顯減低，SPECT檢查示多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (DAT)顯像右側(cè)紋狀體放射性攝取明顯減低，二者均與對側(cè)及給藥前對比統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性差異(P<0.05)。TH免疫組化染色示右側(cè)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元明顯減少。結(jié)論經(jīng)一側(cè)頸內(nèi)動脈注射MPTP制作偏側(cè)帕金森病猴模型安全、簡單、成模率高，是研究帕金森病的一種理想的帕金森病動物模型。陳生弟，等，多巴誘發(fā)由MPTP制備的偏側(cè)帕金森病猴產(chǎn)生運(yùn)動障礙，《中華神經(jīng)精神科雜志》，1992年25卷1期，該文獻(xiàn)報(bào)道了 MPTP制備的偏側(cè)帕金森病模型，實(shí)驗(yàn)選用雌性恒河猴，麻醉后，鈍性分離暴露右側(cè)頸總動脈，將新鮮配制的鹽酸MPTP (0. 5-0. 7mg/kg，容量0. 7-1. 2ml)溶液緩慢注入頸總動脈內(nèi)。該文獻(xiàn)中注射容量小， MPTP的濃度高，建模操作不安全，易造成造模失敗，文獻(xiàn)中共用5只猴進(jìn)行造模，其中有2只猴因未產(chǎn)生PD癥狀和旋轉(zhuǎn)行為在2周后又重復(fù)注射了 MPTPl次，造模成功率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種猴偏側(cè)帕金森病模型及其藥物篩選方法。本發(fā)明提供了一種猴偏側(cè)帕金森病模型的制備方法，將劑量為0. 45-0. 9mg/kg，施用體積20ml的MPTP，以3ml/min勻速施用于猴。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的劑量為0. 6mg/kg。所述的MPTP施用方法是動脈注射。進(jìn)一步地，所述的MPTP施用方法是夾閉頸外動脈后，采用微量泵經(jīng)頸總動脈逆血流方向勻速注射。采用微量泵勻速注射低濃度藥物可以使用更少的藥物對該側(cè)中腦組織進(jìn)行損傷； 同時(shí)由于作用時(shí)間長，藥物局部吸收更為徹底，一方面節(jié)約了藥物，另一方面也有助于減少對實(shí)驗(yàn)猴的全身影響，實(shí)驗(yàn)操作更安全。本發(fā)明還提供了該方法制備的動物模型在篩選治療偏側(cè)帕金森病的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種篩選治療偏側(cè)帕金森病的藥物的方法，它包括如下步驟a、將劑量為0. 45-0. 9mg/kg的MPTP施用于獼猴，建立猴偏側(cè)帕金森病模型；b、將候選藥物施用于動物模型；C、觀察候選藥物對偏側(cè)帕金森病的量化指標(biāo)的影響情況，并進(jìn)行評分，評價(jià)潛在治療偏側(cè)帕金森病的藥物。其中，步驟a中所述的所述的MPTP的劑量為0. 45-0. 9mg/kg，施用體積20ml，施用速度為3ml/min勻速施用。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟a中所述的劑量為0. 6mg/kg。本發(fā)明造模方法與文獻(xiàn)“陳生弟，等，多巴誘發(fā)由MPTP制備的偏側(cè)帕金森病猴產(chǎn)生運(yùn)動障礙，《中華神經(jīng)精神科雜志》，1992年25卷1期”報(bào)道的方法相比，注射劑量不同 本發(fā)明方法的注射劑量為0. 45-0. 9mg/kg，獲得不同癥狀嚴(yán)重程度模型猴；注射容積不同 本發(fā)明方法將MPTP溶液稀釋至20ml，經(jīng)微量泵勻速注入；注射方式不同本方法為夾閉頸外動脈后，經(jīng)頸總動脈逆血流方向注射。本發(fā)明方法與前述文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明方法夾閉頸外動脈，可防止藥液進(jìn)入頸外動脈系統(tǒng)，減少模型動物癥狀差異；2.本發(fā)明方法將藥物稀釋至20ml，注射藥物濃度更低，建模操作更安全，且藥物持續(xù)灌注時(shí)間長，能被腦組織充分吸收，對建模有利；3.與文獻(xiàn)劉晟，等，MPTP誘導(dǎo)猴偏側(cè)帕金森病模型的制作，《中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》，2006年22卷3期，報(bào)道相比，本發(fā)明方法注射劑量更低，經(jīng)濟(jì)性和安全性更加，同時(shí)可減少對側(cè)腦組織的影響；4.本發(fā)明方法經(jīng)頸總動脈逆血流方向注射，可以使藥物與血液充分混合，并可有效避免注射針頭進(jìn)入非頸內(nèi)動脈系統(tǒng)導(dǎo)致的藥液丟失；5.本發(fā)明方法操作在頸總動脈進(jìn)行，暴露血管容易，穿刺成功率高，若經(jīng)頸內(nèi)動脈注射，由于動物頸內(nèi)動脈位置深、管徑細(xì)，實(shí)驗(yàn)操作難度大，容易失敗，且容易造成該側(cè)頸內(nèi)動脈梗塞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果并可能影響實(shí)驗(yàn)猴存活。本發(fā)明方法制備的動物模型是經(jīng)一側(cè)頸總動脈注射MPTP，可以建立癥狀典型、可靠的帕金森病模型，該模型在建模后1-6個(gè)月內(nèi)癥狀穩(wěn)定性最佳，可以為新藥評估等各類治療性研究的提供良好的實(shí)驗(yàn)動物基礎(chǔ)。采用本方法建立的偏側(cè)猴帕金森病模型具有癥狀明顯而典型，建模后穩(wěn)定性較好的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)動物易存活，便于飼養(yǎng)。模型穩(wěn)定時(shí)間較長，可進(jìn)行多個(gè)階段的藥物治療評價(jià)。另外，本模型在整個(gè)疾病過程中均可以進(jìn)行自身對照，節(jié)省了模型使用量，符合動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)的要求，且更為經(jīng)濟(jì)合理。


圖1 建模方法防護(hù)圖片圖2 建模過程照片，顯示分離暴露的頸總動脈圖3 實(shí)驗(yàn)猴隔離飼養(yǎng)照片圖4 建模前實(shí)驗(yàn)猴活動靈活，警惕性高，表情豐富圖5 在右側(cè)頸總動脈注射MPTP后1周，出現(xiàn)左側(cè)上肢下垂，少用現(xiàn)象。圖6 在右側(cè)頸總動脈注射MPTP后3周，出現(xiàn)左側(cè)肢體失用，運(yùn)動減少現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)猴反應(yīng)較遲鈍。
圖7 偏側(cè)帕金森病猴模型行為學(xué)評分圖8 建模前18FDG-PET-CT掃描顯示實(shí)驗(yàn)猴腦糖代謝活躍，左右對稱。圖9 建模后3個(gè)月wFDG-PET-CT掃描顯示實(shí)驗(yàn)猴雙側(cè)腦糖代謝均較建模前降低， 且右側(cè)降低更為顯著。圖10 注射側(cè)(右側(cè))紋狀體HE X 400圖11 對照側(cè)(左側(cè))紋狀體HE X 400圖12 猴丘腦冠狀切面TH染色大體切片顯示，毀損側(cè)(R)丘腦和蒼白球區(qū)域TH陽性細(xì)胞數(shù)(棕色)較對側(cè)(L)顯著降低。圖13 實(shí)驗(yàn)猴左側(cè)基底節(jié)區(qū)TH染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于右側(cè)(注藥側(cè))；THX100圖14 實(shí)驗(yàn)猴右側(cè)(注藥側(cè))基底節(jié)區(qū)TH染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于左側(cè)，且神經(jīng)元胞體萎縮；THX 100圖15 =D2受體染色大體切片觀察，左右側(cè)無顯著性差異。圖16 實(shí)驗(yàn)猴左右側(cè)紋狀體區(qū)D2受體染色無顯著性區(qū)別；D2X 100圖17 實(shí)驗(yàn)猴左右側(cè)紋狀體區(qū)&受體染色無顯著性區(qū)別；&Χ400
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明猴偏側(cè)帕金森病模型的制備1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕Y狀典型的偏側(cè)MPTP猴帕金森病模型并對模型進(jìn)行綜合評估，使其適用于新藥評估等各類研究。2、實(shí)驗(yàn)方法2. 1實(shí)驗(yàn)動物入選參照實(shí)驗(yàn)猴納入標(biāo)準(zhǔn)(見后述)，由成都平安實(shí)驗(yàn)動物繁育中心購入3只健康成年獼猴。年齡5-7歲，體重5. 0-6. lKg，均為雄性，分別以Ml、M2、M3代表。經(jīng)檢驗(yàn)、檢疫合格后，置于國家(成都)中藥安全性評估中心(GLP)大動物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)猴納入標(biāo)準(zhǔn)①、年齡4-7歲；②、有血液常規(guī)、生化和傳染病等檢測報(bào)告，且檢查結(jié)果正常，無傳染?。虎?、既往未接受其他實(shí)驗(yàn)研究；④、體重4_7Kg;⑤、軀干、肢體及頭面部活動自如；⑥、對外界環(huán)境及刺激反應(yīng)正常。2. 2建模前實(shí)驗(yàn)猴飼養(yǎng)滿足實(shí)驗(yàn)要求的猴在進(jìn)行建模前3周移入GLP中心大動物飼養(yǎng)中心進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，使其適應(yīng)新的生活環(huán)境。所有實(shí)驗(yàn)猴采用專用猴籠，單籠飼養(yǎng)，參照動物福利要求和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會要求，為實(shí)驗(yàn)猴提供全價(jià)飼料和水果，并由專職飼養(yǎng)人員照顧實(shí)驗(yàn)猴日常生活和飲食。飼養(yǎng)環(huán)境提供12小時(shí)照明，供應(yīng)充足的食物和飲用水，并保持猴房通風(fēng)、清潔，維持室內(nèi)溫度15-25攝氏度。定期對飼養(yǎng)間進(jìn)行消毒處理，并對實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行隔離，禁止與實(shí)驗(yàn)無關(guān)人員進(jìn)入飼養(yǎng)間。
2. 3建模前實(shí)驗(yàn)猴行為評估實(shí)驗(yàn)猴在大動物飼養(yǎng)中心單籠飼養(yǎng)3周，飼養(yǎng)期間，固定猴籠及猴籠位置。3周后， 待實(shí)驗(yàn)猴熟悉飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)人員及實(shí)驗(yàn)人員后，采用猴帕金森病行為評分表(詳見表I) 對實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行行為學(xué)評分，記錄基礎(chǔ)評分值。使用攝像機(jī)記錄實(shí)驗(yàn)猴活動情況并存檔。表1 帕金森病猴行為學(xué)評分表
權(quán)利要求
1.一種猴偏側(cè)帕金森病模型的制備方法，其特征在于將劑量為0. 45-0. 9mg/kg，施用體積20ml的MPTP，以3ml/min勻速施用于猴。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的猴偏側(cè)帕金森病模型的制備方法，其特征在于所述的劑量為0. 6mg/kg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的猴偏側(cè)帕金森病模型的制備方法，其特征在于所述的 MPTP施用方法是動脈注射。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的猴偏側(cè)帕金森病模型的制備方法，其特征在于所述的MPTP 施用方法是夾閉頸外動脈后，采用微量泵經(jīng)頸總動脈逆血流方向勻速注射。
5.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的方法制備的動物模型在篩選治療偏側(cè)帕金森病的藥物中的用途。
6.一種篩選治療偏側(cè)帕金森病的藥物的方法，它包括如下步驟a、按權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法將MPTP施用于獼猴，建立猴偏側(cè)帕金森病模型；b、將候選藥物施用于動物模型；c、觀察候選藥物對偏側(cè)帕金森病的量化指標(biāo)的影響情況，并進(jìn)行評分，評價(jià)潛在治療偏側(cè)帕金森病的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的篩選藥物的方法，其特征在于步驟a中所述的劑量為 0. 45-0. 9mg/kg，施用體積20ml，施用速度為3ml/min勻速施用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的篩選藥物的方法，其特征在于步驟a中所述的MPTP施用方法是動脈注射。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的篩選藥物的方法，其特征在于所述的MPTP施用方法是夾閉頸外動脈后，采用微量泵經(jīng)頸總動脈逆血流方向勻速注射。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種猴偏側(cè)帕金森病模型的制備方法，將劑量為0.45-0.9mg/kg，施用體積20ml的MPTP，以3ml/min勻速施用于猴。本發(fā)明還提供了動物模型在篩選治療偏側(cè)帕金森病的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種篩選治療偏側(cè)帕金森病的藥物的方法。采用本方法建立的偏側(cè)猴帕金森病模型具有癥狀明顯而典型，建模后穩(wěn)定性較好的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)動物易存活，便于飼養(yǎng)。模型穩(wěn)定時(shí)間較長，可進(jìn)行多個(gè)階段的藥物治療評價(jià)。另外，本模型在整個(gè)疾病過程中均可以進(jìn)行自身對照，節(jié)省了模型使用量，符合動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)的要求，且更為經(jīng)濟(jì)合理。
文檔編號A01K67/027GK102380106SQ20101027385
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者劉文科, 徐策, 李宏霞, 李鵬, 王偉, 王莉 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院, 國家成都中藥安全性評價(jià)中心, 成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司