專利名稱：一種優(yōu)化的涂抹除草劑篩選轉(zhuǎn)基因作物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體地是一種優(yōu)化的涂抹除草劑篩選轉(zhuǎn)基因作物的方法。
背景技術(shù)：
將人工分離或修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組上，由于外源基因的表達使生物體的性狀發(fā)生可遺傳的改變，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展打破了物種隔離，能夠?qū)⒕哂袃?yōu)良性狀的目的基因?qū)氲街参锘蚪M中，從而使得許多植物的遺傳性狀得到改良。在轉(zhuǎn)基因的操作過程中，只有少數(shù)外源的DNA能夠轉(zhuǎn)入到植物細胞內(nèi)，進一步整合到植物基因組DNA上，還有大多數(shù)的植物細胞是沒有被外源DNA轉(zhuǎn)染，如何剔除這些未轉(zhuǎn)基因的植物細胞是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心問題之一。目前一般利用選擇標(biāo)記基因輔助目的轉(zhuǎn)基因的篩選。在目的基因轉(zhuǎn)化時引入選擇標(biāo)記基因，賦予受體植物特定的篩選標(biāo)記，以便于在數(shù)目龐大的植物轉(zhuǎn)化后代中簡便快速地篩選得到轉(zhuǎn)基因陽性植株。抗生素是現(xiàn)在廣泛使用的一種選擇標(biāo)記。大多數(shù)抗生素抗性基因作為植物篩選的標(biāo)記基因，最常使用的有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NptII)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因， 前者基因編碼的酶使其轉(zhuǎn)基因植物具有卡那霉素和新霉素抗性，而后者基因編碼的酶則賦予轉(zhuǎn)化受體潮霉素抗性。雖然抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記基因有篩選方便和轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，但是這些抗性抗生素抗性如果轉(zhuǎn)移到微生物特別是病原菌里，將使病原菌產(chǎn)生抗生素抗性，對人類的健康產(chǎn)生安全隱患。另一方面，抗生素的價格昂貴，作為大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)來說成本太高。這兩方面的因素決定了抗生素抗性基因在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化篩選方面的應(yīng)用受到限制。除草劑是近幾年發(fā)展起來的一種篩選標(biāo)記，最常用的除草劑是草甘膦和草丁膦?？钩輨┗虿粌H作為篩選標(biāo)記基因還是一種目的基因，利用除草劑作為篩選劑使轉(zhuǎn)基因作物在具有目標(biāo)性狀的同時還能具有除草劑抗性。另一方面，除草劑的價格便宜，可以大大降低轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化的成本。但是除草劑作為一種新興的篩選標(biāo)記， 其操作體系尚不成熟。大田使用除草劑一般用噴灑的方式來殺死雜草，這是一種高選擇壓的使用方式，對于TO代轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選顯然不合適。因為過高的選擇壓可能殺死一些轉(zhuǎn)基因陽性苗。另一方面，目前許多農(nóng)作物轉(zhuǎn)化用的活體轉(zhuǎn)基因技術(shù)，TO代為嵌合體，噴灑法會殺死絕大多數(shù)的TO代植株，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的失敗。因此，摸索一套切實可行的篩選方法對于除草劑選擇標(biāo)記的推廣使用具有比較重要的實際應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化的涂抹除草劑篩選轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括以下步驟
(a)在TO代轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的新生的第3飛葉片上，用marker筆標(biāo)記直徑約Icm的圓圈。(b)用移液器吸取2ul的除草劑溶液點在圓圈的中心。
(c)5 7天后，經(jīng)除草劑處理的有一片或以上葉片表現(xiàn)正常的植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株。 (d)將上述篩選得到的轉(zhuǎn)基因陽性植株移栽到大棚里，收種。本發(fā)明中TO代轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物是指用植物活體為受體，將攜帶除草劑基因或者攜帶除草劑選擇標(biāo)記基因的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)作物得到的TO代轉(zhuǎn)基因植株。以植物活體為外植體轉(zhuǎn)化得到的TO代轉(zhuǎn)基因植株為嵌合體，常規(guī)的除草劑噴灑篩選方法會把嵌合體殺死， 發(fā)明人大量的實驗結(jié)果證明本發(fā)明提供的涂抹篩選方法能夠高效、簡便地篩選得到TO代轉(zhuǎn)基因陽性植株。在除草劑篩選過程中，為了使除草劑溶液均勻附著在作物葉片的表面，本發(fā)明人在除草劑溶液中添加了表面活性劑，通過實驗證明在除草劑制劑按照比例稀釋在0. 02%的 silwet-L77水溶液中篩選效果最好。本發(fā)明中所述的除草劑是任一可以作為植物篩選標(biāo)記的除草劑，優(yōu)選為草甘膦和草丁膦。本發(fā)明中所述的作物為大豆、小麥、玉米、水稻或高粱的野生或栽培品種、品系、育種材料或中間材料。為了便于理解，下面將結(jié)合附圖和實施例進一步詮釋本發(fā)明。具體實例和附圖僅是為了更好的闡述本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1為TO代轉(zhuǎn)基因大豆草胺磷涂抹實驗篩選結(jié)果示圖，其中A圖為野生型，B圖為轉(zhuǎn)基因陽性植株。紅色圓圈為草胺磷涂抹的葉片部位。圖2為TO代轉(zhuǎn)基因大豆的PCR檢測結(jié)果，其中泳道M為marker，+是以質(zhì)粒為模板的正對照，-為野生型負對照，1 5為檢測的5個轉(zhuǎn)基因株系。圖3為TO代轉(zhuǎn)基因棉花草胺磷涂抹實驗篩選結(jié)果示圖，其中A圖為野生型，B圖為轉(zhuǎn)基因陽性植株。圖4為TO代轉(zhuǎn)基因棉花的PCR檢測結(jié)果，其中泳道M為marker，+是以質(zhì)粒為模板的正對照，-為野生型負對照，1 9為檢測的9個轉(zhuǎn)基因株系。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001， NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。實施例一、涂抹法篩選轉(zhuǎn)基因大豆 1.實驗材料
質(zhì)粒含有bar基因，帶有潮霉素篩選標(biāo)記基因的pCAMBIA1300-bar載體，具有抗草銨磷除草劑。PCR擴增bar基因連接到pCAMBIA1300 (購自Invitrogen公司)載體上得到 pCAMBIA1300-bar 載體。
農(nóng)桿菌菌株AGLO。供轉(zhuǎn)化的大豆品種黑農(nóng)37號，華疆4號。農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
挑取甘油凍存的含有目的基因的農(nóng)桿菌，于YEB平板上畫線，觀で黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 天。挑取單菌落接種于40ml抗性YEB液體培養(yǎng)基中，觀で黑暗搖床200rpm搖過夜，至 0D600 1。吸取上述培養(yǎng)物250 300 ill涂布于平板直徑為15cm的YEB固體培養(yǎng)基上， 觀で黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天后，此備用的新鮮平板當(dāng)天使用，約20°C室溫黑暗待用，不要繼續(xù) 存留于觀で黑暗培養(yǎng)箱或轉(zhuǎn)存于4°C冰箱。滲透培養(yǎng)基的制備
首先按照下述配方配制AA培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制(IL)
MgS040.12209g
KCl2.95g
NaH2P04*2H20 0. 15g 肌醇0. Ig
谷氨酸0.876g
天門冬氨酸 0. 266g 精氨酸0. 174g
酪蛋白水解物 0. 3g 蔗糖20g
鐵鹽溶液5ml ① EDTA-2Na 7. 46g/L 調(diào) pH=8. 0
②再加4. 5ml/L 5M NaCl
③FeS04*7H20 5.56g/L
CaCl2 溶液4. 5ml25.06g/L
VBl 溶液IOmllg/L
VB6 溶液Imllg/L
畑酸溶液Iml0. lg/L
B5 微量ImlMnS04*H20 7. 58g/L
ZnS04.7H20 2. Og/L H3B033. Og/L
KI0.75g/L
Na2Mo04*2H20 0. 25g/L CuS04*5H20 0.025g/L CoC12.6H20 0.025g/L
在IL AA培養(yǎng)基中添加下列成分
As (100 200 ii M )； KT (0. 2mg)； 2，4_D (Img)5DTT (ImM )； L-Cysteine (200 400mg) ；silwet-L77 (100 400 ぬ)。
將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌用上述滲透培養(yǎng)基懸浮，使懸浮菌液的0D600值為0. 4 0. 7，pH至 5. 0 5. 5，轉(zhuǎn)化滲透培養(yǎng)液制備完畢。
大豆的轉(zhuǎn)化實驗
利用上述制備好的滲透培養(yǎng)基侵染大豆幼苗，然后移栽到大棚進行培養(yǎng)。代轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選以及獲得
上述轉(zhuǎn)化大豆得到的TO代轉(zhuǎn)基因植株為嵌合體，植株的部分器官含有目的表達，具有目標(biāo)表型。因載體含有目的基因bar，如果轉(zhuǎn)基因成功，bar插入大豆基因組，使轉(zhuǎn)基因陽性植株的部分器官具有草銨磷抗性。所以，我們通過草胺磷檢測實施例一中的轉(zhuǎn)基因大豆的葉片來篩選TO代陽性轉(zhuǎn)基因植株。大豆的葉片為三生復(fù)葉，選取復(fù)葉的中間小葉片， 用Mark筆標(biāo)記一個圓圈，用移液器滴加2μ1草銨磷溶液(Basta 100mg/L + silwet-L77 200yl/L)在圓圈中間，5-6天后不具抗性的植株表現(xiàn)萎蔫、枯黃等明顯的藥害反應(yīng)。用上述方法涂抹大豆的第一片直到第五片復(fù)葉。五片復(fù)葉均表現(xiàn)草銨磷藥害反應(yīng)的，認定為轉(zhuǎn)基因陰性植株，有一片及以上葉片表現(xiàn)草胺磷抗性的，認定為轉(zhuǎn)基因陽性植株(圖1)。我們利用涂抹法篩選得到220株TO代陽性植株代轉(zhuǎn)基因苗的PCR檢測
對TO代草胺磷篩選的抗性植株，進行PCR檢測實驗進一步驗證轉(zhuǎn)基因是否成功。轉(zhuǎn)基因陽性植株因成功轉(zhuǎn)化bar基因而表現(xiàn)草胺磷抗性。根據(jù)bar基因的序列，設(shè)計PCR擴增引物，進一步驗證轉(zhuǎn)基因株系的陽性。每株取一片新展開的葉片，CTAB法提取植物基因組 DNA。取IOpg的基因組DNA進行PCR反應(yīng)。根據(jù)bar基因的序列，PCR擴增引物序列如下 引物 1 (上游)5' TCATCAGATTTCGGTGACGG 3' 引物 2 (下游)5' TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3'
分別利用引物1和引物2，以抗性植株基因組DNA模板，擴增bar基因片段。擴增體系和程序為
IOX Buffer 2ul ；
IOmM dNTP 0.5ul ；
IOuM 引物 1 0. 5ul;
IOuM 引物 2 0. 5ul;
genomic DNA IOpg ；
Taq DNA Polymerase(5U/ul) 0.4ul ； ddH20 補足20ul。反應(yīng)條件為 預(yù)變性95°C， 5min ； 變性 94°C， 20sec ； 退火 55°C, 30sec ； 延伸 72°C， Imin ； 30個循環(huán)；
再延伸72°C，IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以檢測到450bp的目的片段(結(jié)果見圖2)。我們對5個株系進行了 PCR實驗，結(jié)果全部呈陽性。這進一步證明了我們獲得的抗性植株為轉(zhuǎn)基因陽性株系。實施例二、涂抹法篩選轉(zhuǎn)基因棉花1. 棉花的轉(zhuǎn)化實驗
按照實施例一中廣3所示的方法制備含有pCAMBIA1300-bar的滲透培養(yǎng)基， 轉(zhuǎn)化棉花，然后移栽到大棚進行培養(yǎng)。

棉花TO代轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選以及獲得
上述轉(zhuǎn)化棉花得到的TO 代轉(zhuǎn)基因植株為嵌合體，植株的部分器官含有目的表達，具有目標(biāo)表型。因載體含有目的基因bar，如果轉(zhuǎn)基因成功，bar插入棉花基因組，使轉(zhuǎn)基因陽性植株的部分器官具有草銨磷抗性。所以，我們通過草胺磷檢測實施例一中的轉(zhuǎn)基因棉花的葉片來篩選TO代陽性轉(zhuǎn)基因植株。選取已轉(zhuǎn)化的棉花的新生葉片，用Mark筆標(biāo)記一個圓圈，用移液器滴加2μ1草銨磷溶液(Basta 100mg/L + silwet-L77 200yl/L)在圓圈中間，5-6天后不具抗性的植株表現(xiàn)萎蔫、枯黃等明顯的藥害反應(yīng)。用上述方法涂抹棉花的第 3片直到第5片新葉。2片新葉均表現(xiàn)草銨磷藥害反應(yīng)的，認定為轉(zhuǎn)基因陰性植株，有一片及以上葉片表現(xiàn)草胺磷抗性的，認定為轉(zhuǎn)基因陽性植株(圖3)。我們利用涂抹法篩選得到 120株TO代陽性植株。代轉(zhuǎn)基因棉花的PCR檢測
對TO代草胺磷篩選的抗性植株，進行PCR檢測實驗進一步驗證轉(zhuǎn)基因是否成功。 轉(zhuǎn)基因陽性植株因成功轉(zhuǎn)化bar基因而表現(xiàn)草胺磷抗性。每株取一片新展開的葉片，CTAB 法提取植物基因組DNA。取IOpg的基因組DNA按照實施例一中步驟6所述的方法進行PCR 反應(yīng)。我們對9個株系進行了 PCR實驗，結(jié)果全部呈陽性(圖4)。
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)化的涂抹除草劑篩選轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括以下步驟(a)在TO代轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的新生的第3飛葉片上，用marker筆標(biāo)記直徑約Icm的圓圈；(b)用移液器吸取2ul的除草劑溶液點在圓圈的中心；(c)5^7天后，經(jīng)除草劑處理的有一片或以上葉片表現(xiàn)正常的植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株；(d)將上述篩選得到的轉(zhuǎn)基因陽性植株移栽到大棚里，收種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂抹除草劑篩選轉(zhuǎn)基因作物的方法，其特征在于所述TO代轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物是指以植物活體為受體，將攜帶除草劑基因或者攜帶除草劑選擇標(biāo)記基因的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)作物得到的TO代轉(zhuǎn)基因植株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂抹除草劑篩選轉(zhuǎn)基因作物的方法，其特征在于所述除草劑溶液是除草劑制劑按照比例稀釋在0. 02%的silwet-L77水溶液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求廣3所述的任一權(quán)利要求，其特征在于所述的除草劑為可用于轉(zhuǎn)基因植物篩選的除草劑，優(yōu)選為草甘膦和草丁膦。
5.根據(jù)權(quán)利要求廣3所述的任一權(quán)利要求，其特征在于所述的農(nóng)作物為大豆、棉花、小麥、玉米、水稻或高粱的野生或栽培品種、品系、育種材料或中間材料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的涂抹除草劑篩選轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括(a)在T0代轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的新生的第3~5葉片上，用marker筆標(biāo)記直徑約1cm的圓圈；(b)用移液器吸取2ul的除草劑溶液點在圓圈的中心；(c)5~7天后，經(jīng)除草劑處理的有一片或以上葉片表現(xiàn)正常的植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株；(d)將上述篩選得到的轉(zhuǎn)基因陽性植株移栽到大棚里，收種。本發(fā)明提供的涂抹篩選方法能夠高效、簡便地篩選得到T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株，對于轉(zhuǎn)基因作物的篩選具有重要的意義。
文檔編號A01H1/04GK102308748SQ20111010195
公開日2012年1月11日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者何峰, 夏勉, 張斌, 王偉娜 申請人:北京未名凱拓作物設(shè)計中心有限公司