抗除草劑基因OsmALS的HRM檢測(cè)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因 OsmALS基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸是植物體內(nèi)必不可少的物質(zhì)，他除了在植物的蛋白質(zhì)合成中起作用外，在 初級(jí)和次生代謝中也發(fā)揮著重要的功能。若植物的氨基酸合成受阻，將導(dǎo)致植物代謝紊 舌L從而使植物生長(zhǎng)嚴(yán)重受損甚至死亡，所以植物的氨基酸合成中的關(guān)鍵酶一直是除草 劑研發(fā)的熱點(diǎn)。乙酰乳酸合成酶（acetolactatesynthase,ALS),也稱乙酰輕酸合成酶 (acetohydroxyacidsynthase,AHAS),是支鏈氨基酸合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶。在纈j氨酸和亮 氨酸的合成中催化二分子丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在異亮氨酸的合成中催化一分 子丙酮酸與一分子丁酮酸生成2-乙醛基-2-羥基丁酸和二氧化碳。若ALS活性受到抑制， 將造成支鏈氨基酸合成受阻，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成及植物生長(zhǎng)。
[0003] 近些年來，以ALS作為靶標(biāo)已成為進(jìn)行分子設(shè)計(jì)、開發(fā)超高效除草劑品種的重要 領(lǐng)域，現(xiàn)已開發(fā)出的ALS抑制劑類除草劑有5大類50余種：磺酰脲類（Sulfonylureas,SU)、 咪唑啉酮類（imidazolinones,IMI)、三唑啼陡類（triazolopyrimidines，TP)、啼陡水楊酸 類（pyrimidinylthio-benzoates,PTB)、石黃酉先胺類（sulfonylamino-carbonyl-triazolino nes，SCT)。這些ALS抑制劑類除草劑具有選擇性強(qiáng)、殺草譜廣、低毒高效等特點(diǎn)，其中具有代 表性的是咪唑啉酮類除草劑。此類除草劑主要應(yīng)用于大豆等豆科作物的重要品種，對(duì)玉米、 小麥、水稻等禾本科作物的重要品種無選擇性，并且在使用中，由于其土壤的長(zhǎng)殘留往往造 成后茬多種作物受害。隨著抗性作物的選育成功，這個(gè)問題得到了解決。目前，已將抗性作 物與咪唑啉酮類除草劑使用組成一種"Clearfield生產(chǎn)體系"，即種植抗咪唑啉酮作物并使 用咪唑啉酮類除草劑來防治其他除草劑所不能防治的某些特殊雜草，如抗咪唑啉酮水稻田 的赤稻、油菜田的野油菜與其它十字花科雜草等。
[0004] 獲得ALS抗除草劑突變體材料后，通過雜交、回交等常規(guī)育種方法，可將該抗除草 劑新品系的抗性基因?qū)肫渌鼘?duì)咪唑啉酮類除草劑無抗性的水稻品種或品系，提高導(dǎo)入目 標(biāo)品種或品系對(duì)咪唑啉酮類除草劑的耐受性。若將抗性基因?qū)牖謴?fù)系后，F(xiàn)1真雜種便具 有抗咪唑啉酮類除草劑特性，通過噴施除草劑可將各種類型的假雜種一次性全部殺死，提 高了制種效率和種子純度。但是抗性性狀為顯性性狀，F(xiàn)1代表現(xiàn)為咪唑啉酮抗性，從F2代 開始分離，在田間選育中需要開始每代噴施除草劑進(jìn)行鑒定，如果除草劑劑量使用不當(dāng)或 噴施不均勻極可能導(dǎo)致誤選或所需要的材料死亡。另外，在抗除草劑基因研究過程中有時(shí) 需要保存不抗的材料，用作比較研究。為此，若能找到與抗性基因共顯性的分子標(biāo)記，從而 進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，區(qū)分出育種材料中抗性基因的不同基因型，則可指導(dǎo)田間選育，加快育 種進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了能更簡(jiǎn)便、更快速有效地檢測(cè)出水稻材料中是否含有抗咪唑啉酮類除草劑基 因OsmALS突變體，并將其應(yīng)用到抗性育種過程中，本發(fā)明提供了一種基于HRM技術(shù)，用于檢 測(cè)水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS的第548位氨基酸突變的方法，所述OsmALS基因 的第548位氨基酸突變包括但不限于由Trp突變?yōu)镃ys或Met，或是在該位置發(fā)生堿基的取 代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸。所述的突變可以是點(diǎn)突變，也可以是DNA缺失或插入突 變。所述突變可以通過化學(xué)誘變或基因定點(diǎn)突變的方式獲得，化學(xué)誘變的方法包括用EMS 等誘變劑處理所導(dǎo)致的誘變；基因定點(diǎn)突變的方法包括但不限于ZFN定點(diǎn)突變方法、TALEN 定點(diǎn)突變方法、和/或CRISPR/Cas9等定點(diǎn)突變方法。對(duì)該位點(diǎn)堿基突變檢測(cè)方法的開發(fā)， 可以提高該基因在分子標(biāo)記輔助選擇育種，基因聚合育種，以及轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用的效率。
[0006] 具體地，上述水稻OsALS基因的第548位氨基酸由Trp (TGG)突變?yōu)镸et(ATG)的 點(diǎn)突變，該點(diǎn)突變后的OsmALS基因的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。通過設(shè)計(jì)特定的檢測(cè)引物，檢測(cè)候選材料中該位置的堿基存在狀態(tài)，具體通過 分析其HRM溶解曲線從而了解植株內(nèi)源是否含有該突變，及所述突變?yōu)榧兒线€是雜合狀態(tài) 的一種檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明通過多輪實(shí)驗(yàn)，還優(yōu)化出了一對(duì)用于OsmALS的第548位突變的HRM檢測(cè)的 特定引物，所述引物編號(hào)及序列是：ALS-22415F:5' -AAGTATGTATGCGCCCT-3' ；ALS-22494R: 5' -GTGTTGAACAACCAACA-3'。
[0008] 本發(fā)明HRM檢測(cè)方法采用10μL反應(yīng)體系，包含1μLPCR模板，0. 5UrTaqDNA 聚合酶（Takara，Japan)，lXPCR緩沖液（含Mg2+)，250yMdNTP，0.ΙμΜ正向和反向引物 和 0· 1μL20XEvaGreen熒光染料（Biotium，USA)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C3min;94°C30s， 58°C30s，72°C10s，40 個(gè)循環(huán)；72°C5min，緊接著 95°C變性lmin，25°C復(fù)性lmin。為了防 止蒸發(fā)，體系務(wù)必滴加15μL礦物油覆蓋。
[0009] 本發(fā)明所提供的HRM檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)步驟是：a)提取待測(cè)樣本DNA;b)配制包含 待測(cè)樣本DNA、引物對(duì)和EvaGreen熒光染料的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增；和c)對(duì)PCR產(chǎn) 物進(jìn)行HRM分析掃描。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種提取植物細(xì)胞、組織、或器官中基因組DNA的方法，所述方法 包括：取適量植物細(xì)胞、組織或器官等材料，直接加提取液（10mMTris-HCl、0. 5mMEDTA、 0. 15MKC1)研磨，沸水浴10min后，靜置分層取上清，即獲得其基因組DNA，可作為HRM檢測(cè) 中的PCR模板。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種基于HRM技術(shù)的水稻OsmALS基因第548位突變檢測(cè)PCR試 劑盒，其特征在于所述試劑盒包含引物對(duì)：正向引物：AAGTATGTATGCGCCCT(SEQIDN0:3); 和反向引物：GTGTTGAACAACCAACA(SEQIDN0:4)，用于檢測(cè)ALS的Trp548Met突變。
[0012] 更具體的，本發(fā)明所提供的試劑盒進(jìn)一步包含PCR試劑和熒光染料。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒的使用方法，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟： 提取待測(cè)樣本DNA;配制包含待測(cè)樣本DNA、引物對(duì)、PCR試劑盒和EvaGreen熒光染料的PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增；和對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析掃描。
[0014] 具體地，本發(fā)明所述的檢測(cè)水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS基因第548位 點(diǎn)突變分子標(biāo)記的方法如下：通過使用引物對(duì)ALS-22415F和ALS-22494R對(duì)待檢測(cè)材料的 基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用LightScanner96等高分辨率熔解曲線分析儀器對(duì)前述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線采集后，所獲得的與陽性對(duì)照水稻抗咪唑啉酮類除草劑基 因OsmALS呈一致的特異性峰型高分辨率熔解曲線，即可確定該材料具有水稻ALS基因的第 548位突變。
[0015] 所述引物對(duì)ALS-22415F和ALS-22494R的核苷酸序列如下所示：
[0016] ALS-22415F :5'-AAGTATGTATGCGCCCT-3'（SEQ ID N0:3);
[0017] ALS-22494R :5' -GTGTTGAACAACCAACA-3'（SEQ ID N0:4);
[0018] 所述的與水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS呈特異性峰型的高分辨率熔解曲 線具體如圖2的紅色曲線所示；在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，只需所檢測(cè)樣品的高分辨率熔解曲線與水 稻非轉(zhuǎn)基因抗除草劑材料D3-10的高分辨率熔解曲線一致即可；
[0019] 所述的水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS基因的第548位突變的HRM檢測(cè)方 法的開發(fā)，包括以下步驟：
[0020](1)通過多序列比對(duì)軟件工具（如DNAMAN)，對(duì)野生型黃華占ALS基因（L0C_ 0s02g0510200)與水稻非轉(zhuǎn)基因抗除草劑材料的OsmALS基因（的編碼區(qū)第548位氨基酸對(duì) 應(yīng)的核苷酸進(jìn)行比對(duì)分析，篩查OsmALS基因的第548位氨基酸突變情況；
[0021] (2)利用步驟⑴獲得的SNP信息，在該SNP上游36bp處設(shè)計(jì)基因特異性上游引 物，在該SNP下游44bp處設(shè)計(jì)基因特異性下游引物，引物對(duì)堿基序列如下：
[0022] ALS-22415F :5'-AAGTATGTATGCGCCCT-3'（SEQ ID N0:3);
[0023] ALS-22494R :5' -GTGTTGAACAACCAACA-3'（SEQ ID N0:4);
[0024] (3)以攜帶有水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS的咪唑啉酮類除草劑抗性材 料的總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲得的PCR產(chǎn)物用LightScanner96等高分辨率熔解 曲線分析儀器進(jìn)行高分辨率熔解曲線采集后，得到與水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS 呈特異性峰型的高分辨率熔解曲線，即為水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS基因第548 位突變特異性分子標(biāo)記；
[0025] 所述的水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS基因特異性分子標(biāo)記548突變?cè)阼b 別水稻材料咪唑啉酮類除草劑抗性基因的應(yīng)用，特別適合