專利名稱：一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2及其在提高植物抗寒能力上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
低溫是植物生長過程中遇到的主要環(huán)境脅迫因子之一，每年因低溫寒害造成的各種農(nóng)作物損失高達(dá)數(shù)千億美元。葡萄是重要的經(jīng)濟(jì)型作物之一，它屬于低溫敏感型多年生落葉果樹，我國北方種植的葡萄每年因低溫寒害和倒春寒造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。植物對低溫的應(yīng)激是一個復(fù)雜的過程，包括低溫信號的感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等階段。植物體可以通過質(zhì)膜流動性的改變、質(zhì)膜上的鈣離子通透性通道、受體激酶和磷酸酯酶等感知低溫。鈣信使介導(dǎo)的信號途徑是低溫應(yīng)答過程中重要的信號途徑。在此途徑中，因低溫增加的胞質(zhì)鈣離子能被鈣離子依賴的蛋白激酶(calcium ion-dependent protein kinase, CDPK)、磷酸酶和有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 識別并傳導(dǎo)，最終啟動C重復(fù)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(C-i^peat binding transcription factors, CBF)等抗寒基因的表達(dá)，提高植物的抗低溫能力(Chinnusamy et al.，2006 Jan et al.， 2009)。當(dāng)植物經(jīng)過一段時間的零上低溫處理后，體內(nèi)發(fā)生一系列適應(yīng)低溫的形態(tài)和生理生化變化，使其抗寒能力得到增強(qiáng)，此過程被稱為低溫馴化。Guy等研究發(fā)現(xiàn)低溫馴化能誘導(dǎo)和增加一些基因的表達(dá)，使多種基因表達(dá)發(fā)生改變，這些基因表達(dá)的產(chǎn)物可分為兩類，一是調(diào)控蛋白，調(diào)控寒冷信號傳導(dǎo)、抗寒基因表達(dá)和抗寒蛋白活性；二是功能蛋白，與植物抗寒性的提高直接相關(guān)。研究報道表明，在低溫馴化過程中，植物體內(nèi)經(jīng)常伴隨著Ca2+水平的迅速升高(張國增等，2009)，逆境激素水平的變化(曲凌慧等，2009 ；王三根，2000)，活性氧的積累和保護(hù)酶系統(tǒng)活性的提高。目前植物響應(yīng)低溫脅迫及低溫馴化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究還剛起步，現(xiàn)已證明，1，4，5_三磷酸肌醇(1,4,5-trisphosphate, IP3)在低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中也起重要作用。磷酸肌醇代謝途徑中編碼肌醇多磷酸-1-磷酸酶的基因FRY 1如果發(fā)生缺失突變，則引起植物體內(nèi)IP3的積累，激活下游信號系統(tǒng)，誘導(dǎo)冷調(diào)節(jié)基因的表達(dá)(Chinnusamy and Zhu，2002)。多磷酸肌醇激酶基因/三磷酸肌醇3激酶基因(inositol polyphosphate kinase/inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase，IPK2/IP3K)磷酸化 IP3 成為 1，3，4， 5-四磷酸肌醇(inositol 1，3，4，5-tetrakisphosphate，IP4)和 1，3，4，5，6-五磷酸肌醇 (1,3,4, 5，6-pentaki sphosphate，IP5)，IP4能夠與IP3協(xié)同作用調(diào)節(jié)胞外鈣離子入膜和維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡(Xia et al.，2005)。因此，IPK2在通過協(xié)調(diào)IP3和IP4水平維持鈣離子穩(wěn)態(tài)過程中起關(guān)鍵作用，并參與了多種生理過程的調(diào)控。如，^iang等O007)研究發(fā)現(xiàn) AtIPK2參與生長素介導(dǎo)的擬南芥分枝過程。最近有研究報道，IPK2與植物對鹽脅迫等非生物逆境的應(yīng)答有關(guān)，在鹽脅迫下轉(zhuǎn)鹽芥ThIPK2植株的各種脅迫響應(yīng)標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄水平均上升(Yang et al.，2008)，證明ThIPK2具有提高植物抗干旱和耐低溫脅迫的能力(Zhu et al.，2009)。但目前尚未見到VvIPK2是否參與葡萄應(yīng)答低溫脅迫的報道。過氧化氫(hydrogen peroxi de，H2O2)是生物細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的一種活性氧， 又可作為一種重要的第二信使參與對生物和非生物脅迫的響應(yīng)及細(xì)胞程序性死亡等過程 (劉國華等，2009 ;Neill et al. ,2002 ；Laloi et al. ,2004 ；Cheng and Song, 2006) 近期，Yim等Q010)的研究表明H2O2參與水稻應(yīng)答低溫脅迫信號過程。在植物應(yīng)答低溫脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，H2A和VvIPK2兩者之間的具體關(guān)系以及他們在該途徑中的作用機(jī)制還知之甚少，因此，致力于研究VvIPK2是否參與葡萄應(yīng)答低溫脅迫、H2A和VvIPK2兩者之間的具體關(guān)系以及他們在該途徑中的作用機(jī)制對于提高植物的抗寒能力有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，及其在提高植物抗寒能力上的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，其具有序列表SEQ ID NO=I的堿基序列。一種葡萄多磷酸肌醇激酶，其具有序列表SEQ ID NO 1編碼的SEQ ID NO 2的氨基酸序列。重組載體，其含有所述的葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2。所述重組載體為pMD18-T-VvIH(2 質(zhì)?；?pCAMBIA2301_VvIPK2 質(zhì)粒。在克隆所述基因VvIPK2的特異性引物為VvIPK2-CDS-sense :5' -ATGCTTAAGGTCCCGGATCATC-3‘VvIPK2-CDS-antisense 5' -GCGTTATTCAGTGGTACCATTCTCC-3‘，本發(fā)明還提供了一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2在提高植物抗寒能力上的應(yīng)用。用所述pCAMBIA2301-VvIPK2質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因擬南芥。由于采用本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明以釀酒葡萄砧木品種‘F-242’試管苗為材料， 克隆了其多磷酸肌醇激酶(inositol polyphosphate kinase, IPK2)基因VvIPK2。試驗證明在低溫脅迫下，葡萄葉片VvIPK2表達(dá)量明顯升高，初步表明其參與了葡萄抗冷過程，并且成功將基因WIPK2轉(zhuǎn)入擬南芥，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高葡萄抗性提供理論和實驗依據(jù)。 本發(fā)明并通過試驗分析了 VvIPK2在低溫條件下的表達(dá)模式，測定了低溫脅迫下葡萄葉片內(nèi)源H2A含量的變化，并借助于藥理學(xué)試驗證明H2A位于VvIPK2上游發(fā)揮作用。本發(fā)明對于今后借助分子生物學(xué)、生物信息學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究兩種信號元件對冷調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響、轉(zhuǎn)錄譜的變化及蛋白水平的變化，對于深入探究植物響應(yīng)低溫脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義。


圖1表明本發(fā)明中VvIPK2基因的PCR擴(kuò)增(A)及酶切鑒定⑶圖譜，M :DL2000 DNA Maker ；N 陰性對照；S 試驗樣品。
圖2表明本發(fā)明中VvIPK2基因與其他物種IPK2基因的序列同源性分析㈧ 圖和進(jìn)化樹(B)圖，其中黑色表示完全相同的氨基酸殘基，灰色程度越淺氨基酸殘基保守性越低，擬南芥(Arabidopsis thaliana, GenBank accession No. AY147936)； 鹽芥(Thellungiella salsugine, GenBank accession No. EFl10977)；亞麻(Linum usitatissimum, EMBL accessionNo. AJ310150) ；/K禾S (Oryza sativa, DDBJ accessionNo. AP005749) ； I和II分別指示高度保守的IP3結(jié)合結(jié)構(gòu)域和ATP/Mg2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域。圖3表明本發(fā)明低溫對‘F-242，葉片中VvIPK2相對表達(dá)量的影響。圖4表明本發(fā)明中LY-294002對‘F-242，葉片S OD活性(A)以及Cu/Zn SOD(B) 基因表達(dá)、VvIH(2(C)基因表達(dá)的影響。圖5表明本發(fā)明中LY-294002對低溫條件下‘F_M2’葉片MDA含量(A)和細(xì)胞膜相對透性(B)的影響。圖6表明本發(fā)明中低溫脅迫對‘F142’葉片H2A含量的影響。圖7表明本發(fā)明中低溫下H2A對‘F-M2’葉片SOD活性(A)及Cu/Zn SOD基因表達(dá)量(C)的影響；及AsA對‘F142’葉片SOD活性⑶及Cu/Zn SOD基因表達(dá)量⑶的影響。圖8表明本發(fā)明中低溫下H2A (A)和AsA(B)對‘F_M2’葉片中MDA含量變化的影響。圖9表明本發(fā)明中低溫下H2A (A)和AsA(B)對‘F_M2’葉片中細(xì)胞膜相對透性的影響。圖10表明本發(fā)明中低溫下NADPH氧化酶活性的變化。圖11表明本發(fā)明中低溫下H2A和AsA對‘F-242，葉片VvIPK2相對表達(dá)量的影響。圖12表明本發(fā)明中低溫下LY-294002對‘F-M2，葉片H2A含量的影響。圖13是本發(fā)明中轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌陽性克隆酶切鑒定結(jié)果。
具體實施例方式通過參考附圖和下述實施例，將有助于本發(fā)明更詳細(xì)的說明。下述實施例中所使用的方法均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。本發(fā)明所用的材料為葡萄砧木品種‘F-M2’試管苗，它由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物逆境生理與分子生物學(xué)實驗室培養(yǎng)并保存。將‘F-M2’試管苗置于25士 1°C培養(yǎng)室中；12h光照/12h黑暗；光照強(qiáng)度200 μ mol ·πΓ2 · s—1下培養(yǎng)。每3_4周將試管苗繼代到新鮮的生根培養(yǎng)基(MS+0. 05mg · Γ1 NAA)上繼代繁殖培養(yǎng)，備用。實施例1、測定低溫對‘F-M2’葉片中VvIPK2相對表達(dá)量的影響1、克隆 VvIPK2 基因采用同源克隆的方法，以擬南芥多磷酸肌醇激酶基因AtIPK2i3 (AT5G61760)CDS 進(jìn)行WU-BLAST序列比對，檢索到葡萄中多磷酸肌醇激酶基因同源序列，DNAstar軟件包分析其開放閱讀框(open reading frame，0RF)，并以之為模板設(shè)計特異性引物VvIPK2-CDS-sense :5' -ATGCTTAAGGTCCCGGATCATC-3 ‘(如 SEQ ID No :3 所示)；VvIPK2-CDS-antisense 5' -GCGTTATTCAGTGGTACCATTCTCC-3‘，(如 SEQ ID No 4所示)由上海生工生物工程有限公司合成。 用CTAB法提取葡萄總RNA，大連寶生物公司RNA LA PCR Kit(AMV)Ver. 1. 1試劑盒反轉(zhuǎn)錄PCR。根據(jù)試劑盒要求，第一步反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)的條件是3(TC，10min，42°C， 30min,99°C,5min,5°C,5mino第一步反應(yīng)產(chǎn)物作為第二步反應(yīng)的模板。第二步PCR條件為 940C 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C延伸 10min，4°C保存。用北京博
邁德試劑盒回收目的片段，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小。第一步反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VVIPK2，其具有序列表SEQ ID NO :1的堿基序列。
2.一種葡萄多磷酸肌醇激酶，其具有序列表SEQ ID NO :1編碼的SEQ ID NO :2的氨基酸序列。
3.重組載體，其含有權(quán)利要求1所述的葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pMD18-T-VvIPK2質(zhì)?；?pCAMBIA2301-VvIPK2 質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，其特征在于克隆所述基因VvIPK2的特異性引物為VvIPK2-CDS-sense 5' -ATGCTTAAGGTCCCGGATCATC-3‘VvIPK2-CDS-antisense 5' -GCGTTATTCAGTGGTACCATTCTCC-3‘，
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1、3、4或5所述的葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2在提高植物抗寒能力上的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2在提高植物抗寒能力上的應(yīng)用，其特征在于用所述pCAMBIA2301-VvIPK2質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2在提高植物抗寒能力上的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種葡萄多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，它具有序列表SEQ ID NO1的序列，還提供了具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的葡萄多磷酸肌醇激酶。本發(fā)明克隆了釀酒葡萄砧木品種‘F-242’試管苗的多磷酸肌醇激酶基因VvIPK2，本發(fā)明通過試驗證明葡萄葉片VvIPK2參與了葡萄抗冷過程，并將基因VvIPK2轉(zhuǎn)入擬南芥中，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高葡萄抗性提供理論依據(jù)。本發(fā)明證明H2O2位于VvIPK2上游發(fā)揮作用。本發(fā)明對于今后借助分子生物學(xué)、生物信息學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究兩種信號元件對冷調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響、轉(zhuǎn)錄譜的變化及蛋白水平的變化，對于深入探究植物響應(yīng)低溫脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義。
文檔編號A01H5/00GK102161997SQ201110046648
公開日2011年8月24日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月18日
發(fā)明者侯麗霞, 劉新, 李希東, 趙方貴, 車永梅 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)