專利名稱：二甲雙胍在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物領(lǐng)域，涉及二甲雙胍在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
二甲雙胍(Metformin，Met)為雙胍類口服降血糖藥，臨床用于單純飲食控制不滿意的非胰島素依賴型糖尿病人，尤其是肥胖患者。二甲雙胍具有多種作用機(jī)制，包括延緩葡萄糖由胃腸道的攝取，通過提高胰島素的敏感性而增加外周葡萄糖的利用，以及抑制肝、腎過度的糖原異生。本品不降低非糖尿病患者的血糖水平，患者用藥期間體重通常減輕，血漿 膽固醇、甘油三酯和前P脂蛋白水平降低，外周葡萄糖代謝得到改善。近年來研究認(rèn)為二甲雙胍是AMP激活的蛋白激酶(AMPK)的激動(dòng)劑，能夠增加AMPK的磷酸化水平，使之活化。AMPK在多種病理生理進(jìn)程中發(fā)揮細(xì)胞能量感受器的作用，激活的AMPK可激發(fā)一系列的反應(yīng)來恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)的能量平衡，如啟動(dòng)脂肪酸氧化和糖酵解等分解代謝途徑，增加ATP的產(chǎn)生；同時(shí)，抑制脂肪酸和蛋白合成，減少ATP的消耗。已有研究顯示，二甲雙胍對(duì)包括阿爾茨海默癥在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病具有治療作用，然而其對(duì)帕金森病神經(jīng)損傷的保護(hù)作用目前尚未見報(bào)道。SHAPE \*MERGEF0RMAT
NH2N -I
二甲雙胍分子結(jié)構(gòu)式
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種以中腦黑質(zhì)多巴胺能(DA)神經(jīng)元進(jìn)行性丟失為主要特征、嚴(yán)重危害老年人健康的神經(jīng)退行性疾病。在65歲以上人群中發(fā)病率約為2%，且隨著我國(guó)老齡人口基數(shù)增多，PD的發(fā)病率正逐年上升。預(yù)計(jì)未來10年，我國(guó)罹患PD人數(shù)將達(dá)到全球患者的60%。PD的臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩等。近年來，PD的非運(yùn)動(dòng)癥狀也逐漸受到關(guān)注。目前ro的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，老化、炎癥、遺傳、環(huán)境毒素等多種因素是其共同致病因素；病理機(jī)制包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能受損、軸突傳遞功能障礙、谷氨酸興奮性毒性、活性氧(ROS)水平過高、代謝通路受損、線粒體能量產(chǎn)生減少、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)形成增加或降解不充分。目前臨床治療依然缺乏有效手段，主要延用左旋多巴(L-DOPA)替代治療，盡管能夠緩解大多患者的早期癥狀，卻不能阻止黑質(zhì)DA神經(jīng)元進(jìn)行性凋亡、壞死的病理進(jìn)程和降低死亡率，長(zhǎng)期應(yīng)用還可產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)障礙等嚴(yán)重并發(fā)癥。顯然，帕金森病嚴(yán)重危害人類健康，已給患者、家屬和社會(huì)帶來了極大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，研發(fā)理想的ro神經(jīng)保護(hù)劑和治療策略顯得十分緊迫和必要。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是通過二甲雙胍藥理作用的研究，設(shè)計(jì)其在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)方案
二甲雙胍在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中二甲雙胍可以和藥學(xué)上允許的任意一種輔料制成藥物組合物，也可以作為活性成份和其他與二甲雙胍不發(fā)生拮抗作用的治療帕金森病的現(xiàn)有藥物組成復(fù)方制劑。二甲雙胍可通過不同作用機(jī)制增強(qiáng)現(xiàn)有治療藥物的療效，減輕現(xiàn)有藥物自身的毒性及由此產(chǎn)生的不良反應(yīng)。尤其適合與左旋多巴及COMT抑制劑聯(lián)合使用。二甲雙胍的用量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、體表面積、所治療疾病的嚴(yán)重程度等有所變化，每日可一次或多次使用。
本發(fā)明的理論基礎(chǔ)
迄今為止，ro進(jìn)程中DA神經(jīng)元進(jìn)行性死亡的分子機(jī)制尚未完全清楚，各種病理損傷均可引起細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙和能量代謝紊亂，最終導(dǎo)致DA神經(jīng)元變性壞死。在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量狀態(tài)的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是其中樞組成部分。二甲雙胍近年來被公認(rèn)為是AMPK有效的激動(dòng)劑，激活的AMPK可激發(fā)一系列的反應(yīng)來恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)的能量平衡。AMPK可啟動(dòng)分解代謝途徑，如脂肪酸氧化和糖酵解，從而增加ATP的產(chǎn)生；抑制脂肪酸合成和蛋白合成，減少ATP的消耗，發(fā)揮細(xì)胞能量感受器的作用。同時(shí)，AMPK激活可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)自噬，促進(jìn)損傷的細(xì)胞器和ROS的清除，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；活化的AMPK亦可抑制NF-KB信號(hào)通路，減少細(xì)胞核內(nèi)多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控中樞及外周的代謝性炎癥。因此，二甲雙胍可能具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
I、本發(fā)明將二甲雙胍用于帕金森病整體與細(xì)胞病理模型，結(jié)果顯示二甲雙胍顯著改善慢性MPTP/p模型小鼠行為障礙；減緩中腦多巴胺能神經(jīng)元的損傷與丟失、抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化；在應(yīng)用SH-SY5Y細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍顯著改善神經(jīng)毒素MPP+所致的神經(jīng)元活性與增殖能力的降低，抑制LDH的釋放和ROS的生成。這些研究結(jié)果表明二甲雙胍可用于制備治療帕金森病藥物。2、二甲雙胍顯著改善帕金森病模型動(dòng)物的行為障礙和腦內(nèi)多巴胺水平降低，抑制模型動(dòng)物中腦多巴胺能神經(jīng)元的丟失，減輕膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化；改善神經(jīng)毒素MPP+所致的神經(jīng)元活性降低，抑制LDH的釋放和ROS的產(chǎn)生，具有治療帕金森病的作用。為帕金森病的臨床治療提供了更多選擇，特別是由二甲雙胍作為活性成份與藥用載體組成的制劑，或與其它不同作用機(jī)制的藥物組成復(fù)方制劑用于帕金森病中的臨床治療。本發(fā)明首次驗(yàn)證了二甲雙胍對(duì)帕金森病的治療作用，可作為國(guó)家一類新藥的新用途申請(qǐng)，具有巨大的市場(chǎng)價(jià)值和社會(huì)效益。


圖I. 二甲雙胍對(duì)慢性MPTP/p ro模型小鼠行為學(xué)損傷的影響(n=10)，數(shù)據(jù)均以Mean土S.E.M.表不(其中 * p〈0. 05 vs saline group; # p〈0. 05 vs MPTP/p group)。圖2. 二甲雙胍對(duì)慢性MPTP/p PD模型小鼠紋狀體多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的影響(n=8),數(shù)據(jù)均以Mean土S. E. M.表不(* p〈0. 05，** p<0. 01 vs saline group; # p〈0. 05vs MPTP/p group)，其中A為二甲雙胍對(duì)Dopamine的影響；B為二甲雙胍對(duì)DOPAC的影響；C為二甲雙胍對(duì)HVA的影響。
·
圖3. 二甲雙胍對(duì)慢性MPTP/p PD模型小鼠中腦SNc區(qū)和VTA區(qū)TH+神經(jīng)元的影響(n=4),數(shù)據(jù)均以Mean土S. E. M.表示(免疫組織化學(xué)結(jié)果)(** p<0. 01, *林p<0. 001 vssaline group; ## p<0. 01, ### p<0. OOlvs MPTP/p group),其中 A為免疫組化鏡下結(jié)果;B為SNc區(qū)TH神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果；C為VTA區(qū)TH神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果。圖4. 二甲雙胍對(duì)慢性MPTP/p PD模型小鼠中腦SNc區(qū)和VTA區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化的影響(n=4),數(shù)據(jù)均以Mean土S. E. M.表示(免疫組織化學(xué)結(jié)果)(** p<0. 01, ***p<0. 001 vs saline group; # p〈0. 05，## p<0. Olvs MPTP/p group),其中 A 為免疫組化鏡下結(jié)果；B為SNc區(qū)、C為VTA區(qū)GFAP+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。圖5. 二甲雙胍對(duì)慢性MPTP/p 模型小鼠中腦促炎和抑炎因子表達(dá)的影響(n=5),數(shù)據(jù)均以 Mean土S. E. M.表不，** p<0. 01 vs saline group; # p〈0. 05，##p〈0. Olvs MPTP/p group，其中 A 為 TNF_a、B 為 IL_6、C 為 IL_10、D 為 IL-4 mRNA 水平檢測(cè)結(jié)果。圖6. 二甲雙胍預(yù)處理顯著改善MPP+所致SH-SY5Y細(xì)胞存活率的降低(n=4)，數(shù)據(jù)均以 Mean土S. E. M.表不，林 p<0. 01,林* p<0. 001 vs control group; # p〈0. 05，##p〈0.Olvs MPP+ groupo圖7. 二甲雙胍預(yù)處理顯著抑制MPP+引起的SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放增加(n=6)，數(shù)據(jù)均以Mean土S. E. M.表不，*** p<0. 001 vs control group; ## p<0. 01, ### p<0. OOlvsMPP+ group o圖8. 二甲雙胍預(yù)處理顯著抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和ROS生成增加(n=4),數(shù)據(jù)均以 Mean土S. E. M.表不，* p〈0. 05，林* p<0. 001 vs control group; #p<0. 05, ## p<0. Olvs MPP+ group，其中A為ROS熒光照片，B為Hoechst染色結(jié)果；C為熒光定量分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例I 二甲雙胍對(duì)慢性MPTP/p帕金森病模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用
I.I實(shí)驗(yàn)材料
3-4月齡，雄性C57BL/6J小鼠。喂養(yǎng)條件包括標(biāo)準(zhǔn)飼料，自來水，室溫保持在(24 土2) ° C，濕度50-60%，每日光照與黑暗時(shí)間各12 h。實(shí)驗(yàn)前，將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3天。二甲雙胍(Metformin, Met)購于 Sigma 公司(St. Louis,MO,USA),丙磺舒購自濟(jì)南時(shí)代醫(yī)藥科技有限公司。Met以蒸餾水配制入飲用水中，終濃度5mg/ml。MPTP在給藥前30 min內(nèi)以生理鹽水配制,冰上保存。丙磺舒在給藥前30 min內(nèi)以DMSO配制。I. 2實(shí)驗(yàn)方法
小鼠稱重后隨機(jī)分為 4 組A =Saline ；B MPTP/p ；C MPTP/p+ Met (5 mg/ml)；D Met (5
mg/ml)oMPTP/p慢性神經(jīng)損傷小鼠模型背部皮下注射MPTP (20 mg kg—ll小時(shí)后腹腔注射丙磺舒(250 mg/kg),每次給藥間隔為3. 5天,總計(jì)給藥5周，總量為200 mg/kg ；Met治療(C)組在首次MPTP造模后3天開始給予含5 mg/ml Met的飲用水，連續(xù)自由飲水給藥至取樣。對(duì)照A、D組同法自由飲用水或5 mg/ml Met飲用水。MPTP最后一次給藥7 d后觀察行為學(xué)并取樣檢測(cè)。
行為學(xué)檢測(cè)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)將小鼠放置在20 rpm滾筒上，記錄其從滾筒上掉落的時(shí)間。神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定使用勻漿液(0. IM高氯酸、0. ImM EDTA_2Na)處理紋狀體(IOuL/mg)，按照本實(shí)驗(yàn)室已建立的測(cè)定方法，使用高效液相系統(tǒng)檢測(cè)DA遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物(DOPAC和HVA)的水平。小鼠經(jīng)左心室灌注后，快速取腦，置4%多聚甲醛中后固定、過夜。蔗糖溶液梯度脫水后以O(shè)CT膠包埋，Lecia冰凍切片機(jī)作腦組織連續(xù)切片(30 U m)。按小鼠腦圖譜選取黑質(zhì)部腦片，0.01 M PBS洗滌3次后以3% H2O2孵育15 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗滌3次，用含10% BSA和0.3% Triton X-100的PBS液室溫下封閉I h，分別使用一抗小鼠抗酪氨酸輕化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)抗體(I :4000 in SN, 1:2000 in striatum,購自Sigma),小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體(1:1000，購自Millipore)4 ° C過夜。腦片在PBS洗滌3次后以辣根過氧化物酶標(biāo)記的HRP 二抗(1:800, KPL)孵育I h, 二氨基聯(lián)苯氨(Diaminobenzidin, DAB,購自武漢博士德生物公司)顯色。應(yīng)用立體計(jì)數(shù)法(StereoInvestigator software, Microbrightfield,ffilliston, VT, USA)對(duì)感興趣區(qū)域(Regions of interests, R0I)的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)并做統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。計(jì)數(shù)指標(biāo)與條件分別為1)TH陽性細(xì)胞數(shù)，觀察區(qū)域(ROI)為黑質(zhì)致密部(SNc)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)區(qū)，計(jì)數(shù)框50 X 50 ym;2)黑質(zhì)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)ROI為黑質(zhì)，計(jì)數(shù)框50 X 50 Pm;細(xì)胞計(jì)數(shù)均在X 400光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行。使用蛋白提取試劑盒(購自凱基生物)提取蛋白，電泳分離樣品，結(jié)束后依據(jù)需要選擇濕轉(zhuǎn)或者半干轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉的TBST封閉一小時(shí)，與待檢測(cè)蛋白的一抗結(jié)合反應(yīng)后，再與相應(yīng)的二抗反應(yīng)，最后加入ECL反應(yīng)液，利用化學(xué)發(fā)光儀顯影。進(jìn)一步分析蛋白表達(dá)的變化。I. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
連續(xù)給予MPTP/p 5周，MPTP模型組小鼠滾筒停留時(shí)間顯著縮短，Met治療后小鼠在滾筒上停留時(shí)間與對(duì)照組相似，較MPTP/p組小鼠顯著延長(zhǎng)，表明Met改善模型鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力(圖I)。應(yīng)用HPLC-E⑶系統(tǒng)測(cè)定小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物水平，結(jié)果顯示MPTP/p模型鼠紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物D0PAC、HVA均顯著降低，二甲雙胍治療組相關(guān)遞質(zhì)亦降低(p〈0. 05)，但顯著高于模型組(p〈0. 05)。表明二甲雙胍具有增加ro模型小鼠紋狀體DA遞質(zhì)水平的作用(圖2)。中腦SNc和VTA區(qū)免疫組化TH神經(jīng)元染色結(jié)果顯示(圖3)，MPTP/p模型小鼠中腦SNc和VTA區(qū)TH神經(jīng)元顯著減少(p < 0. 01)，二甲雙胍5mg/ml治療組VTA區(qū)TH神經(jīng)元與對(duì)照組相似無明顯減少(P > 0.05)，SNc區(qū)TH神經(jīng)元較對(duì)照組顯著減少(p〈0. 05)，但顯著高于MPTP模型組(p < 0.01);中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果顯示(圖4)，MPTP/p導(dǎo)致小鼠中腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增殖與活化(較對(duì)照組P < 0.01)，同時(shí)給予二甲雙胍治療組細(xì)胞增殖與活化程度顯著低于MPTP/p模型組(p < 0.01或p < 0.05)。同時(shí)，二甲雙胍顯著抑制中腦炎癥因子的表達(dá)(圖5)。結(jié)果表明，二甲雙胍改善MPTP/p誘導(dǎo)的小鼠行為學(xué)損傷、遞質(zhì)水平降低、中腦SNc和VTA區(qū)DA神經(jīng)元丟失、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化和炎癥因子產(chǎn)生增加的作用，具有治療MPTP/p小鼠ro模型的作用，適用于制備帕金森病的治療藥物。
實(shí)施實(shí)例2 二甲雙胍對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
2.I實(shí)驗(yàn)材料
SH-SY5Y細(xì)胞株多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞株，購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細(xì)胞所。MPP+和Compound C購自Sigma公司(St. Louis, MO，USA);甲氮甲唑藍(lán)(MTT)購自廣州化學(xué)試劑廠；酶標(biāo)儀購自Thermo公司。2.2實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞接種于96孔板上培養(yǎng)24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，隨機(jī)分組。Met( ImM)預(yù)處理30 min后，再給予MPP+(500剛，48h)，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20沿，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 W DMS0,選擇570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。細(xì)胞存活率(％)=實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值X 100%。藥物處理完畢后收集上清，加入96孔板(每孔100 W)。將LDH反應(yīng)底物、酶、染色劑等量混合，取50 W加入樣品中。室溫孵育30分鐘后，加入15 W IN HCl終止反應(yīng)。在490 nM處全波長(zhǎng)分光光度計(jì)檢測(cè)，數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)品比較計(jì)算LDH含量。細(xì)胞給予不同藥物處理后，PBS溶液漂洗兩遍。更換新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基，加入終濃度為50 m的H2DCFDA ROS熒光探針，混勻。避光作用30分鐘后，撤除培養(yǎng)基并漂洗一次。加入預(yù)冷的PBS溶液刮取細(xì)胞，劇烈振蕩I分鐘。完全裂解后取200 W加入96孔板中，使用熒光酶標(biāo)儀，以吸收波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
離體研究發(fā)現(xiàn)，Met (I mM)顯著改善MPP+所致的細(xì)胞存活率降低(圖6)和LDH釋放增力口(與模型組比較P < 0.01，與對(duì)照組比較p > 0.05，圖7);Met (I mM)顯著抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和胞內(nèi)ROS生成增加(與模型組比較p < 0.01，圖8)。結(jié)果表明，二甲雙胍通過抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。權(quán)利要求
1.二甲雙胍在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了二甲雙胍在制備治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍顯著改善帕金森病模型小鼠的行為學(xué)障礙；減輕MPTP/p所致的小鼠中腦黑質(zhì)致密部(SNc)和腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA)多巴胺能(DA)神經(jīng)元丟失，改善紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的水平；抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖活化；抑制MPP+所致多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞存活率降低、乳酸脫氫酶(LDH)和活性氧簇(ROS)生成增加。結(jié)果表明二甲雙胍具有治療帕金森病的藥理作用。本發(fā)明的作用是將二甲雙胍作為活性成份用于制備治療帕金森病的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/155GK102743364SQ20121013154
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者丁建花, 喬晨, 孫紅彬, 胡剛, 蘇存錦, 魯明 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)